一种橙皮素及其衍生物产品在制备抗新型冠状病毒感染性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种橙皮素及其衍生物产品在制备抗新型冠状病毒感染性疾病的药物中的应用。

背景技术

新冠肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的传染性疾病。新型冠状病毒为β属冠状病毒，潜伏期1～14天，多为3～7天。新冠肺炎以发热、干咳、乏力为主要表现，重症患者多出现呼吸困难或低血氧症。新型冠状病毒主要侵犯肺脏，导致肺泡浆液、纤维蛋白性渗出物及透明膜形成，又会造成肺泡隔血管充血、水肿，引起肺组织灶性出血、坏死，患者随病势发展可见肺支气管腔内大量充斥粘液，阻碍正常呼吸；也会侵犯脾脏、淋巴结、骨髓、心脏、血管、肝脏、胆囊、肾脏等其他器官。该病可以通过呼吸道飞沫和密切接触传播，也存在气溶胶传播的可能性。当前全球新冠肺炎的防疫形势依然非常严峻。截至2021年9月26日，新冠肺炎全球确诊病例已超过2.3亿，感染死亡人数超过475万，是全球性的大流行病。然而，目前尚无特效的抗病毒药物用于COVID-19的治疗，且该病至今仍在全球范围内肆虐，而临床仍以对症治疗为主，存在传染率高、传染范围广、治疗困难等诸多问题。因此，研究并开发有效的抗SARS-CoV-2感染的药物具有重要意义。

橙皮素(hesperetin)是芸香科(Rutaceae)柑橘属Citrus L.植物果实中的主要活性成分，橙皮素是橙皮苷(hesperidin)的糖基配体，分子式为C

发明内容

本发明的目的在于，提供一种橙皮素及其衍生物产品及其在制备抗新型冠状病毒感染性疾病的药物中的应用。基于上述的原因和需求，发现橙皮素及其衍生物产品具有抗SARS-CoV-2病毒的新药理活性，进而提供一种橙皮素及其衍生物产品作为药物的新应用，即在制备治疗或预防新型冠状病毒感染性疾病的药物中的应用，以望解决目前难以解决的全球范围内新冠疫情问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种橙皮素及其衍生物产品，包括橙皮素产品和/或橙皮苷产品；所述橙皮素产品包括如下组分：橙皮素含量≥98％，橙皮苷含量为0.2～0.5％，柚皮素含量为0.3～0.8％，异樱花亭含量为0.3～0.8％；所述橙皮苷产品包括如下组分：橙皮苷的含量≥96％，异柚苷含量为1.0～2.0％，香风草苷含量为1.0～3.0％。

橙皮素及其衍生物为如下式I或式II结构：

式I：

其中，

R2＝OH、OCH

当式I中R1＝R2＝OH时，化合物即为橙皮素；式I中R1为二糖结构，R2＝OH时，化合物即为橙皮苷；式I中R1为二糖结构，R2＝OCH

如上所述橙皮素及其衍生物产品的制备方法，所述橙皮素产品的制备包括如下步骤：

A、将反相硅胶用甲醇浸泡过夜；

B、湿法装柱，用水-甲醇溶液平衡柱子并作为洗脱剂，以粗橙皮素为原料，平衡柱子后上样，进行洗脱；

C、收集目标洗脱液，浓缩并干燥，获得所述橙皮素产品。

优选的，所述橙皮素产品的制备包括如下步骤

A、将反相硅胶用甲醇浸泡过夜；

B、湿法装柱，柱内径：柱高＝1:5～10，用水-甲醇按体积比35～40∶65～60的混合溶液平衡柱子并作为洗脱剂，以含量90％的粗橙皮素为原料，平衡柱子后上样，上样量与所述反相硅胶重量比为1:10～15，进行洗脱；

C、收集第2～6柱体积的目标洗脱液，浓缩并减压干燥，获得所述橙皮素产品。

粗橙皮素，一般使用市售产品即可。用甲醇浸泡使反相硅胶充分溶胀，之后再以水-甲醇溶液平衡柱子并进行洗脱，即可在目标洗脱液中获得本发明的橙皮素产品。

如上述橙皮素及其衍生物产品的制备方法，所述橙皮苷产品的制备包括如下步骤：

a、以粗橙皮苷为原料，溶解后调节体系为碱性，静置；

b、之后过滤，获得的滤液调节体系为酸性，静置；

c、之后过滤截取滤渣，将滤渣进行干燥，获得所述橙皮苷产品。

优选的，所述橙皮苷产品的制备包括如下步骤：

a、以含量70％的粗橙皮苷为原料，溶于甲醇溶液，加氢氧化钠溶液调节pH为10～12，静置30～40分钟；

b、之后常压过滤，获得的滤液加入盐酸，调节体系pH为4～5，静置12小时以上；

c、之后常压过滤截取滤渣，将滤渣进行真空干燥，获得所述橙皮苷产品。

粗橙皮苷，一般使用市售产品即可。粗橙皮苷在碱性条件下首先开环生成易溶于水的橙皮苷查尔酮，通过过滤，去除不溶于水的杂质。滤液中的橙皮苷查尔酮在酸性条件下，闭环生成水溶性较差的橙皮苷，过滤得到固体，干燥后即可获得本发明的橙皮苷产品。

如上所述橙皮素及其衍生物产品的应用，应用在制备抗新型冠状病毒感染性疾病的药物中。

优选的，所述抗新型冠状病毒感染性疾病为新冠肺炎。

优选的，所述橙皮素及其衍生物产品的抗新型冠状病毒活性浓度为10～1000μg/mL。

一种含有如上所述橙皮素及其衍生物产品的药物，所述药物还包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂中的一种或多种。

优选的，所述药物为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂中的一种。

与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：

本发明制备的橙皮素及其衍生物产品可用于预防和治疗新型冠状病毒感染性疾病，并且通过对橙皮素及其衍生物产品在Vero E6细胞上的细胞毒性及对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗病毒活性进行检测，表明本发明的橙皮素及其衍生物产品在细胞水平表现出抗新型冠状病毒效果，且选择指数SI较高，低毒高效，为新型冠状病毒感染性疾病的预防和治疗提供了一种新的方向，有望解决目前难以解决的全球范围内新冠疫情问题。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的橙皮素产品在Vero E6细胞上的细胞存活率曲线图；

图2为本发明实施例2中不同浓度的橙皮素产品在Vero E6细胞上抑制新型冠状病毒所致细胞病变(CPE)的抑制率曲线图；

图3为本发明实施例3中不同浓度的橙皮苷产品在Vero E6细胞上的细胞存活率曲线图；

图4为本发明实施例4中不同浓度的橙皮苷产品在Vero E6细胞上抑制新型冠状病毒所致细胞病变(CPE)的抑制率曲线图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种橙皮素产品，制备工艺如下：以90％的橙皮素为原料，用反相硅胶柱洗脱得到目标样品。

将反相硅胶用甲醇浸泡过夜，湿法装柱，柱内径：柱高＝1:5～10，用水-甲醇35～40∶65～60平衡柱子后上样。样品用洗脱液溶解，上样量与硅胶重量比为1:10～15，然后洗脱并收集第2～6柱体积的目标洗脱液，浓缩并减压干燥即得目标样品。与市售产品相比，精制后目标样品中含有特定成分，含量稳定。

实施例2

一种橙皮苷产品，制备工艺如下：以粗橙皮苷为原料用重结晶工艺得到目标样品。

以含量70％的粗橙皮苷为原料，溶于甲醇溶液，加氢氧化钠溶液调节pH为10～12，静置30～40分钟后，常压过滤，滤液加入盐酸，调节体系pH为4～5，静置12小时以上，常压过滤截取滤渣，将滤渣进行真空干燥，得到目标样品。与市售产品相比，精制后目标样品中含有特定成分，含量稳定。

效果例1

本发明的橙皮素产品对Vero E6细胞的细胞毒性作用

1.实验方法

(1)取无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为2×10

(2)96孔板单层细胞用PBS洗涤1次，每孔加入100μL浓度为7.813μg/mL、15.125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL如实施例1获得的橙皮素产品。空白对照组和正常细胞组每孔加入等体积培养液，37℃培养3日；

(3)每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μL DMSO，低速振荡5分钟，使结晶物充分融解；

(4)选择490nm波长测定吸光值，计算细胞存活率。

(5)实验条件：以上实验操作均在BSL-2实验室内完成。

2.实验结果

实验结果如图1所示，在Vero E6细胞中，本发明的橙皮素产品的半数无毒浓度(TC

效果例2

本发明的橙皮素产品对新冠肺炎病毒的抗病毒活性作用

1.实验方法

(1)取无菌96孔培养板,每孔加入100μL浓度为2×10

(2)培养板实验组和病毒对照组加入100TCID

(3)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；取如实施例1获得的橙皮素产品稀释成15.125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL和125μg/mL四个浓度，每孔加入上述药液100μL；

(4)同时设立细胞对照、空白对照和病毒对照；

(5)细胞在37℃，5％CO

(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，计算半数有效浓度(IC

(7)实验条件：以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

2.实验结果

结果如图2所示，本发明的橙皮素产品对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染Vero E6细胞致细胞病变具有抑制作用，橙皮素在Vero E6细胞上的IC

效果例3

本发明的橙皮苷产品对Vero E6细胞的细胞毒性作用

1.实验方法

(1)取无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为2×10

(2)96孔板单层细胞用PBS洗涤1次，每孔加入100μL浓度为39.063μg/mL、78.125μg/mL、156.25μg/mL、312.5μg/mL、625μg/mL、1250μg/mL、2500μg/mL和5000μg/mL如实施例2获得的橙皮苷产品。空白对照组和正常细胞组每孔加入等体积培养液，37℃培养3日；

(3)每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4小时。弃上清，每孔加入100μL DMSO，低速振荡5分钟，使结晶物充分融解；

(4)选择490nm波长测定吸光值，计算细胞存活率。

(5)实验条件：以上实验操作均在BSL-2实验室内完成。

2.实验结果

实验结果如图3所示，在Vero E6细胞中，本发明的橙皮苷产品的半数无毒浓度(TC

效果例4

本发明的橙皮苷产品对新冠肺炎病毒的抗病毒活性作用

1.实验方法

(1)取无菌96孔培养板,每孔加入100μL浓度为2×10

(2)培养板实验组和病毒对照组加入100TCID

(3)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；取如实施例2获得的橙皮苷产品稀释成125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL四个浓度，每孔加入上述药液100μL；

(4)同时设立细胞对照、空白对照和病毒对照；

(5)细胞在37℃，5％CO

(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，计算半数有效浓度(IC

(7)实验条件：以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

2.实验结果

结果如图4所示，橙皮苷对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染Vero E6细胞致细胞病变具有抑制作用，本发明的橙皮素产品在Vero E6细胞上的IC

效果例5

本发明的橙皮素及其衍生物产品的选择指数

以选择指数SI(SI＝TC

本发明的橙皮素产品的选择指数SI为2.64，橙皮苷产品的选择指数SI为6.18。

由此可以看出，本发明中的橙皮素产品及橙皮苷产品均具有较高的选择指数SI。表明本发明的橙皮素及其衍生物产品低毒有效。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。