MOF蛋白及其编码基因在细胞分裂调控和肿瘤治疗中的应用
文献发布时间:2024-01-17 01:17:49
技术领域
本发明涉及生物技术和肿瘤治疗领域,具体涉及一种乙酰转移酶MOF及其编码基因在细胞分裂调控和肿瘤治疗中的应用。
背景技术
多细胞生物体的生长发育离不开细胞增殖和细胞程序性死亡,有丝分裂是体细胞增殖的主要途径,细胞中的多种信号网络共同调控以保证有丝分裂的正常进行。亲本细胞在分裂期经过染色质凝集、分裂极确立、染色体整列、姐妹染色单体分离和胞质分裂等多个过程后分裂为两个子细胞,任一环节出错都可能使得遗传物质分配不均,最终导致细胞分裂失败或肿瘤的发生。有丝分裂失控是肿瘤细胞的重要特征(Jamasbi et al.,2022),抑制细胞分裂是肿瘤治疗的有效手段。
MOF是MYST组蛋白乙酰转移酶家族的成员,最初作为MSL复合物中的催化亚基组分被发现报道,MSL复合物乙酰化雄性果蝇X染色体上的H4K16增强基因转录,维持雄性果蝇和雌性果蝇的性染色体基因平衡表达(Shevelyov et al.,2022)。此外,MOF参与了DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)的损伤修复(Sharma et al.,2010)、胚胎发育和胚胎干细胞的多能性维持(Li et al.,2012)、自噬相关基因的表达调控(Fullgrabe et al.,2013)以及线粒体基因转录(Chatterjee et al.,2016)等过程,但MOF在有丝分裂中的功能尚不清楚。
PLK1是Polo样激酶(Polo-like kinases,PLKs)家族的成员之一,其活性受到翻译后修饰和蛋白质相互作用等多种方式的共同调控(Qi et al.,2018;Seki et al.,2008),Aurora A激酶磷酸化PLK1的210位苏氨酸从而激活PLK1。在有丝分裂过程中,PLK1结合并磷酸化Cep85启动中心体分离(Chen et al.,2019),磷酸化Haspin参与着丝粒上染色体乘客复合物(Chromosomal passenger complex,CPC)的招募(Ghenoiu et al.,2013),磷酸化BUBR1保证染色体的正常分离(Suijkerbuijk et al.,2012),它也参与中体区域的蛋白招募从而调控胞质分裂。PLK1是细胞周期的重要调控因子,在多种癌症中均发现了PLK1的高表达(Jang et al.,2006;Wang et al.,2021;Yang et al.,2017),因此PLK1一直是癌症治疗的重要靶点。
发明内容
本发明通过在肿瘤细胞中抑制MOF的乙酰转移酶活性或抑制MOF蛋白表达,研究MOF在细胞分裂过程和肿瘤细胞增殖中的功能。
具体来说,本发明提供以下技术方案:
一方面,本发明提供药物组合物,所述药物组合物包括抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂。
另一方面,本发明提供抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在一些实施方案中,所述敲低MOF的试剂为RNA干扰试剂。
在一些实施方案中,所述RNA干扰试剂包括siRNA。
在一些实施方案中,所述siRNA的序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方案中,所述抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂包括使得MOF的乙酰转移酶活性降低或丧失的试剂。
在一些实施方案中,所述肿瘤包括但不仅限于非小型肺癌、食管癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌。
在一些实施方案中,所述肿瘤选自非小型肺癌、食管癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌。
另一方面,本发明提供一种治疗癌症的方法,其特征在于,所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的敲低MOF的试剂。
另一方面,本发明提供抑制细胞分裂或抑制细胞增殖或抑制PLK1蛋白激酶活性的方法,优选地,所述方法不是用于疾病的治疗,其特征在于,所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂。
本发明提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制细胞分裂,或制备用于抑制细胞分裂的试剂盒中的应用,所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制细胞增殖,或制备用于抑制细胞增殖的试剂盒中的应用,所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制PLK1的蛋白激酶活性,或制备用于抑制PLK1蛋白激酶活性的试剂盒中的应用,所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述PLK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在制备肿瘤治疗药物中的应用,所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
以上所述药物的功能为(a)或(b)或(c):(a)抑制肿瘤细胞分裂;(b)抑制肿瘤生长;(c)治疗肿瘤。
进一步地,所述肿瘤细胞为高表达PLK1的人源肿瘤细胞,包括但不仅限于人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞。
进一步地,所述肿瘤为高表达PLK1的肿瘤。
以上任一所述敲低MOF蛋白的方式可以是RNA干扰技术,也可以是靶向细胞中位于MOF蛋白上游调控MOF基因表达的调控因子,从而抑制MOF蛋白的表达以减少细胞中的MOF蛋白含量,也可以是靶向细胞中调控MOF蛋白降解的调控因子,从而促进MOF蛋白的降解以减少细胞中的MOF蛋白含量,也可以是抑制细胞中MOF基因表达的化合物或小分子。
以上任一所述抑制MOF乙酰转移酶活性的物质为MOF乙酰转移酶活性抑制剂。
定义
γ-tubulin:一种参与微管形成的定位于中心体的微管蛋白,本发明的实施例中利用γ-tubulin-GFP观察中心体情况。
H2A:一种组蛋白,本发明的实施例中利用H2A-mCherry观察染色体情况。
有益结果
本发明通过在肿瘤细胞中敲低MOF蛋白或抑制MOF的乙酰转移酶活性,研究MOF在细胞分裂和细胞增殖中的功能发现:
(1)利用RNA干扰技术敲低人宫颈癌细胞HeLa细胞中的MOF蛋白后,HeLa细胞表现出有丝分裂异常表型,这种异常表型与通过siRNA在细胞中敲低PLK1蛋白后产生的有丝分裂异常表型类似,并且敲低MOF蛋白后,与对照组相比同一时刻进入有丝分裂的细胞比例显著降低,敲低MOF蛋白能够显著抑制细胞的分裂。
(2)MOF与细胞分裂相关蛋白激酶PLK1具有共定位,间期时两者在细胞核内共定位,分裂期时两者在中心体上具有共定位,并且两者之间存在直接相互作用。
(3)利用RNA干扰技术在HeLa细胞中敲低MOF或转染MOF乙酰转移酶活性缺失突变体后,PLK1的蛋白激酶活性受到显著抑制。
(4)利用RNA干扰技术在HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞中敲低MOF蛋白,能够抑制细胞内PLK1的激酶活性,并显著抑制细胞的增殖。
附图说明
图1是检测敲低MOF对细胞有丝分裂的影响,γ-tubulin-GFP显示中心体情况,H2A-mCherry显示染色体情况,其中A为活细胞成像结果;B和C为染色体排列和纺锤体异常表型统计结果。
图2是检测敲低MOF后不同时间点进入分裂期的细胞比例的实验结果。
图3是MOF和PLK1的siRNA敲低效率检测。
图4是MOF和PLK1在间期和分裂期时在细胞内的定位检测。
图5是MOF和PLK1相互作用检测的免疫共沉淀和Pull down实验结果,其中A是用Flag抗体进行的免疫共沉淀实验结果;B是用HA抗体进行的免疫共沉淀实验结果;C是用GST琼脂糖珠进行的Pull down实验结果。
图6是通过免疫印迹检测敲低MOF对不同时间点Cyclin B1、PLK1的表达及PLK1激酶活性水平的影响。
图7是通过免疫印迹检测MOF的乙酰转移酶活性对PLK1激酶活性的影响。
图8是敲低MOF检测HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞中PLK1表达及激酶活性水平的实验结果,其中A为HeLa细胞的结果;B为HGC27细胞的结果;C为MDA-MB-231细胞的结果。
图9是敲低MOF检测HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞的增殖能力的实验结果,其中A、B为HeLa细胞的结果;C、D为HGC27细胞的结果;E、F为MDA-MB-231细胞的结果。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明,但不限定本发明。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均可通过常规商业化途径购买。以下实施例所涉及的细胞生物学和分子生物学实验操作,如无特殊说明,均为本领域常规实验操作或根据实验中所用试剂的说明书进行。
本发明所用到的细胞:HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞均购自上海细胞库。
本发明所用到的siRNA及siRNA转染试剂siRNA-Mate均购自吉玛基因生物公司,实验中所用到的siControl和溶解siRNA粉末的DEPC水均为吉玛基因生物公司提供,涉及到的siRNA序列见表1。
表1 siRNA序列
本发明涉及的实验方法如下:
1.细胞培养及铺板:
(1)弃T25细胞培养瓶中旧培养液,用PBS缓冲液润洗细胞后吸去PBS,加入37℃预热的胰酶,待细胞消化好后吸去胰酶,加入新鲜DMEM培养基(购自VivaCell Biosciences,货号:C3113-0500)重悬细胞,按照1:4的比例传代至新培养瓶中,置于细胞培养箱(含5%CO
(2)若后续细胞用于显微镜下活细胞观察,则预先在六孔板中置入18mm×18mm玻片,若后续细胞用于显微镜下免疫荧光观察,则预先在六孔板中置入20mm×20mm的玻片。若后续实验需要将细胞同步化至有丝分裂期,则预先用促进细胞贴壁的多聚赖氨酸(购自Sigma,货号:P6407)孵育玻片或六孔板。在六孔板中加入1.5mL新鲜DMEM培养基和400μL细胞悬液,摇匀后放置于细胞培养箱(含5%CO
2.siRNA转染
每1OD的siRNA粉末用125μL的DEPC水溶解,在RNase-free的EP管中加入200μLOpti-MEM培养基(购自Gibco,货号:31985062),加入5μL溶解后的siRNA后再加入5μLsiRNA-Mate,涡旋混匀后室温静置10分钟。将培养至合适密度的细胞更换新的DMEM培养基,将孵育完成后的混合液滴加至六孔板中。
3.质粒转染
准备两组EP管,分别加入100μL Opti-MEM培养基,将质粒或质粒混合物加入到其中一组EP管中,利用Lipofectamine 3000(购自Invitrogen)试剂盒进行转染。每1μg质粒或质粒混合物加入1μL试剂盒中的P3000溶液,用枪头混匀后室温静置3分钟。向对应的另一组EP管中加入与P3000等量的Lipo 3000溶液,将两组EP管中的溶液混合在一起,室温下静置孵育12分钟。将培养至合适密度的细胞更换新的DMEM培养基,将孵育完成后的混合液滴加至六孔板中。
4.免疫荧光
本发明实施例中涉及的免疫荧光是向细胞中转染并表达带有GFP(基因序列如SEQID NO:25所示)或mCherry(基因序列如SEQ ID NO:26所示)荧光标签的蛋白后,将细胞固定通透封片,具体实验步骤如下:
(1)细胞转染48小时后,吸去旧培养基,用PBS润洗细胞后弃去PBS。每孔加入1mL4%多聚甲醛,室温固定细胞10分钟。
(2)弃4%多聚甲醛,用PBS润洗细胞3次,每次5分钟。用PBS缓冲液配制含有0.2%TritonX-100的通透液,加入到细胞中,室温通透10分钟。
(3)PBS润洗细胞3次,每次5分钟。用PBS稀释Hoechst DNA染料(购自ThermoScientific,货号:62249),将稀释液滴加在细胞爬片上,避光室温孵育10分钟。
(4)吸除DNA染料,PBS润洗细胞3次,每次5分钟。将抗荧光淬灭封片剂用PBS以1:1的比例稀释后,每个载玻片上滴加15μL稀释后的封片剂,覆盖细胞爬片后,用指甲油封片,尽快在显微镜下观察。
5.免疫共沉淀
(1)细胞转染48小时后,用PBS润洗细胞后加入胰酶消化,细胞变圆后加入新鲜DMEM培养基终止消化,将细胞悬液转移至离心管中,1100rpm离心5分钟。弃上清,用PBS重悬细胞后,相同条件离心5分钟,弃去PBS。
(2)加入250μL WB/IP裂解液重悬细胞沉淀(购自碧云天,货号:P0013),冰浴30分钟,过程中涡旋震荡3次。离心机预冷至4℃,15000g离心15分钟。
(3)弃沉淀,向上清中加入15μL的proteinA/G琼脂糖珠(购自Santa Cruz,货号:sc-2003),4℃孵育30分钟。
(4)置于4℃离心机中3000rpm离心5分钟,取适量上清留存作为Input。
(5)将抗体按照说明书推荐比例加入至上清中,并用WB/IP裂解液扩充体系至500μL。4℃过夜旋转孵育。
(6)加入20μL proteinA/G琼脂糖珠,4℃孵育3小时。
(7)4℃,3000rpm离心5分钟后,弃上清。用1mL预冷的PBS重悬琼脂糖珠,同样条件再次离心5分钟。
(8)重复PBS洗涤步骤5次,最后一次离心结束后,弃上清向沉淀中加入1×SDSLoading buffer,100℃煮样10分钟。
6.聚合酶链式反应
利用高保真DNA聚合酶试剂盒(购自Vazyme,货号:P505-01)进行PCR反应。50μL体系反应组分如下:25μL 2×Phanta Buffer,2μL模板DNA,2μL正向引物,2μL反向引物,1μLdNTP,1μL DNA Polymerase,去离子水补充体系至50μL。
混匀后放入PCR仪,PCR反应程序为:95℃预变性1分钟,95℃变性15秒,55℃-65℃退火15秒,72℃延伸(每1kb长度延伸1分钟),72℃彻底延伸10分钟。
PCR后的产物通过产物纯化试剂盒(购自诺唯赞,货号:DC301-01)按照说明书步骤进行回收。
7.重组与转化
PCR产物与载体通过重组连接在一起,重组过程使用重组试剂盒(购自诺唯赞,货号:C112),重组后的产物加入到大肠杆菌DH5α感受态中进行转化。筛选阳性克隆进行扩增,使用质粒抽提试剂盒(购自诺唯赞,货号:DC201-01)提取质粒,质粒测序正确后方可用于后续实验。
8.细胞增殖实验
(1)使用EdU-488细胞增殖检测试剂盒(购自碧云天,货号:C00715)进行细胞增殖检测。将EdU加入到DMEM培养基中,使其终浓度为10μM,细胞置于培养箱(含5%CO
(2)孵育结束后,用PBS缓冲液润洗细胞3次,加入4%多聚甲醛室温固定15分钟。
(3)弃4%多聚甲醛,用PBS润洗细胞3次。用PBS缓冲液配制含有0.2%TritonX-100的通透液,加入到细胞中,室温通透15分钟。
(4)PBS润洗细胞3次。用PBS稀释Hoechst DNA染料,将稀释液滴加在细胞爬片上,避光室温孵育10分钟。
(5)吸除DNA染料,PBS润洗细胞3次,每次5分钟。将抗荧光淬灭封片剂用PBS以1:1的比例稀释后,每个载玻片上滴加15μL稀释后的封片剂,指甲油封片,尽快在显微镜下观察。
9.细胞同步化处理
(1)Thymidine(购自Sigma,货号:T1895)是一种能够掺入并阻断DNA合成的一种脱氧核糖核酸特殊前体,工作浓度为2.5mM。细胞用Thymidine处理18小时后,PBS润洗两次并释放到新鲜DMEM培养基中8小时,即可将细胞同步化至有丝分裂期。
(2)Nocodazole(购自Sigma,货号:M1404)能够抑制微管形成,因此它与Thymidine联用可以将细胞同步化至有丝分裂的前中期。具体方法为:Thymidine处理且释放8小时后的细胞再用100ng/mL的Nocodazole处理1小时,即可将细胞同步化至前中期。
10.Pull down实验
(1)取适量GST琼脂糖珠(购自Solarbio,货号:P2020)溶液1000g,4℃离心10分钟,去除上清后用PBS重悬,重复三次。
(2)取等量的GST(氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)和GST-PLK1(氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)加入到洗涤后的GST琼脂糖珠溶液中,4℃冰箱中旋转孵育3小时。
(3)1000g,4℃离心10分钟,弃上清,用含0.1%Tween 20的PBS洗涤,重复5次。
(4)用500μL PBS配制的5%BSA缓冲液重悬,4℃旋转孵育1小时。
(5)向两组中分别加入等量的His-MOF蛋白,4℃旋转孵育过夜。
(6)1000g,4℃离心10分钟,弃上清,用含0.1%Tween 20的PBS洗涤,重复5次。
(7)沉淀中加入1×SDS Loading buffer(购自翌圣生物,货号:20315ES05,使用时用去离子水稀释),100℃水浴锅中煮样10分钟。
11.蛋白表达纯化
(1)将融合蛋白质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌中,涂布于平板上。37℃过夜培育后,挑取阳性克隆至5mL含相应抗生素的液体LB培养基中,37℃,250rpm培育12小时。
(2)扩充培养体系至800mL,继续在摇床上培养,当菌液的OD600值达到0.8-1.0时,将菌液置于冰水中降温至16℃。
(3)加入IPTG,使其工作浓度为0.2mM。16℃,250rpm诱导20-24小时。
(4)4℃,5000rpm离心15分钟,弃上清,加入40mL预冷的Lysis buffer(1mM PMSF,150mM NaCl,0.5M HEPES,1mM MgSO
(5)将镍柱填料(购自Qiagen,货号:30210)平衡后与蛋白上清混合,4℃冰箱中孵育3小时。
(6)先用50mM浓度的咪唑洗脱杂蛋白,再用200mM浓度的咪唑洗脱目的蛋白,蛋白储存于-80℃冰箱。
若纯化GST标签蛋白则用预冷的Lysis buffer平衡GST琼脂糖珠(购自Solarbio,货号:P2020),4℃冰箱中过夜孵育。后续步骤中用50mM Tris-HCl(pH7.0)去除杂蛋白,用50mM Tris-HCl(含有20mM还原性谷胱甘肽,pH8.0)洗脱目的蛋白。
12.数据处理
本发明实施例中的实验数据通过学生t检验进行分析,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****p<0.0001表示数据具有显著性差异。
实施例1MOF在有丝分裂中的功能鉴定
为了确定MOF蛋白在细胞有丝分裂过程中的功能,利用RNA干扰技术在HeLa细胞中敲低MOF蛋白,并向HeLa细胞中共转染γ-tubulin-GFP(SEQ ID NO:7)和H2A-mCherry(SEQID NO:8)两种质粒,将HeLa细胞用Thymidine同步化至有丝分裂期后,在显微镜下观察细胞的分裂情况。结果显示,在HeLa细胞中敲低MOF蛋白后,出现了不同于对照组的异常的有丝分裂表型(图1A,标尺为5μm),发生染色体赤道板集合缺陷的细胞比例增加了48.27%,P<0.001(图1B),也出现了约24.76%的单极纺锤体细胞比例(图1C)。敲低MOF蛋白产生的有丝分裂异常表型与敲低PLK1蛋白产生的有丝分裂异常表型类似(图1),表明敲低MOF能够影响HeLa细胞的有丝分裂,并且这种影响可能与PLK1蛋白相关。
将HeLa细胞分别转染siControl和siMOF,并用Thymidine处理同步化,将细胞释放至含有Nocodazole的培养基中,分别在释放后的6、7、8、9、10小时将细胞固定,Hoechst染色DNA后统计各组各时间点进入分裂期的细胞占总细胞的比例。结果如图2所示,敲低MOF的细胞与同一时间点的对照组细胞相比,进入分裂期的细胞比例显著降低,释放8小时后对照组进入分裂期的细胞比例已经接近20%,而敲低MOF组的分裂细胞比例还不到10%。结合释放时间来看,敲低MOF后进入有丝分裂的细胞比例增长趋势显著延缓于对照组,当释放10小时后,MOF敲低组进入分裂期的细胞比例才接近于20%,而对照组的细胞释放8小时后分裂期细胞比例已经接近20%,表明敲低MOF会显著抑制细胞的分裂。
将转染了对应siRNA的HeLa细胞同步化至有丝分裂期,收集细胞并检测siRNA的敲低效率,使用MOF抗体(购自Abcam,货号:ab200660)和PLK1抗体(购自Abcam,货号:ab17056)。结果如图3显示,MOF和PLK1的siRNA都能够显著敲低HeLa细胞中相应的蛋白。
实施例2MOF与PLK1共定位的鉴定
1.构建mCherry-MOF
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因,并连接到带有mCherry荧光蛋白的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-GCTGTACAAGAGGGGGTACCCGATGGCGGCACAGGGAGCT-3’
(SEQ ID NO:9)
下游引物:
5’-CACACTGGACTAGTGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTG-3’(SEQ ID NO:10)
用BamHⅠ和KpnⅠ酶切载体pcDNA3.1-mCherry(购自Invitrogen),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到mCherry-MOF。
2.构建GFP-PLK1
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因,并连接到带有GFP荧光蛋白的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-CTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGG-3’(SEQ ID NO:11)
下游引物:
5’
-GACTGCAGAATTCGAAGCTTTCAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTGG C-3’(SEQ ID NO:12)
用HindⅢ酶切载体pEGFP-C3(购自Clontech公司),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到GFP-PLK1。
3.MOF与PLK1定位观察
向HeLa细胞中共转染mCherry-MOF和GFP-PLK1,将细胞同步化至分裂期,固定通透细胞,染色DNA后封片,显微镜下观察。
结果如图4所示(标尺为5μm),MOF在间期时定位于细胞核中,在分裂期定位于纺锤体以及弥散在细胞质中,PLK1在间期时有少量的细胞核定位,分裂期时在中心体和动粒上均有定位,两者间期时在细胞核内具有共定位,在分裂期的中心体上具有共定位。
实施例3MOF与PLK1的相互作用检测
1.构建HA-MOF
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因,并连接到带有HA标签的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGCGGCACAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:13)
下游引物:
5’-ATCGATTGAATTCGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT-3’(SEQ ID NO:14)
用BamHⅠ酶切pKH3载体(购自Clontech公司),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到HA-MOF。
2.构建Flag-PLK1
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因,并连接到带有Flag标签的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-CAAGGATGACGATGACAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGC-3’
(SEQ ID NO:15)
下游引物:
5’
-GAGATGAGTTTTTGTTCGGATCCGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTG-3’(SEQ ID NO:16)
用HindⅢ和BamHⅠ酶切载体p3×FLAG-Myc-CMV-24(购自Sigma公司),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到Flag-PLK1。
3.构建His-MOF
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因,并连接到带有His标签的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-GACGACGACGACAAGCATATGATGGCGGCACAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:17)
下游引物:
5’
-GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTGCTTACTTCTTGGAGAGCTTGAC TTGCT-3’(SEQ ID NO:18)
用NdeⅠ和BamHⅠ酶切pET19b载体(购自Clontech公司),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到His-MOF。
4.构建GST-PLK1
以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因,并连接到带有GST标签的载体上,所用引物为:
上游引物:
5’-GGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGAGTGCTGCAGTGACTGC-3’(SEQ ID NO:19)
下游引物:
5’
-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCT-3’(SEQ ID NO:20)
用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切载体pGEX-6p-1(购自Clontech),将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序,测序正确后即得到GST-PLK1。
5.MOF与PLK1体内免疫共沉淀实验
(1)将HA-MOF分别与Flag空载或Flag-PLK1共转染至HeLa细胞中,将细胞用Thymidine同步化至分裂期后,收集细胞用Flag抗体(购自Sigma,货号:F1804)进行免疫共沉淀实验。
(2)将Flag-PLK1分别与HA空载或HA-MOF共转染至HeLa细胞中,将细胞用Thymidine同步化至分裂期后,收集细胞用HA抗体(购自Proteintech,货号:66006-2-Ig)进行免疫共沉淀实验。
6.MOF与PLK1体外Pull down实验
利用大肠杆菌中纯化表达的His-MOF蛋白和GST-PLK1蛋白进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色显示GST和GST-PLK1,免疫印迹后用MOF抗体(购自Abcam,货号:ab200660)显影His-MOF。
结果显示,在体内,HA-MOF可以随着Flag-PLK1一起被Flag抗体结合的琼脂糖珠沉淀下来(图5A),Flag-PLK1也可以随着HA-MOF一起被HA抗体结合的琼脂糖珠沉淀下来(图5B),说明MOF和PLK1在细胞内存在相互作用。在体外,His-MOF可以与GST-PLK1一同被GST琼脂糖珠沉淀下来(图5C),说明MOF与PLK1之间存在直接相互作用。
实施例4检测敲低MOF对PLK1激酶活性的影响
HeLa细胞分别转染siControl和siMOF后,Thymidine处理18小时,PBS润洗细胞两次,更换新鲜的DMEM培养基后在细胞培养箱(37℃,5%CO
结果如图6显示,在细胞中转染siRNA抑制MOF蛋白的表达,PLK1的表达量不受影响,但表征PLK1激酶活性的PLK1-pT210水平受到显著抑制。Cyclin B1在有丝分裂结束时通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解,如siControl组所示,而相较于siControl组,siMOF组中的Cyclin B1在释放11小时后仍处于较高水平,说明有丝分裂无法及时退出。这些结果表明,敲低MOF抑制了PLK1的激酶活性,并影响细胞有丝分裂进程。
实施例5检测MOF的乙酰转移酶活性对PLK1激酶活性的影响
1.构建HA-MOF resist
以上述实施例中构建的HA-MOF质粒为模板,进行PCR反应,所用引物为:
上游引物:
5’-GAAGTCATTCAATCACGTGTCAACGACCAGGAGGGCCG-3’(SEQ ID NO:21)
下游引物:
5’-GTGATTGAATGACTTCAGCAGAATGCCAGGTGCTATCC-3’(SEQ ID NO:22)
PCR产物加入DpnⅠ酶消化(购自碧云天,货号:D6257)37℃水浴1小时,自身重组转化并提取质粒进行测序,测序正确的质粒即为HA-MOF resist。HA-MOF resist能在细胞转染siMOF的情况下不受影响地表达HA标签的MOF。
2.构建HA-MOF K274R resist
以上述构建的HA-MOF resist质粒为模板,进行PCR反应,所用引物为:
上游引物:
5’-GACCATCGCACACTGTACTTTGACGTGGAGCC-3’(SEQ ID NO:23)
下游引物:
5’-ACAGTGTGCGATGGTCCAGGAAAAGCTTGGCCA-3’(SEQ ID NO:24)
PCR产物加入DpnⅠ酶消化,37℃水浴1小时,自身重组转化并提取质粒进行测序,测序正确的质粒即为HA-MOF K274R resist。MOF在第274位赖氨酸位置发生自乙酰化,将274位的赖氨酸突变为精氨酸后MOF的乙酰转移酶活性受到显著抑制。HA-MOF K274R resist能在细胞转染siMOF的情况下不受影响地表达HA标签的MOF乙酰转移酶活缺失突变体。
3.回补实验
在HeLa细胞中使用Lipo3000试剂盒分别转染HA-MOF resist和HA-MOF K274Rresist质粒,6小时后更换新DMEM培养基,向两组中同时转染siMOF敲低内源的MOF蛋白,并通过Thymidine和Nocodazole将细胞同步化至前中期进行免疫印迹检测PLK1、PLK1-pT210、HA-MOF resist和HA-MOF K274R resist水平,一抗使用PLK1抗体、PLK1-pT210抗体、HA抗体(购自Proteintech,货号:51064-2-AP)和GAPDH抗体在4℃摇床孵育过夜,二抗使用羊抗鼠二抗抗体或羊抗兔二抗抗体室温孵育1小时后显影。
结果如图7所示,利用siRNA敲低细胞中内源性MOF蛋白时,野生型MOF能够回补由内源性MOF缺失引起的PLK1 T210磷酸化水平抑制,而MOF的乙酰转移酶活性缺失突变体无法回补由内源性MOF缺失引起的PLK1 T210磷酸化水平抑制,即MOF的乙酰转移酶活性对PLK1的激酶活性至关重要。
实施例6检测敲低MOF对细胞增殖能力的影响
1.检测敲低MOF对HeLa细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响
HeLa细胞(一种宫颈癌细胞系)铺板后分别转染siControl和siMOF,将细胞用Thymidin和Nocodazole同步化至前中期,收集细胞进行免疫印迹,检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。
六孔板铺玻片后铺HeLa细胞,分别转染siControl和siMOF,48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。
2.检测敲低MOF对HGC27细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响
HGC27细胞(源自未分化胃癌组织)铺板后分别转染siControl和siMOF,将细胞用Thymidin和Nocodazole同步化至前中期,收集细胞进行免疫印迹,检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。
六孔板铺玻片后铺HGC27细胞,分别转染siControl和siMOF,48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。
3.检测敲低MOF对MDA-MB-231细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响
MDA-MB-231细胞(一种人乳腺癌细胞系)铺板后分别转染siControl和siMOF,将细胞用Thymidine和Nocodazole同步化至前中期,收集细胞进行免疫印迹,检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。
六孔板铺玻片后铺MDA-MB-231细胞,分别转染siControl和siMOF,48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。
结果显示,敲低MOF后人宫颈癌细胞HeLa细胞中的PLK1蛋白表达不受影响,但PLK1-pT210水平下降,说明PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8A)。人胃癌细胞HGC27细胞中敲低MOF后,PLK1的表达不受影响,但PLK1-pT210水平下降,表示PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8B)。在人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中敲低MOF后,PLK1的表达不受影响,PLK1-pT210水平下降,说明PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8C)。EdU实验结果显示,敲低MOF后,HeLa细胞的EdU阳性细胞比例下降了约12.06%,HGC27细胞的EdU阳性细胞比例下降了约10.91%,MDA-MB-231细胞的EdU阳性细胞比例下降了约13.93%,说明敲低MOF能够显著抑制HeLa细胞(图9A和B,p<0.0001)、HGC27细胞(图9C和D,p<0.05)和MDA-MB-231细胞(图9E和F,p<0.01)的增殖能力。
以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列
SEQ ID NO:1MOF蛋白的氨基酸序列
MAAQGAAAAVAAGTSGVAGEGEPGPGENAAAEGTAPSPGRVSPPTPARGEPEVTVEIGETYLCRRPDSTWHSAEVIQSRVNDQEGREEFYVHYVGFNRRLDEWVDKNRLALTKTVKDAVQKNSEKYLSELAEQPERKITRNQKRKHDEINHVQKTYAEMDPTTAALEKEHEAITKVKYVDKIHIGNYEIDAWYFSPFPEDYGKQPKLWLCEYCLKYMKYEKSYRFHLGQCQWRQPPGKEIYRKSNISVYEVDGKDHKIYCQNLCLLAKLFLDHKTLYFDVEPFVFYILTEVDRQGAHIVGYFSKEKESPDGNNVACILTLPPYQRRGYGKFLIAFSYELSKLESTVGSPEKPLSDLGKLSYRSYWSWVLLEILRDFRGTLSIKDLSQMTSITQNDIISTLQSLNMVKYWKGQHVICVTPKLVEEHLKSAQYKKPPITVDSVCLKWAPPKHKQVKLSKK
SEQ ID NO:2MOF的基因序列
ATGGCGGCACAGGGAGCTGCTGCGGCGGTTGCGGCGGGGACTTCAGGGGTCGCGGGGGAGGGCGAGCCCGGGCCCGGGGAGAATGCGGCCGCTGAGGGGACCGCCCCATCCCCGGGCCGCGTCTCTCCGCCGACCCCGGCGCGCGGCGAGCCGGAAGTCACGGTGGAGATCGGAGAAACGTACCTGTGCCGGCGACCGGATAGCACCTGGCATTCTGCTGAAGTGATCCAGTCTCGAGTGAACGACCAGGAGGGCCGAGAGGAATTCTATGTACACTACGTGGGCTTTAACCGGCGGCTGGACGAGTGGGTAGACAAGAACCGGCTGGCGCTGACCAAGACAGTGAAGGATGCTGTACAGAAGAACTCAGAGAAGTACCTGAGCGAGCTCGCAGAGCAGCCTGAGCGCAAGATCACTCGCAACCAAAAGCGCAAGCATGATGAGATCAACCATGTGCAGAAGACTTATGCAGAGATGGACCCCACCACAGCAGCCTTGGAGAAGGAGCATGAGGCGATCACCAAGGTGAAGTATGTGGACAAGATCCACATCGGGAACTACGAAATTGATGCCTGGTATTTCTCACCATTCCCCGAAGACTATGGGAAACAGCCCAAGCTCTGGCTCTGCGAGTACTGCCTCAAGTACATGAAATATGAGAAGAGCTACCGCTTCCACTTGGGTCAGTGCCAGTGGCGGCAGCCCCCCGGGAAAGAGATCTACCGCAAGAGCAACATCTCCGTGTACGAAGTTGATGGCAAAGACCATAAGATTTACTGTCAGAACCTGTGTCTGCTGGCCAAGCTTTTCCTGGACCATAAGACACTGTACTTTGACGTGGAGCCGTTCGTCTTTTACATCCTGACTGAGGTGGACCGGCAGGGGGCCCACATTGTTGGCTACTTCTCCAAGGAGAAGGAGTCCCCGGATGGAAACAATGTGGCCTGCATCCTGACCTTGCCCCCCTACCAACGCCGCGGCTACGGGAAGTTCCTCATCGCTTTCAGTTATGAGCTCTCCAAGCTGGAGAGCACAGTCGGCTCCCCGGAGAAGCCGCTGTCTGACCTGGGCAAGCTCAGCTACCGCAGCTACTGGTCCTGGGTGCTGCTGGAGATCCTGCGGGACTTCCGGGGCACACTGTCCATCAAGGACCTCAGCCAGATGACCAGTATCACCCAAAATGACATCATCAGTACCCTGCAATCCCTCAATATGGTCAAGTACTGGAAGGGCCAGCACGTGATCTGTGTCACACCCAAGCTGGTGGAGGAGCACCTCAAAAGTGCCCAGTATAAGAAACCACCCATCACAGTGGACTCCGTCTGCCTCAAGTGGGCACCCCCCAAGCACAAGCAAGTCAAGCTCTCCAAGAAG
SEQ ID NO:3PLK1的氨基酸序列
MSAAVTAGKLARAPADPGKAGVPGVAAPGAPAAAPPAKEIPEVLVDPRSRRRYVRGRFLGKGGFAKCFEISDADTKEVFAGKIVPKSLLLKPHQREKMSMEISIHRSLAHQHVVGFHGFFEDNDFVFVVLELCRRRSLLELHKRRKALTEPEARYYLRQIVLGCQYLHRNRVIHRDLKLGNLFLNEDLEVKIGDFGLATKVEYDGERKKTLCGTPNYIAPEVLSKKGHSFEVDVWSIGCIMYTLLVGKPPFETSCLKETYLRIKKNEYSIPKHINPVAASLIQKMLQTDPTARPTINELLNDEFFTSGYIPARLPITCLTIPPRFSIAPSSLDPSNRKPLTVLNKGLENPLPERPREKEEPVVRETGEVVDCHLSDMLQQLHSVNASKPSERGLVRQEEAEDPACIPIFWVSKWVDYSDKYGLGYQLCDNSVGVLFNDSTRLILYNDGDSLQYIERDGTESYLTVSSHPNSLMKKITLLKYFRNYMSEHLLKAGANITPREGDELARLPYLRTWFRTRSAIILHLSNGSVQINFFQDHTKLILCPLMAAVTYIDEKRDFRTYRLSLLEEYGCCKELASRLRYARTMVDKLLSSRSASNRLKAS
SEQ ID NO:4PLK1的基因序列
ATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGGAAGCTGGCACGGGCACCGGCCGACCCTGGGAAAGCCGGGGTCCCCGGAGTTGCAGCTCCCGGAGCTCCGGCGGCGGCTCCACCGGCGAAAGAGATCCCGGAGGTCCTAGTGGACCCACGCAGCCGGCGGCGCTATGTGCGGGGCCGCTTTTTGGGCAAGGGCGGCTTTGCCAAGTGCTTCGAGATCTCGGACGCGGACACCAAGGAGGTGTTCGCGGGCAAGATTGTGCCTAAGTCTCTGCTGCTCAAGCCGCACCAGAGGGAGAAGATGTCCATGGAAATATCCATTCACCGCAGCCTCGCCCACCAGCACGTCGTAGGATTCCACGGCTTTTTCGAGGACAACGACTTCGTGTTCGTGGTGTTGGAGCTCTGCCGCCGGAGGTCTCTCCTGGAGCTGCACAAGAGGAGGAAAGCCCTGACTGAGCCTGAGGCCCGATACTACCTACGGCAAATTGTGCTTGGCTGCCAGTACCTGCACCGAAACCGAGTTATTCATCGAGACCTCAAGCTGGGCAACCTTTTCCTGAATGAAGATCTGGAGGTGAAAATAGGGGATTTTGGACTGGCAACCAAAGTCGAATATGACGGGGAGAGGAAGAAGACCCTGTGTGGGACTCCTAATTACATAGCTCCCGAGGTGCTGAGCAAGAAAGGGCACAGTTTCGAGGTGGATGTGTGGTCCATTGGGTGTATCATGTATACCTTGTTAGTGGGCAAACCACCTTTTGAGACTTCTTGCCTAAAAGAGACCTACCTCCGGATCAAGAAGAATGAATACAGTATTCCCAAGCACATCAACCCCGTGGCCGCCTCCCTCATCCAGAAGATGCTTCAGACAGATCCCACTGCCCGCCCAACCATTAACGAGCTGCTTAATGACGAGTTCTTTACTTCTGGCTATATCCCTGCCCGTCTCCCCATCACCTGCCTGACCATTCCACCAAGGTTTTCGATTGCTCCCAGCAGCCTGGACCCCAGCAACCGGAAGCCCCTCACAGTCCTCAATAAAGGCTTGGAGAACCCCCTGCCTGAGCGTCCCCGGGAAAAAGAAGAACCAGTGGTTCGAGAGACAGGTGAGGTGGTCGACTGCCACCTCAGTGACATGCTGCAGCAGCTGCACAGTGTCAATGCCTCCAAGCCCTCGGAGCGTGGGCTGGTCAGGCAAGAGGAGGCTGAGGATCCTGCCTGCATCCCCATCTTCTGGGTCAGCAAGTGGGTGGACTATTCGGACAAGTACGGCCTTGGGTATCAGCTCTGTGATAACAGCGTGGGGGTGCTCTTCAATGACTCAACACGCCTCATCCTCTACAATGATGGTGACAGCCTGCAGTACATAGAGCGTGACGGCACTGAGTCCTACCTCACCGTGAGTTCCCATCCCAACTCCTTGATGAAGAAGATCACCCTCCTTAAATATTTCCGCAATTACATGAGCGAGCACTTGCTGAAGGCAGGTGCCAACATCACGCCGCGCGAAGGTGATGAGCTCGCCCGGCTGCCCTACCTACGGACCTGGTTCCGCACCCGCAGCGCCATCATCCTGCACCTCAGCAACGGCAGCGTGCAGATCAACTTCTTCCAGGATCACACCAAGCTCATCTTGTGCCCACTGATGGCAGCCGTGACCTACATCGACGAGAAGCGGGACTTCCGCACATACCGCCTGAGTCTCCTGGAGGAGTACGGCTGCTGCAAGGAGCTGGCCAGCCGGCTCCGCTACGCCCGCACTATGGTGGACAAGCTGCTGAGCTCACGCTCGGCCAGCAACCGTCTCAAGGCCTCC
SEQ ID NO:5敲低MOF蛋白的siRNA序列
GUGAUCCAGUCUCGAGUGA
SEQ ID NO:6敲低PLK1蛋白的siRNA序列
AGAUUGUGCCUAAGUCUCU
SEQ ID NO:7γ-tubulin-GFP的DNA序列
ATGCCGAGGGAAATCATCACCCTACAGTTGGGCCAGTGCGGCAATCAGATTGGGTTCGAGTTCTGGAAACAGCTGTGCGCCGAGCATGGTATCAGCCCCGAGGGCATCGTGGAGGAGTTCGCCACCGAGGGCACTGACCGCAAGGACGTCTTTTTCTACCAGGCAGACGATGAGCACTACATCCCCCGGGCCGTGCTGCTGGACTTGGAACCCCGGGTGATCCACTCCATCCTCAACTCCCCCTATGCCAAGCTCTACAACCCAGAGAACATCTACCTGTCGGAACATGGAGGAGGAGCTGGCAACAACTGGGCCAGCGGATTCTCCCAGGGAGAAAAGATCCATGAGGACATTTTTGACATCATAGACCGGGAGGCAGATGGTAGTGACAGTCTAGAGGGCTTTGTGCTGTGTCACTCCATTGCTGGGGGGACAGGCTCTGGACTGGGTTCCTACCTCTTAGAACGGCTGAATGACAGGTATCCTAAGAAGCTGGTGCAGACATACTCAGTGTTTCCCAACCAGGACGAGATGAGCGATGTGGTGGTCCAGCCTTACAATTCACTCCTCACACTCAAGAGGCTGACGCAGAATGCAGACTGTGTGGTGGTGCTGGACAACACAGCCCTGAACCGGATTGCCACAGACCGCCTGCACATCCAGAACCCATCCTTCTCCCAGATCAACCAGCTGGTGTCTACCATCATGTCAGCCAGCACCACCACCCTGCGCTACCCTGGCTACATGAACAATGACCTCATCGGCCTCATCGCCTCGCTCATTCCCACCCCACGGCTCCACTTCCTCATGACCGGCTACACCCCTCTCACTACGGACCAGTCAGTGGCCAGCGTGAGGAAGACCACGGTCCTGGATGTCATGAGGCGGCTGCTGCAGCCCAAGAACGTGATGGTGTCCACAGGCCGAGACCGCCAGACCAACCACTGCTACATCGCCATCCTCAACATCATCCAGGGAGAGGTGGACCCCACCCAGGTCCACAAGAGCTTGCAGAGGATCCGGGAACGCAAGTTGGCCAACTTCATCCCGTGGGGCCCCGCCAGCATCCAGGTGGCCCTGTCGAGGAAGTCTCCCTACCTGCCCTCGGCCCACCGGGTCAGCGGGCTCATGATGGCCAACCACACCAGCATCTCCTCGCTCTTCGAGAGAACCTGTCGCCAGTATGACAAGCTGCGTAAGCGGGAGGCCTTCCTGGAGCAGTTCCGCAAGGAGGACATGTTCAAGGACAACTTTGATGAGATGGACACATCCAGGGAGATTGTGCAGCAGCTCATCGATGAGTACCATGCGGCCACACGGCCAGACTACATCTCCTGGGGCACCCAGGAGCAGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
SEQ ID NO:8H2A-mCherry的DNA序列
ATGTCGGGACGCGGCAAGCAGGGAGGCAAAGCTCGCGCCAAAGCCAAGACCCGCTCTTCTCGTGCCGGTCTCCAGTTCCCCGTGGGCCGAGTGCACCGACTGCTCCGCAAGGGCAACTATGCTGAGCGGGTCGGGGCCGGCGCGCCGGTGTACCTGGCGGCGGTGCTGGAGTACCTGACTGCCGAGATCCTGGAGCTGGCGGGCAACGCCGCCCGCGACAACAAGAAGACCCGCATTATCCCGCGCCACTTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGCTCAACAAGCTGCTGGGCAAAGTAACCATCGCTCAGGGTGGTGTCCTGCCCAACATCCAGGCTGTGCTACTGCCCAAGAAGACCGAGAGTCACCACAAGGCCAAAGGCAAAAAGCTTGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
SEQ ID NO:9构建mCherry-MOF的上游引物
GCTGTACAAGAGGGGGTACCCGATGGCGGCACAGGGAGCT
SEQ ID NO:10构建mCherry-MOF的下游引物
CACACTGGACTAGTGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTG
SEQ ID NO:11构建GFP-PLK1的上游引物
CTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGG
SEQ ID NO:12构建GFP-PLK1的下游引物
GACTGCAGAATTCGAAGCTTTCAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTGGC
SEQ ID NO:13构建HA-MOF的上游引物
GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGCGGCACAGGGAGC
SEQ ID NO:14构建HA-MOF的下游引物
ATCGATTGAATTCGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT
SEQ ID NO:15构建Flag-PLK1的上游引物
CAAGGATGACGATGACAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGC
SEQ ID NO:16构建Flag-PLK1的下游引物
GAGATGAGTTTTTGTTCGGATCCGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTG
SEQ ID NO:17构建His-MOF的上游引物
GACGACGACGACAAGCATATGATGGCGGCACAGGGAGC
SEQ ID NO:18构建His-MOF的下游引物
GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTGCTTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT
SEQ ID NO:19构建GST-PLK1的上游引物
GGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGAGTGCTGCAGTGACTGC
SEQ ID NO:20构建GST-PLK1的下游引物
GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCT
SEQ ID NO:21构建HA-MOF resist的上游引物
GAAGTCATTCAATCACGTGTCAACGACCAGGAGGGCCG
SEQ ID NO:22构建HA-MOF resist的下游引物
GTGATTGAATGACTTCAGCAGAATGCCAGGTGCTATCC
SEQ ID NO:23构建HA-MOF K274R resist的上游引物
GACCATCGCACACTGTACTTTGACGTGGAGCC
SEQ ID NO:24构建HA-MOF K274R resist的下游引物
ACAGTGTGCGATGGTCCAGGAAAAGCTTGGCCA
SEQ ID NO:25GFP的基因序列
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
SEQ ID NO:26mCherry的基因序列
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
SEQ ID NO:27GST的氨基酸序列
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK
SEQ ID NO:28GST-PLK1的氨基酸序列
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSPEFMSAAVTAGKLARAPADPGKAGVPGVAAPGAPAAAPPAKEIPEVLVDPRSRRRYVRGRFLGKGGFAKCFEISDADTKEVFAGKIVPKSLLLKPHQREKMSMEISIHRSLAHQHVVGFHGFFEDNDFVFVVLELCRRRSLLELHKRRKALTEPEARYYLRQIVLGCQYLHRNRVIHRDLKLGNLFLNEDLEVKIGDFGLATKVEYDGERKKTLCGTPNYIAPEVLSKKGHSFEVDVWSIGCIMYTLLVGKPPFETSCLKETYLRIKKNEYSIPKHINPVAASLIQKMLQTDPTARPTINELLNDEFFTSGYIPARLPITCLTIPPRFSIAPSSLDPSNRKPLTVLNKGLENPLPERPREKEEPVVRETGEVVDCHLSDMLQQLHSVNASKPSERGLVRQEEAEDPACIPIFWVSKWVDYSDKYGLGYQLCDNSVGVLFNDSTRLILYNDGDSLQYIERDGTESYLTVSSHPNSLMKKITLLKYFRNYMSEHLLKAGANITPREGDELARLPYLRTWFRTRSAIILHLSNGSVQINFFQDHTKLILCPLMAAVTYIDEKRDFRTYRLSLLEEYGCCKELASRLRYARTMVDKLLSSRSASNRLKAS
SEQ ID NO:29siControl的序列
UUCUCCGAACGUGUCACGU
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