一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体地，涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamidemononuclotide，β-NMN或NMN)是NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅)最直接的前体，NAD+是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质β-NMN的研究发现，食用β-NMN可以有效提升体内NAD的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-NMN成为了在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。

传统的体外制备β-NMN的方法为化学合成法(ChemCommun.1999；(8)：29-730)，该方法具有操作复杂、反应步骤多、中间产物多、得率低、产品纯化困难等缺点，导致产品纯度低，而且采用化学合成法制备β-烟酰胺单核苷酸时需要用到危险化学品和大量的有机溶剂，这就严重破坏了环境。

因此，生物合成法就显得环保很多，例如申请号为201811606780.9的中国专利公开了一种采用烟酰胺磷酸核糖转移酶制备NMN的方法，该方法以烟酰胺为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下合成β-烟酰胺单核苷酸。此种方式，使用到相对昂贵的烟酰胺核糖或烟酰胺、磷酸核糖和ATP，导致生产成本仍然较高，限制了β-NMN工厂化大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法，具体包括以下步骤：

S1、将pH值为7-8的水相缓冲液加入到反应容器中，添加底物β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的制剂，混合均匀；

S2、在30℃-40℃条件下，反应40-50min，得到反应液；

S3、对反应液进行提纯处理，获得β-烟酰胺单核苷酸。

进一步地，所述水相缓冲液为含有MgCl

进一步地，所述制剂包括纯化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶和/或含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的重组细胞，所述重组细胞为微生物细胞。

进一步地，所述微生物细胞为大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

进一步地，提纯处理过程为：用盐酸将反应液的pH值调节至2.5-3.0，然后流经装有强碱性阴离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液用氢氧化钠水溶液调节pH值至7.5-8.0，再流经装有强酸性阳离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液进行纳滤，得到脱盐的β-烟酰胺单核苷酸水溶液，进行析晶和干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸。

进一步地，所述的盐酸浓度为2mol/L。

进一步地，所述强碱性阴离子交换树脂为D202树脂，所述强酸性阳离子交换树脂为D001树脂。

进一步地，所述氢氧化钠水溶液浓度为1mol/L。

本发明的有益效果：

本发明利用酶工程技术生产β-烟酰胺单核苷酸，简化了生产步骤，显著提高了生产效率，降低了生产成本。

本发明通过先后以不同类型的树脂柱对反应液进行过柱纯化，能够有效降低产物中的无机盐，从而提升产品的质量以及纯度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法，具体包括以下步骤：

S1、将pH值为78的水相缓冲液加入到反应容器中，添加底物β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的制剂，混合均匀；

S2、在30℃条件下，反应40min，得到反应液；

S3、对反应液进行提纯处理，获得β-烟酰胺单核苷酸。

所述水相缓冲液为含有MgCl

所述制剂包括纯化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶和/或含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的重组细胞，所述重组细胞为微生物细胞。

所述微生物细胞为大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

提纯处理过程为：用盐酸将反应液的pH值调节至2.5，然后流经装有强碱性阴离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液用氢氧化钠水溶液调节pH值至7.5，再流经装有强酸性阳离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液进行纳滤，得到脱盐的β-烟酰胺单核苷酸水溶液，进行析晶和干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸。

所述的盐酸浓度为2mol/L。

所述强碱性阴离子交换树脂为D202树脂，所述强酸性阳离子交换树脂为D001树脂。

所述氢氧化钠水溶液浓度为1mol/L。

实施例2

一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法，具体包括以下步骤：

S1、将pH值为7.5的水相缓冲液加入到反应容器中，添加底物β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的制剂，混合均匀；

S2、在35℃条件下，反应45min，得到反应液；

S3、对反应液进行提纯处理，获得β-烟酰胺单核苷酸。

所述水相缓冲液为含有MgCl

所述制剂包括纯化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶和/或含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的重组细胞，所述重组细胞为微生物细胞。

所述微生物细胞为大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

提纯处理过程为：用盐酸将反应液的pH值调节至2.8，然后流经装有强碱性阴离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液用氢氧化钠水溶液调节pH值至7.8，再流经装有强酸性阳离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液进行纳滤，得到脱盐的β-烟酰胺单核苷酸水溶液，进行析晶和干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸。

所述的盐酸浓度为2mol/L。

所述强碱性阴离子交换树脂为D202树脂，所述强酸性阳离子交换树脂为D001树脂。

所述氢氧化钠水溶液浓度为1mol/L。

实施例3

一种β-烟酰胺单核苷酸的合成方法，具体包括以下步骤：

S1、将pH值为8的水相缓冲液加入到反应容器中，添加底物β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的制剂，混合均匀；

S2、在40℃条件下，反应50min，得到反应液；

S3、对反应液进行提纯处理，获得β-烟酰胺单核苷酸。

所述水相缓冲液为含有MgCl

所述制剂包括纯化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶和/或含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸酶的重组细胞，所述重组细胞为微生物细胞。

所述微生物细胞为大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

提纯处理过程为：用盐酸将反应液的pH值调节至3.0，然后流经装有强碱性阴离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液用氢氧化钠水溶液调节pH值至8.0，再流经装有强酸性阳离子交换树脂的分离柱，用水洗脱，得到的流出液进行纳滤，得到脱盐的β-烟酰胺单核苷酸水溶液，进行析晶和干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸。

所述的盐酸浓度为2mol/L。

所述强碱性阴离子交换树脂为D202树脂，所述强酸性阳离子交换树脂为D001树脂。

所述氢氧化钠水溶液浓度为1mol/L。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。