一种干细胞活性因子冻干粉制备方法

技术领域

本发明涉及冻干粉技术领域，具体是一种干细胞活性因子冻干粉制备方法。

背景技术

冻干粉是采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成。干细胞提取物具有美容、抗衰老、活化机体机能、细胞新生、紫外损伤修复及提高肌肤免疫力等功效，为了解决保存时间、有效成分活性等问题，冻干粉这一形式也开始被应用

但是，现有技术中的干细胞活性因子冻干粉制备方法，其干细胞浓缩液直接进行冷冻干燥，使得细胞因子含量损失，细胞活性成分下降。因此，本领域技术人员提供了一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：

S01：获取：提取血液中的成体间充质干细胞；

S02：培养传代：用DMEM或MEM培养基对间充质干细胞进行增殖培养，培养3～4d后出现细胞集落，培养10～12d时，采用低传代方法传代培养间充质干细胞；

S03：收集：当细胞培养最旺盛时，收集间充质干细胞上清液；

S04：浓缩：将收集后的上清液进行过滤处理，后经超滤膜加压浓缩，得到间充质干细胞浓缩液；

S05：制备细胞冻存液：按重量份配比准备所需原料海藻糖、壳聚糖、甘氨酸、甘露醇、多聚精氨酸和丙三醇，混合均匀后，得到细胞冻存液；

S06：冻干：将上述细胞冻存液添加至干细胞浓缩液中，然后进行冷冻干燥，得到干细胞冻干粉。

作为本发明进一步的方案：所述S02中培养为将间充质干细胞置于温度为33～35℃，5％的CO

作为本发明再进一步的方案：所述S02培养传代中细胞密度达到82～85％时进行传代。

作为本发明再进一步的方案：所述S02中间充质干细胞传代倍数为3～8代。

作为本发明再进一步的方案：所述S03中细胞培养最旺盛时指间充质干细胞生长到80～85％汇合度时。

作为本发明再进一步的方案：S04浓缩中的过滤采用0.2～0.4μm滤膜，再经0.1～0.2μm滤膜过滤灭菌。

作为本发明再进一步的方案：S04浓缩中超滤膜超滤截留分子量为3～6KD。

作为本发明再进一步的方案：所述S06中细胞冻存液各原料重量份为海藻糖1～3份、壳聚糖1～3份、甘氨酸0.5～1.5份、甘露醇0.5～1份、多聚精氨酸0.1～0.5份和丙三醇0.1～0.3份。

作为本发明再进一步的方案：所述S06中细胞冻存液在干细胞浓缩液中的浓度为1～5％。

作为本发明再进一步的方案：所述S06中冷冻干燥方式包括初次冷冻、再次冷冻和解析干燥；所述初次冷冻为：在温度-15～-25℃条件下，预冷1～3h；所述再次冷冻为：在温度-60～-70℃条件下，冷冻干燥8～12h；所述解析干燥为：升温至-20～-30℃，冷冻干燥3～5h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，本发明制备方法通过添加细胞冻存液后对干细胞浓缩液进行冷冻，且本发明冷冻干燥在低温下进行，使得蛋白质等成分不会发生变性或失去活力，减少细胞因子含量损失，使得细胞活性成分保持稳定。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，

实施例1

一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，制备方法具体包括以下步骤：

S01：获取：提取血液中的成体间充质干细胞；

S02：培养传代：用DMEM或MEM培养基对间充质干细胞进行增殖培养，培养3d后出现细胞集落，培养10d时，采用低传代方法传代培养间充质干细胞；

S03：收集：当细胞培养最旺盛时，收集间充质干细胞上清液；

S04：浓缩：将收集后的上清液进行过滤处理，后经超滤膜加压浓缩，得到间充质干细胞浓缩液；

S05：制备细胞冻存液：按重量份配比准备所需原料海藻糖、壳聚糖、甘氨酸、甘露醇、多聚精氨酸和丙三醇，混合均匀后，得到细胞冻存液；

S06：冻干：将上述细胞冻存液添加至干细胞浓缩液中，然后进行冷冻干燥，得到干细胞冻干粉。

进一步的，S02中培养为将间充质干细胞置于温度为33℃，5％的CO

再进一步的，S02培养传代中细胞密度达到82％时进行传代。

再进一步的，S02中间充质干细胞传代倍数为3代。

再进一步的，S03中细胞培养最旺盛时指间充质干细胞生长到80％汇合度时。

再进一步的，S04浓缩中的过滤采用0.2μm滤膜，再经0.1μm滤膜过滤灭菌。

再进一步的，S04浓缩中超滤膜超滤截留分子量为3KD。

再进一步的，S06中细胞冻存液各原料重量份为海藻糖1份、壳聚糖1份、甘氨酸0.5份、甘露醇0.5份、多聚精氨酸0.1份和丙三醇0.1份。

再进一步的，S06中细胞冻存液在干细胞浓缩液中的浓度为1％。

再进一步的，S06中冷冻干燥方式包括初次冷冻、再次冷冻和解析干燥；初次冷冻为：在温度-15℃条件下，预冷1h；再次冷冻为：在温度-60℃条件下，冷冻干燥8h；解析干燥为：升温至-20℃，冷冻干燥3h。

实施例2

一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，制备方法具体包括以下步骤：

S01：获取：提取血液中的成体间充质干细胞；

S02：培养传代：用DMEM或MEM培养基对间充质干细胞进行增殖培养，培养4d后出现细胞集落，培养12d时，采用低传代方法传代培养间充质干细胞；

S03：收集：当细胞培养最旺盛时，收集间充质干细胞上清液；

S04：浓缩：将收集后的上清液进行过滤处理，后经超滤膜加压浓缩，得到间充质干细胞浓缩液；

S05：制备细胞冻存液：按重量份配比准备所需原料海藻糖、壳聚糖、甘氨酸、甘露醇、多聚精氨酸和丙三醇，混合均匀后，得到细胞冻存液；

S06：冻干：将上述细胞冻存液添加至干细胞浓缩液中，然后进行冷冻干燥，得到干细胞冻干粉。

进一步的，S02中培养为将间充质干细胞置于温度为35℃，5％的CO

再进一步的，S02培养传代中细胞密度达到85％时进行传代。

再进一步的，S02中间充质干细胞传代倍数为8代。

再进一步的，S03中细胞培养最旺盛时指间充质干细胞生长到85％汇合度时。

再进一步的，S04浓缩中的过滤采用0.4μm滤膜，再经0.2μm滤膜过滤灭菌。

再进一步的，S04浓缩中超滤膜超滤截留分子量为6KD。

再进一步的，S06中细胞冻存液各原料重量份为海藻糖3份、壳聚糖3份、甘氨酸1.5份、甘露醇1份、多聚精氨酸0.5份和丙三醇0.3份。

再进一步的，S06中细胞冻存液在干细胞浓缩液中的浓度为5％。

再进一步的，S06中冷冻干燥方式包括初次冷冻、再次冷冻和解析干燥；初次冷冻为：在温度-25℃条件下，预冷3h；再次冷冻为：在温度-70℃条件下，冷冻干燥12h；解析干燥为：升温至-30℃，冷冻干燥5h。

实施例3

一种干细胞活性因子冻干粉制备方法，制备方法具体包括以下步骤：

S01：获取：提取血液中的成体间充质干细胞；

S02：培养传代：用DMEM或MEM培养基对间充质干细胞进行增殖培养，培养3d后出现细胞集落，培养11d时，采用低传代方法传代培养间充质干细胞；

S03：收集：当细胞培养最旺盛时，收集间充质干细胞上清液；

S04：浓缩：将收集后的上清液进行过滤处理，后经超滤膜加压浓缩，得到间充质干细胞浓缩液；

S05：制备细胞冻存液：按重量份配比准备所需原料海藻糖、壳聚糖、甘氨酸、甘露醇、多聚精氨酸和丙三醇，混合均匀后，得到细胞冻存液；

S06：冻干：将上述细胞冻存液添加至干细胞浓缩液中，然后进行冷冻干燥，得到干细胞冻干粉。

进一步的，S02中培养为将间充质干细胞置于温度为34℃，5％的CO

再进一步的，S02培养传代中细胞密度达到83％时进行传代。

再进一步的，S02中间充质干细胞传代倍数为6代。

再进一步的，S03中细胞培养最旺盛时指间充质干细胞生长到82％汇合度时。

再进一步的，S04浓缩中的过滤采用0.3μm滤膜，再经0.2μm滤膜过滤灭菌。

再进一步的，S04浓缩中超滤膜超滤截留分子量为3KD。

再进一步的，S06中细胞冻存液各原料重量份为海藻糖2份、壳聚糖2份、甘氨酸1份、甘露醇0.7份、多聚精氨酸0.3份和丙三醇0.2份。

再进一步的，S06中细胞冻存液在干细胞浓缩液中的浓度为3％。

再进一步的，S06中冷冻干燥方式包括初次冷冻、再次冷冻和解析干燥；初次冷冻为：在温度-20℃条件下，预冷2h；再次冷冻为：在温度-65℃条件下，冷冻干燥10h；解析干燥为：升温至-25℃，冷冻干燥4h。

本发明制备方法通过添加细胞冻存液后对干细胞浓缩液进行冷冻，且本发明冷冻干燥在低温下进行，使得蛋白质等成分不会发生变性或失去活力，减少细胞因子含量损失，使得细胞活性成分保持稳定，解决了现有技术中的制备方法制得的冻干粉细胞因子含量损失，细胞活性成分下降的问题。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。