一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物微生物发酵技术领域。更具体地，涉及一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品及其制备方法和应用。

背景技术

随着年龄的增长，环境问题的日益严重以及来自生活和工作压力的逐步加大，皮肤衰老在所难免。皮肤衰老是人体衰老固液的生理机制和外界风吹日晒、环境污染等损害共同作用的结果。皮肤衰老的临床症状是皮肤较易干燥，皮肤弹性变差，皮肤变薄，出现皱纹；皮脂腺活力减低，分泌减少；长出色素斑；皮肤受伤后复原变慢，而且较容易发生淤青。如何有效抵抗皮肤衰老，保持青春与魅力是爱美人士不得不面对的难题。

皮肤微循环是细胞和组织之间参与物质、能量、生物信息互相交换的体系，包括直径小于150μm的血管，即动脉，小静脉，淋巴管和动静脉吻合。微循环能够为皮肤的角质形成细胞、成纤维细胞提供氧气和营养成分，促进表皮修复(角质形成细胞更新代谢加快)和成纤维细胞的更新代谢，促使形成更多胶原蛋白，减缓皮肤衰老。而当出现微循环损伤时：(1)血流瘀滞无法给细胞提供营养，导致表皮各层因无法获得营养而受损，皮肤会产生红血丝；(2)血管内静脉压升高，造成血管内水顺压力差流出血管后进入组织内并在组织内蓄积，造成水肿；(3)组织细胞出现缺血损伤，线粒体内氧化磷酸化受阻，ATP大量分解，产生大量自由基，自由基对健康细胞攻击又加重细胞损伤，导致细胞结构和功能的改变，会一定程度上加速皮肤的衰老，所以有效避免和改善皮肤微循环，能够保持皮肤“健康态”，能有效缓解皮肤衰老。

目前，改善皮肤微循环的方法有：药物改善、食疗改善、运动改善，其中药物改善主要是以扩张微血管，加快血流速度，从而增加血流量为主；而采用食疗和运动改善，周期长，效果甚微。目前市场上护肤品种类繁多，但很多护肤品需要添加防腐剂或者香精成分，这些化学试剂对人体具有一定的刺激，容易导致皮肤过敏，存在安全隐患。如现有技术公开一种促进皮肤微循环的组合物，以松花粉提取物、杜氏藻提取物、绣球菌提取物和燕麦仁提取物作为活性成分，采用天然的植物提取物，成分安全，能有效促进皮肤的血液微循环，加速皮肤自我更新，启动抗老修复，但其成分复杂，制备成分高，效果还有待提升。因此，亟需开发出更多、具有更好作用效果的天然不刺激能改善皮肤微循环，并具有抗衰老功能的天然植物成分的产品，替代传统药妆产品，从根本上调整和改善皮肤表面微循环，作用温和无刺激性，从而解决皮肤问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品及其制备方法和应用。

本发明的目的是提供一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品。

本发明另一目的是提供所述茶叶发酵产品的制备方法。

本发明又一目的是提供所述茶叶发酵产品的应用。

本发明再一目的是提供一种抗衰老、抗炎、调节血管收缩、促进皮肤屏障修复和/或改善皮肤微循环的化妆品或护肤品。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品，为由茶叶提取液、哌可酸、发酵菌发酵后得到的发酵产物。

本发明采用的茶叶属于绿色天然产物，具有较低毒性，适合应用于护肤品中。大量研究证明茶叶含有的茶褐素和多酚等物质，具有显著的抗氧化、抗炎、抗皱功效。

哌可酸(Pipecolic acid，PA)是一种有机化合物，其化学式为C

本发明采用微生物发酵技术，利用微生物细胞或细胞内的酶催化反应体系对植物原料中的活性物进行结构修饰和改造，从而获得有价值的发酵液。植物成分发酵后得到的活性物质含量更高，经微生物转化后分子量更小，对我们皮肤微生态的调节效果更佳。

本发明通过在天然植物茶叶提取液中添加哌可酸(PA)混合后，接种发酵菌进行发酵，制备得到茶叶发酵产品；所述茶叶发酵产品不仅能够改善皮肤微循环，还具有很好的抗衰老作用。本发明提供的茶叶发酵产品很好地保留了茶叶中的有效成分，并与哌可酸协同发酵菌发酵后，实现益生菌与茶叶的双向发酵，促使茶叶发酵产品具有较好的保湿、抗衰老、抗炎、促进皮肤屏障修复等护肤效果；且PA与茶叶提取液复配使用还具有增效作用，进一步提升了其效果，通过调控TRPV4信号通路，增加内皮Ca

进一步地，所述茶叶提取液为将茶叶干燥粉碎后采用水提取法，加热回流提取得到的茶叶提取液。

进一步地，所述哌可酸为浓度为0.7mol/L～1mol/L的哌可酸水溶液，加入量为茶叶提取液体积的14％～34％。

进一步地，所述发酵菌为枯草芽孢杆菌，发酵菌的浓度为10

更优选地，所述发酵菌的接种量为2％。

本发明提供茶叶发酵产品的制备方法，含有以下步骤：

S1.取新鲜茶叶清洗去杂，干燥，粉碎过筛，加入料液比1：8-10的纯水，浸泡，灭菌，加热回流提取，得到茶叶提取液；

S2.在茶叶提取液中加入哌可酸溶液混合，即得含有PA的茶叶提取液；

S3.向含有PA的茶叶提取液中接入发酵菌，进行动态发酵，发酵结束后灭菌，过滤，即得茶叶发酵产品。

优选地，步骤S1中干燥为在80～100℃下干燥处理1～3h。

优选地，步骤S1中茶叶采用新鲜茶叶，包括但不限于红茶。

优选地，步骤S3中动态发酵条件为：在35～40℃恒温搅拌36～90h，搅拌转速为100～150转/分钟。

更优选地，步骤S3中动态发酵条件为：在37℃恒温搅拌72h，搅拌转速为120转/分钟。

本发明提供茶叶发酵产品在制备抗衰老、抗炎、调节血管收缩、促进皮肤屏障修复和/或改善皮肤微循环的化妆品或护肤品中的应用。

本发明还提供一种抗衰老、抗炎、调节血管收缩、促进皮肤屏障修复和/或改善皮肤微循环的化妆品或护肤品，含上述茶叶发酵产品。

优选地，所述化妆品或护肤品中按重量百分数计含2～5％茶叶发酵产品。

更优选地，所述化妆品或护肤品为精华、霜、乳液、水或膏状产品，进一步地还含有其他本领域常用的基础成分，如保湿剂、抗氧化剂、修护剂、抗菌剂、滋润剂等，具体地可以添加：对羟基苯乙酮，1,2-己二醇，卡波姆941，三乙醇胺，EDTA二钠等。

进一步优选地，所述化妆品或护肤品中按重量百分数计含有羟基苯乙酮0.4％，1,2-己二醇0.6％，卡波姆941 0.1％，三乙醇胺0.1％，EDTA二钠0.02％，余量为去离子水，混合均匀后制备得到红茶精华液。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种改善皮肤微循环的抗衰老茶叶发酵产品及其制备方法，本发明提供的茶叶发酵产品为由茶叶提取液、哌可酸、发酵菌发酵后得到的发酵产物；在提取茶叶有效成分的同时，进一步添加哌可酸，在益生菌的发酵下，制备得到的茶叶发酵产品具有较好的改善微循环、抗衰老、抗炎、促进皮肤屏障修复等护肤效果。本发明将PA与茶叶提取液复配使用具有增效作用，能通过调控TRPV4信号通路，增加内皮Ca

本发明使用发酵提取法的优势是能有效简化生产工艺，使反应过程在温和的条件下进行。同时，发酵提取法还可以改变原料成分分子结构，提升原料功效，降低毒性和刺激性，优化色泽、味道等优势，是一种较理想的中药提取新工艺，有利于推广应用。

附图说明

图1为检测细胞表达TRPV4、TRPV3、TRPM8基因的结果图；

图2为肌球蛋白轻链激酶的表达水平图；

图3为角质细胞的炎症因子COX-2的表达水平图；

图4为I型胶原蛋白的分泌检测结果图；

图5为透明质酸的分泌检测结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中采用的枯草芽孢杆菌(保藏编号为MGNA-B207)、双歧杆菌(保藏编号为ATCC-15696)均为实验室保藏菌株；

所使用的HaCaT细胞、角质细胞、人成纤维细胞HSF均为本发明实验室保藏使用的细胞系。

实施例1茶叶发酵产品的制备

1、含有PA的茶叶提取液的制备

将茶叶进行清洗，去除污泥和灰尘、杂质后，在90℃下干燥处理1h，去除水分，得到干燥后的茶叶处理物；将干燥后的茶叶粉碎，过2号筛(850±29um)；以1：8-10的料液比，分别加入纯水，浸泡2h，再经过121℃蒸汽灭菌，冷却并降至室温，再进行多次回流提取有效成分，得茶叶提取液。

取适量的哌可酸(PA)，溶解于纯水中，配置成浓度0.7mmol/L的PA溶液。

随后，向茶叶提取液中加入占茶叶提取液体积34％的PA溶液，得到含有PA的茶叶提取液。

2、发酵菌液的制备

(1)菌种活化：挑取枯草芽孢杆菌的菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后菌液；

(2)菌种纯化：将活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后菌种；

(3)菌种扩大培养：将纯化后的菌种接种到BS培养基(pH值为7.0)中，在37℃的培养箱中静置培养，当OD值＝0.6-1.0时，菌种处在对数期，配制浓度为10

3、茶叶发酵产品的制备

取适量含有PA的茶叶提取液，接入占含有PA的茶叶提取液体积2％的发酵菌液，在37℃恒温搅拌72h，搅拌转速为120转/分钟；再经过121℃蒸汽灭菌，降至室温后，采用8～12μm滤板过滤，即得茶叶发酵产品。

实施例2茶叶发酵产品的制备

1、含有PA的茶叶提取液的制备

将茶叶进行清洗，去除污泥和灰尘、杂质后，在90℃下干燥处理1h，去除水分，得到干燥后的茶叶处理物；将干燥后的茶叶粉碎，过2号筛(850±29um)；以1：8-10的料液比，分别加入纯水，浸泡2h，再经过121℃蒸汽灭菌，冷却并降至室温，再进行多次回流提取有效成分，即得茶叶提取液。

取适量的PA，溶解于纯水中，配置成浓度0.7mmol/L的PA溶液。

在茶叶提取液中加入与茶叶提取液体积比20％的PA溶液。得到含有PA的茶叶提取液。

3、发酵菌液的制备

(1)菌种活化：挑取菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后菌液；

(2)菌种纯化：将活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后菌种；

(3)菌种扩大培养：将纯化后的菌种接种到BS培养基(pH值为7.0)中，在37℃的培养箱中静置培养，当OD值＝0.6-1.0时，菌种处在对数期，配制浓度为10

3、茶叶发酵产品的制备

取适量含有PA的茶叶提取液，接入混合液体积3％的发酵菌液，在37℃恒温搅拌72h，搅拌转速为120转/分钟；再经过121℃蒸汽灭菌，降至室温后，采用8～12μm滤板过滤，即得茶叶发酵产品。

实施例3茶叶发酵产品的制备

1、含有PA的茶叶提取液的制备

将茶叶进行清洗，去除污泥和灰尘、杂质后，在90℃下干燥处理1h，去除水分，得到干燥后的茶叶处理物；将干燥后的茶叶粉碎，过2号筛(850±29μm)；以1：8-10的料液比，分别加入纯水，浸泡2h，再经过121℃蒸汽灭菌，冷却并降至室温，再进行多次回流提取有效成分，即得茶叶提取液。

取适量的PA，溶解于纯水中，配置成浓度0.7mmol/L的PA溶液。

在茶叶提取液中加入与茶叶提取液体积比14％的PA溶液。得到含有PA的茶叶提取液。

4、发酵菌液的制备

(1)菌种活化：挑取菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后菌液；

(2)菌种纯化：将活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后菌种；

(3)菌种扩大培养：将纯化后的菌种接种到BS培养基(pH值为7.0)中，在37℃的培养箱中静置培养，当OD值＝0.6-1.0时，菌种处在对数期，配制浓度为10

3、茶叶发酵产品的制备

取适量含有PA的茶叶提取液，接入混合液体积4％的发酵菌液，在37℃恒温搅拌72h，搅拌转速为120转/分钟；再经过121℃蒸汽灭菌，降至室温后，采用8～12μm滤板过滤，即得茶叶发酵产品。

对比例1

本对比例的各原料及制备方法与实施例3相同，不同之处在于，不添加茶叶提取液。

对比例2

本对比例的各原料及制备方法与实施例3相同，不同之处在于，不添加PA溶液。

对比例3

本对比例的各原料及提取方法与实施例3相同，不同之处在于，发酵菌种采用双歧杆菌。

对比例4

本对比例的各原料及提取方法与实施例3相同，不同之处在于，不经过菌种添加发酵，使用同等体积的纯水代替菌液，制备茶叶提取液。

测试例1实时荧光RT-PCR检测指标基因mRNA表达水平

取等量HaCaT细胞(购于中国科学院上海细胞库)接种于6孔板中，分别取等量上述实施例1～3与对比例1～4制备得到的茶叶发酵产品或提取液，加入纯水溶解，均配制成浓度为2g/mL的茶叶发酵产品或提取液溶解液，加入无血清培养基中与HaCaT细胞共培养，24h后，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA。细胞用TRIZOL试剂裂解，细胞裂解液中加入500μL氯仿，12000转/分离心10min。收集含有RNA的上清，用等体积的异丙醇沉淀，孵育30min。RNA沉淀物在12000转/分下离心10分钟，收集核酸，用70％乙醇洗涤后并风干，再溶于20μL无菌双蒸水中，随后采用微量紫外-可见分光光度计定量RNA。再利用cDNA转换试剂盒，将RNA转换为cDNA，用于定量聚合酶链式反应。采用定量聚合酶链式反应技术检测细胞表达TRPV4、TRPV3、TRPM8基因mRNA表达水平，空白组取PBS代替同等量的溶液。

其中，检测细胞表达TRPV4、TRPV3、TRPM8基因具体为：瞬时受体香草素(transientreceptor potential vanilloid，TRPV)的亚型TRPV3蛋白可以通过调节细胞参与炎症和伤害性感受，起到调节炎症产生的作用；TRPV4蛋白在不同的血管内皮细胞中表达，参与了多种血管功能，包括调节血管张力、机械信号传导等，激活TRPV4通道可以增加内皮Ca

检测结果如图1所示，与空白组相比，各实施例与对比例制备得到的茶叶发酵产品或提取液均能有效的上调TRPV4、TRPM8mRNA水平，同时也能下调TRPV3mRNA水平，但本发明实施例1～3制备的茶叶发酵产品效果显著优于对对比例1～4，通过上调TRPV4和TRPM8来增加内皮Ca

测试例2Elisa分析肌球蛋白轻链激酶的表达水平

以HaCaT细胞作为模型，分别取等量上述实施例1～3与对比例1～4制备得到的茶叶发酵产品或提取液，加入纯水溶解，均配制成浓度为2g/mL的茶叶发酵产品或提取液溶解液，加入无血清培养基中与HaCaT细胞共培养(各实施例与对比例采用的提取液用量浓度均相同)，24h后收集细胞，空白组取PBS代替同等量的溶液。采用ELISA法检测各组茶叶发酵产品或提取液对肌球蛋白轻链激酶的影响作用，并通过数据处理软件分析实验结果。

ELISA法检测结果如图2所示，显示本发明的实施例1～3较对比例1～4相比，提高了HaCaT细胞中肌球蛋白轻链激酶的水平，以此参与调控TRPV4信号通路，从而保护血管屏障，达到改善皮肤微循环的效果。

测试例3Elisa分析茶叶发酵产品对人角质细胞分泌炎症介质的影响

本实施例通过检测茶叶发酵提取液对人角质细胞分泌炎症介质的影响，以评价其皮肤微循环的功效。在无菌操作台进行，将培养皿中生长至接合度约为80～90％的HaCaT细胞(购于中国科学院上海细胞库)收集计数。根据计数结果，按照2.0～8.0×10

检测结果如图3所示，实施例1～3较对比例1～4相比，本发明实施例提供的茶叶发酵产品能有效的在脂多糖LPS模型中，下调炎症因子COX-2的水平，效果优于对比例1～4，起到通过抗炎症，以此对抗细胞衰老的效果。采用PA与茶叶提取液复配的效果显著优于对比例1～4，且将PA与茶叶提取液复配使用具有增效作用。

测试例4Elisa分析茶叶发酵产品对成纤维细胞的影响

本实施例通过检测茶叶发酵提取液对人成纤维细胞的I型胶原蛋白的分泌及人成纤维细胞的透明质酸的分泌影响，以评价其抗衰老功效。在无菌操作台中，将培养皿中生长至80～90％的人成纤维细胞HSF收集计数。根据计数结果，按照1.0～5.0×10

I型胶原蛋白的分泌检测结果如图4所示，显示实施例1～3较对比例1～4相比，本发明实施例1～3提供的茶叶发酵产品能有效的在脂多糖LPS模型中，提高成纤维细胞的I型胶原蛋白分泌水平，对改善皮肤老化有积极作用。

透明质酸的分泌检测结果如图5所示，显示实施例1～3较对比例1～4相比，本发明实施例1～3提供的茶叶发酵产品能有效的在脂多糖LPS模型中，提高成纤维细胞的透明质酸的分泌水平，以此来延缓衰老。

测试例5茶叶发酵产品的安全检测

本实施例通过人体贴斑试验，对添加了本发明制备的茶叶发产品的红茶精华液进行安全检测，按照重量比例计，制备精华液的方法如下：分别取实施例1～3和对比例1～4中的发酵产品2～5％，对羟基苯乙酮0.4％，1,2-己二醇0.6％，卡波姆941 0.1％，三乙醇胺0.1％，EDTA二钠0.02％，余量为去离子水，混合均匀后分别制备得到红茶精华液。

选用面积为40mm

表1皮肤斑贴试验皮肤反应分级标准

根据上述表1记载的皮肤斑贴试验的皮肤反应分级标准测试实施例1～3统与对比例1～4的提取液应用于皮肤的情况，结果如表2所示，与对比例1～4相比，使用实施例1～3中的茶叶发酵精华产品有较为显著的安全性。

表2皮肤贴斑试验皮肤反应结果

综上，本发明通过动态发酵含有哌可酸的茶叶活性成分提取液，来制备得到的茶叶发酵产品可以调控TRPV4信号通路，增加内皮Ca

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。