耐受和高效利用甲醇的假单胞菌

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种耐受和利用高浓度甲醇的菌株，其为假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)MJMm-2，以及所述菌株的用途。

背景技术

由于二氧化碳结构稳定、能量低，其高值化利用充满挑战。将二氧化碳选择性加氢制备成甲醇能够实现其高效转化。近年来，国内二氧化碳加氢制甲醇项目取得了较大进展，已建成全球最大规模的二氧化碳加氢制甲醇工业试验装置。在此背景下，甲醇不仅被视为化石燃料的替代品，还是极具潜力的非糖基碳源，可以进一步拓展生物炼制原料，满足人们日益增长的生活需要。利用微生物细胞工厂以甲醇为碳源已被用于生产多种高附加值化学品，其中包括脂肪酸及其衍生物等。

随着石化资源过度消耗、环境问题日趋严重以及全球气候变暖，节能减排已成为全球发展共识。研究表明，在导致全球变暖的温室气体中，甲烷(CH

尽管目前全球甲醇生产能力相对过剩，并且不排除由于某种原因引起甲醇市场的波动，但由于我国有着丰富的煤炭资源，作为C1化工基石产品的甲醇，还应不断开拓其应用领域，大力生产和发展其下产品，从而推动整个甲醇工业的发展。

目前常用的利用甲醇作为碳源的各类微生物中普遍存在以下问题限制其作为底盘细胞用于工业生产宿主菌的开发：

(1)耐受甲醇浓度低，一般甲醇菌培养过程中只能耐受0.5％-1％体积浓度的甲醇，更高浓度的甲醇对菌生长产生较大的抑制；

(2)生长速度较慢，以甲醇作为唯一碳源的的各类甲基营养菌在复合培养基中生长速率较慢，会大大提高发酵周期，增加成本，这也是很难成为合适的底盘细胞的原因之一；

(3)甲醇降解速度较慢，很多微生物通过驯化诱变等处理也可以获得比较高的耐受甲醇能力，但是同时很难在既能耐受高浓度甲醇的基础上还能快速降解甲醇。

因此，本领域亟需开发一种能够耐受甲醇浓度高、生长速度快、快速降解甲醇的细菌菌种。

[参考文件]

1.中国专利申请CN 104774792A；

2.姜加良等，以甲醇为碳源甲烷氧化细菌的高密度培养，化学工程师，2013年第2期，5-8和14页。

发明内容

具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题：

1.一种耐高浓度甲醇的菌株，其中所述耐高浓度甲醇的菌株为假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)MJMm-2，其保藏号为CGMCC NO:26412，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据项1所述的菌株，其中所述菌株耐受的甲醇(V/V)浓度为高至1％、高至2％、高至3％、高至4％、高至5％、高至6％、高至7％或高至8％。

3.根据项1或2所述的菌株，其中所述菌株能够在浓度为高至1％、高至2％、高至3％、高至4％、高至5％、高至6％、高至7％或高至8％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长。

4.根据项1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株在浓度为高至5％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，OD达6以上。

5.根据项1-4中任一项所述的菌株，其中所述菌株在浓度为高至8％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长72小时后，OD达3.2以上。

6.根据项1-5中任一项所述的菌株，其中所述菌株在浓度为高至5％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，能够将甲醇浓度降低至0.21以下％。

7.根据项1-6中任一项所述的菌株用于以甲醇为唯一碳源生产产物的用途，所述产物选自下组：外源蛋白、氨基酸和维生素。

8.一种用于对经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株进行筛选前复壮的培养基组合物，其包含如下组分：

(1)酵母浸粉；

(2)氯化钠；

(3)硫酸铵；

(4)三水合磷酸氢二钾；和

(5)甲醇。

9.根据项8所述的培养基组合物，其中酵母浸粉的含量为10-20g/L，氯化钠的含量为5-15g/L，硫酸铵的含量为1-5g/L，三水合磷酸氢二钾的含量为5-10g/L，甲醇的含量为0.3-8％(V/V)。

10.根据项9所述的培养基组合物，其中酵母浸粉的含量为15g/L，氯化钠的含量为10g/L，硫酸铵的含量为4g/L，三水合磷酸氢二钾的含量为8g/L，甲醇的含量为0.5-8％(V/V)。

11.根据项8-10中任一项所述的培养基组合物，其中经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株在经过所述培养基组合物复壮后，能够在浓度为高至1％、高至2％、高至3％、高至4％、高至5％、高至6％、高至7％或高至8％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长。

12.根据项8-11中任一项所述的培养基组合物，其中经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株在经过所述培养基组合物复壮后，在浓度为高至5％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，OD达6以上。

13.根据项8-12中任一项所述的培养基组合物，其中经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株在经过所述培养基组合物复壮后，在浓度为高至8％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长72小时后，OD达3.2以上。

为使本发明所述的技术方案更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步的说明。

附图说明

图1显示对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果。其中泳道1为：MJCg-1(谷氨酸棒状杆菌对照菌株)；泳道2为：MJMm-2(耐高浓度甲醇菌株)；泳道M为：标记物DL2000，其中条带分别指示2000、1000、750、500、250、100bp；

图2所示为假单胞菌MJMm-2摇瓶方案I中的发酵生长及甲醇降解图；

图3所示为假单胞菌MJMm-2摇瓶方案II中的发酵生长及甲醇降解图；

图4所示为空白对照实验方案III摇瓶发酵生长及甲醇降解图；

1.本发明的耐受和利用高浓度甲醇的菌株

在一个方面，本发明提供一种耐高浓度甲醇的菌株，其中所述耐高浓度甲醇的菌株为假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)MJMm-2。在一个实施方案中，所述菌株于2023年1月6日以保藏号CGMCC NO:26412保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。在一个实施方案中，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示。在一个实施方案中，所述菌株耐受的甲醇(V/V)浓度为高至1％、高至1.5％、高至2％、高至2.5％、高至3％、高至3.5％、高至4％、高至4.5％、高至5％、高至5.5％、高至6％、高至6.5％、高至7％、高至7.5％或高至8％。在一个实施方案中，所述菌株能够在浓度为高至1％、高至1.5％、高至2％、高至2.5％、高至3％、高至3.5％、高至4％、高至4.5％、高至5％、高至5.5％、高至6％、高至6.5％、高至7％、高至7.5％或高至8％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长。在一个实施方案中，所述菌株在浓度为高至5％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，OD达2以上、3以上、4以上、5以上或6以上。在一个实施方案中，所述菌株在浓度为高至8％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长72小时后，OD达2以上、3以上。在一个实施方案中，所述菌株在浓度为高至5％(V/V)的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，能够将甲醇浓度降低至0.21％以下。

2.本发明的耐受和利用高浓度甲醇的菌株的用途

在一个方面，本发明提供一种本发明的菌株用于以甲醇为唯一碳源生产产物的用途。在一个实施方案中，所述产物选自下组：外源蛋白、氨基酸和维生素。

3.本发明的复壮培养基

在一个方面，本发明提供一种用于对经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株进行筛选前复壮的培养基组合物。在一个方面，本发明提供一种用于对经紫外照射后的耐高浓度甲醇的菌株进行筛选前复壮的培养基组合物。在一个实施方案中，所述培养基组合物包含如下组分：(1)酵母浸粉；(2)氯化钠；(3)硫酸铵；(4)三水合磷酸氢二钾；和(5)甲醇。在一个实施方案中，所述培养基组合物中的酵母浸粉的含量为10-20g/L，氯化钠的含量为5-15g/L，硫酸铵的含量为1-5g/L，三水合磷酸氢二钾的含量为5-10g/L，甲醇的含量为0.3-8％(V/V)。在一个实施方案中，所述培养基组合物中的酵母浸粉的含量为15g/L，氯化钠的含量为10g/L，硫酸铵的含量为4g/L，三水合磷酸氢二钾的含量为8g/L，甲醇的含量为0.5-8％(V/V)。在一个实施方案中，本发明的菌株经紫外照射后使用所述培养基组合物复壮，复壮后的所述菌株能够在浓度(V/V)为高至1％、高至1.5％、高至2％、高至2.5％、高至3％、高至3.5％、高至4％、高至4.5％、高至5％、高至5.5％、高至6％、高至6.5％、高至7％、高至7.5％或高至8％的甲醇作为唯一碳源的培养基中生长。在一个实施方案中，本发明的菌株经紫外照射后使用所述培养基组合物复壮，复壮后的所述菌株在浓度为高至5％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，OD达2以上、3以上、4以上、5以上或6以上。在一个实施方案中，本发明的菌株经紫外照射后使用所述培养基组合物复壮，复壮后的所述菌株在浓度为高至8％的甲醇(V/V)作为唯一碳源的培养基中生长96小时后，OD达2以上、3以上、4以上、5以上或6以上。

4.本发明的优势和有益效果

本发明耐受和利用高浓度甲醇的假单胞菌属菌株至少具有如下优势：

(1)本发明筛选的假单胞菌可耐受高至8％体积浓度的甲醇，并可在高至5％体积浓度的甲醇中快速生长；

(2)能以甲醇为唯一碳源生长；

(3)在以甲醇为唯一碳源的培养基中，摇瓶发酵96小时OD超过6，具备工业化高密度发酵的基础；

(4)在含高至5％体积浓度的甲醇为唯一碳源的培养基中能够快速降解甲醇，培养96小时后将甲醇浓度降低至0.21％以下；

(5)本发明采用的复壮培养基不仅用于从初始样品中筛选出能够耐受低浓度甲醇的假单胞菌菌种，并可以对初筛的菌种进行有效的复壮，复壮后的假单胞菌可经历多轮紫外诱变和甲醇驯化。

假单胞菌作为革兰氏阴性杆菌是常用的工程底盘基因工程菌，细胞基因改造和代谢途径调控方面已经有大量的研究，是一种比较可靠和容易操作的甲醇宿主菌。然而，现有的耐甲醇假单胞菌对甲醇的耐受浓度并不高，而且降解甲醇的速率也比较缓慢，这也限制了其很难成为主流的代谢甲醇的工程宿主菌。与目前主流甲醇菌(例如扭脱甲基杆菌)相比，本发明的假单胞菌MJMm-2最高可耐受8％体积浓度的甲醇，在以甲醇为唯一碳源的培养基中，摇瓶发酵96小时OD超过6.0，在不同浓度的甲醇培养基中都能快速降解甲醇，在含5％体积浓度的甲醇的培养基中培养96小时后，可将甲醇浓度降至0.2％，说明假单胞菌MJMm-2很适合作为工程宿主菌改造成各类代谢菌种—以甲醇为碳源生产各类外源蛋白、氨基酸、维生素等产物。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施例并不能被理解为是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对这些具体实施例作出多种变更或修改，所述变更和修改后的实施方案仍落入本发明的保护范围。

下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.筛选初始耐甲醇菌

取10g土壤，用100ml蒸馏水进行稀释，取200μl稀释后菌液，加入到50mL复壮培养基A1(0.5％甲醇)中，于30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时。取少量菌液，在固体培养基A2(1％甲醇)中划线，于30℃，培养箱培养48小时后，挑取菌落较大的透明的单菌落，接种于另一种复合培养基A3试管(2％甲醇)上30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，获得纯菌液，为初始待驯化筛选甲醇菌液。

复壮培养基A1

酵母浸粉：15g/L，氯化钠：10g/L，硫酸铵：4g/L，三水合磷酸氢二钾：8g/L，甲醇：0.5％(V/V)。

本发明的复壮培养基(下同)主要作用为：从初始样品(土壤)中筛选出能够耐受低浓度甲醇的菌种，以及对诱变筛选后的菌株进行复壮活性。

固体培养基A2

酵母浸粉：20g/L，氯化钠：10g/L，硫酸铵：4g/L，三水合磷酸氢二钾：8g/L，甲醇：1％(V/V)，琼脂：20g/L。

本发明的固体培养基(下同)主要作用为：对筛选后的菌种进行平板分离阳性菌落，筛选出活力较强的单菌落。

复合培养基A3

氯化钠：2g/L，尿素：2g/L，硫酸铵：6g/L，三水合磷酸氢二钾：8g/L，甲醇：2％(V/V)，谷氨酸钠：2g/L，六水合氯化镁：0.5g/L，一水合硫酸锰：0.1g/L，硫酸铜：0.01g/L，EDTA:0.05g/L，氯化钙：0.1g/L，硫酸亚铁：0.15g/L，VB5:0.1g/L，VB1:0.1g/L，VB7:0.05g/L。

本发明的复合培养基(下同)主要作用为：对筛选出的甲醇菌株验证是否可以以甲醇为唯一碳源生长。

实施例2.甲醇菌筛选驯化流程

(1)第一代耐受5％甲醇的驯化甲醇菌株的获得

取初始待驯化筛选甲醇菌液200μl，加入到50mL复壮培养基B1(2％(V/V)甲醇，其他同A1)中，于30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，得到培养液。

取200μl培养液分别涂布在不同甲醇浓度的固体培养基B2中(甲醇(V/V)浓度分别为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％和12％，其他同A2，10种不同浓度梯度平板各两块)。固体平板涂布好后放于超净工作台中，开启紫外灯照射诱变处理，照射时间为60秒，紫外灯功率为30W。紫外灯照射诱变处理结束后将诱变的固体平板放置在培养箱，30℃，培养48小时后观察平板菌落生长情况，发现第一轮紫外诱变平板中，2％，3％，4％，5％，这几个甲醇浓度平板有菌落出现，其它没有菌落出现，说明5％甲醇浓度平板菌落获得了甲醇耐受性正向突变。

挑取5％甲醇浓度平板菌落接种于50mL复壮培养基C1(5％(V/V)甲醇，其他同A1)中，进行复壮富集培养，30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，得到第一代耐受5％甲醇的驯化甲醇菌株。

(2)第二代耐受8％甲醇的驯化甲醇菌株的获得

取200μl第一代耐受5％甲醇的驯化甲醇菌培养液分别涂布在不同甲醇浓度的固体培养基C2中(甲醇(V/V)浓度分别为5％、6％、8％、10％和12％，其他同A2，5种不同浓度梯度平板各两块)。固体平板涂布好后放于超净工作台中，开启紫外灯照射进行第二轮诱变处理，照射时间为60秒，紫外灯功率为30W。紫外灯照射诱变处理结束后将诱变的固体平板放置在培养箱，30℃，培养48小时后观察平板菌落生长情况，发现第二轮紫外诱变平板中，5％、6％，8％三个浓度中有菌落出现，5％和6％中菌落比较多，生长正常，8％中只有几个微小的菌落，说明第二轮紫外诱变也获得了甲醇耐受性正向突变。挑取8％甲醇浓度平板小菌落接种于50mL复壮培养基D1(8％(V/V)甲醇，其他同A1)中，进行复壮富集培养，30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，得到第二代耐受8％甲醇的驯化甲醇菌株。

(3)耐受高浓度甲醇菌株MJMm-2的获得

取200μl第二代耐受8％甲醇的驯化甲醇菌培养液分别涂布在不同甲醇浓度的固体培养基D2中(甲醇(V/V)浓度分别为8％、10％和12％，其他同A2，3种不同浓度梯度平板各两块)。固体平板涂布好后放于超净工作台中，开启紫外灯照射进行第三轮诱变处理，照射时间为60秒，紫外灯功率为30W。紫外灯照射诱变处理结束后将诱变的固体平板放置在培养箱，30℃，培养48小时后观察平板菌落生长情况，发现第三轮紫外诱变平板中，10％，12％浓度没有菌落出现，8％浓度中的菌落比第二轮多，生长正常，说明第三轮紫外诱变没有获得甲醇耐受性正向突变，但是菌种活力比第二代耐受8％甲醇的驯化甲醇菌要强。挑取第三轮紫外诱变8％甲醇浓度平板菌落接种于50mL复壮培养基D1(8％(V/V)甲醇，其他同A1)中，进行复壮富集培养，30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，得到第三代耐受8％甲醇的驯化甲醇菌株。取第三代耐受8％甲醇的驯化甲醇液200μl，加入到50mL复合培养基B3(8％(V/V)甲醇，其他同A3)中，于30℃、200rpm条件下，摇床培养48小时，得到培养液。此菌株即为最终驯化诱变得到的耐受高浓度甲醇菌株，命名为MJMm-2。

实施例3.耐受高浓度甲醇菌株菌种鉴定

菌种鉴定原理：16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，16S rRNA其大小在1500bp左右，所代表的信息量适中，因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因，并进行DNA测序，与GenBank中的已知序列进行同源性比对，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。

菌种鉴定步骤

1.PCR扩增：

16s rDNA利用引物27F/1492R进行PCR扩增。

2.PCR产物纯化：

对单一条带PCR产物进行ExoSAP-IT纯化。

3.测序：

Sanger测序法，双向测序。

鉴定结果如图1所示。对泳道1和2中的单一条带分别进行纯化后，利用Sanger测序法进行双向测序。

其中，泳道1中的谷氨酸棒状杆菌对照菌株MJCg-1的双向测序拼接序列如下所示(SEQ ID NO:1)：

CGCTGAACCGGAGCTTGCTTTGGTGGATGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTACACTTTG

GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATTCACACCACCGTAGGGGTGGTGTGGAAAGCCTTGTGCGGT

GTGGGATGAGCCTGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGA

GAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAA

TGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGACG

AAGCCTTATGGTGACGGTACCTGGAAAAAAAGCACCGGCTAACTACCTGCCAGCAGCCGCGGTAATACCTAAGGTG

CGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATCCCGGGGCTT

AACTTCGGGCGTGCAGGCGATACGGGCATAACTTGAGTGCTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAA

ATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCA

TGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTAGGGGTCTTCCACG

ACTTCTGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTG

ACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATG

GACCGGATCGGCGTAGAGATACGTTTTCCCTTGTGGTCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTC

GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATGTTGCCAGCACATTGTGGTGGGTACTCAT

GAGAGACTGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCA

CACATGCTACAATGGTCGGTACAGCGAGTTGCCACACCGTGAGGTGGAGCTAATCTCTTAAAGCCGGCCTCAGTTC

GGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATAC

GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCC

泳道2中的耐高浓度甲醇菌株MJMm-2的双向测序拼接序列如下所示(SEQ ID NO:2)：

CCGTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTG

TACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGT

TGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGA

CCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGT

CACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTT

AACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCTAT

CTCTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCG

CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTT

AGCTGCGCCACTAAAAGCTCAAGGCTTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAA

TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCT

TCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGTCAGTCAGTTTTGAA

TGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAT

TCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAAC

GTCAAAACAATCACGTATTAGGTAACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCAC

ACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGAC

CGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCA

CCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTA

TGCGGTATTAGCGTTCGTTTCCGAACGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCC

GCTCTCAAGAGAAGCAAGCTTCTCTCTACCGCTCGACTTGCATGGTAGtCC

菌种鉴定结果如下表1所示。

表1.菌种鉴定结果

对上述菌种鉴定结果进行分析，可知：

(1)驯化筛选出来的耐高浓度甲醇菌株16SrDNA鉴定为假单胞菌。

(2)用谷氨酸棒状杆菌对照菌株16S rDNA鉴定为谷氨酸棒状杆菌，鉴定方法真实有效。

实施例4.耐高浓度甲醇的假单胞菌MJMm-2的摇瓶发酵实验方案I

取200μl假单胞菌MJMm-2接种于10/30mL试管筛选培养基D1(8％(V/V)甲醇，其他同A1)，30℃，200RPM培养48小时后，取5mL培养液接种于50/250mL带挡板摇瓶复合培养基B3(8％(V/V)甲醇，其他同A3)，30℃，200RPM培养，每24小时取样检测发酵液OD

实施例5.耐高浓度甲醇的假单胞菌MJMm-2的摇瓶发酵实验方案II

取200μl假单胞菌MJMm-2接种于10/30mL试管筛选培养基E1(5％(V/V)甲醇，其他同A1)，30℃，200RPM培养24小时后，取5mL培养液接种于50/250mL带挡板摇瓶复合培养基C3(5％(V/V)甲醇，其他同A3)，30℃，200RPM培养，每24小时取样检测发酵液OD

对比例1.空白对照的摇瓶发酵实验方案III

取200μl无菌水(空白对照实验，不接菌株)接种于10/30mL试管复壮培养基D1(8％(V/V)甲醇，其他同A1)，30℃，200RPM培养24小时后，取5mL培养液接种于50/250mL带挡板摇瓶复合培养基B3(8％(V/V)甲醇，其他同A3)，30℃，200RPM培养，每24小时取样检测发酵液OD

由上述实施例和对比例，至少可得到如下实验结论：

(1)驯化筛选出来的耐高浓度甲醇菌株MJMm-2通过16S rDNA鉴定为假单胞菌；

(2)甲醇菌株MJMm-2摇瓶不同浓度的甲醇发酵实验验证，可以以甲醇为唯一碳源生长，同时可以降解甲醇，最高可以耐受甲醇体积浓度为8％，48小时后，甲醇降解百分比超过42％。

(3)甲醇菌株MJMm-2在含5％(V/V)甲醇的培养基中摇瓶培养96小时后，可将甲醇浓度降低至0.21％(V/V)，降解了95.8％，继续补加5％(V/V)的甲醇，再经过48小时后可将甲醇浓度再次降低至0.53％(V/V)，降解了89.8％。

综上，本发明的耐高浓度甲醇菌株MJMm-2不仅能耐受8％体积浓度的甲醇，且可在5％体积浓度的甲醇中快速生长，并降解甲醇89％以上，非常适合应用于以甲醇为唯一碳源的工业化高密度发酵。

以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对上述披露的技术内容作出多种变更或修改，这些变更和修改均落入本发明的保护范围。