SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法

技术领域

本发明涉及一种SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法，属于化学分析领域。

背景技术

啶虫脒作为一种新烟碱类杀虫剂，与乙酰胆碱受体结合，可抑制昆虫神经传导活动，广泛用于水稻、蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。然而，滥用含有啶虫脒的农药会导致农作物中残留过多并进入水系统，从而对人们造成潜在的健康风险，包括内分泌系统紊乱、致癌和先天性缺陷。根据食品安全国家标准，苹果、葡萄和香蕉中啶虫脒的最大残留量分别为0.8、0.5、3mg/mL。

为了避免啶虫脒对健康的危害，量化农产品受啶虫脒的污染程度具有重要意义。近几十年来，仪器方法和基于免疫的方法已发展成为检测啶虫脒的主流方法。然而，昂贵的仪器和对训练有素的技术人员的需求限制了仪器方法的发展。此外，高昂的价格和严格的运输和储存条件也限制了基于抗体的方法的实际适用性。

近年来，基于表面增强拉曼光谱(SERS)的生物传感器由于其具有高灵敏度、特异性和多重检测能力的优势，从而成为食品安全中一种非常有前途的替代方法。作为基于SERS的生物传感器的核心组件，SERS探针通常由增强基底(如金纳米颗粒)和拉曼报告子(RRs)组成。我们之前工作(专利号：CN202011298830.9，发明名称：一种利用SERS技术对食品中OTA残留的检测方法)利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为RRs，TMB的催化产物容易且牢固地附着在金属纳米结构的表面。在竞争结合的作用机制下，催化后TMB的表面增强拉曼散射强度与检测目标呈负相关，结合催化后TMB的SERS强度以及先前计算出的负相关线性关系即可测量目标物在食品中的含量。然而，传统RRs(如罗丹明6G、4-巯基吡啶、2'2-联吡啶和TMB)在食品分析的实际应用中仍然存在一些问题。特别是，食品生物分子和传统RRs的拉曼发射形成于<1800cm

发明内容

本发明克服了上述技术不足，提出一种SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法。本发明利用适配体补链(Fe

本发明的技术方案是：一种SERS-适配体传感技术抗基质效应检测食品中啶虫脒的方法，包括如下步骤：

1)制备纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt分散液

利用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子(Au NPs)分散液，再加入4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯胺(4-TEAE)水溶液共孵育；离心，将沉淀分散在PBS缓冲液中，获得4-TEAE/AuNPs分散液；然后将4-TEAE/Au NPs分散液与巯基修饰的啶虫脒适配体Apt溶液共孵育3-5h，离心，沉淀采用PBS缓冲液重新分散，获得纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt分散液；

2)制备捕获探针Fe

采用共沉淀法制备Fe

3)检测

将步骤1)制备的纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt分散液和步骤2)制备的捕获探针Fe

进一步的，上述巯基修饰的啶虫脒适配体(Apt)，其序列如下所示：

5′-SH-CTGACACCATATTATGAAGA-3′；

进一步的，上述啶虫脒适配体补链为cApt，序列如下：

5’-NH

进一步的，使用拉曼光谱仪测量在1998cm

进一步的，Apt与cApt的浓度均为200-400nM(最佳300nM)，纳米探针4-TEAE/AuNPs/Apt分散液和步骤2)制备的捕获探针Fe

进一步的，所述PBS缓冲液的pH值为7。

进一步的，步骤3)的反应pH为pH＝7，反应时间为≥25min。

有益效果：

1、本发明选用4-TEAE/Au NPs/Apt与Fe

2、本发明利用适配体补链和啶虫脒能够特异性竞争结合适配体的反应体系，提高了抗干扰SERS技术检测啶虫脒的选择性及其在真实样品中的应用潜力。

附图说明

图1为合成纳米探针中4-TEAE的最佳浓度；

图2为适配体Apt的最佳浓度；

图3为适配体cApt的最佳浓度；

图4为啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳反应时间；

图5为啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳反应pH；

图6为拉曼报告分子(4-TEAE)在1998cm

图7为拉曼报告分子(4-TEAE)在1998cm

图8为SERS检测啶虫脒的标准曲线；

图9为SERS特异性分析。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1：利用SERS技术抗干扰检测啶虫脒

巯基修饰的啶虫脒适配体(Apt)，其序列如下所示：

5′-SH-CTGACACCATATTATGAAGA-3′；

啶虫脒适配体补链为cApt，序列如下：

5’-NH

拉曼光谱仪：Ocean Insight QEPro便携式拉曼光谱仪；激光拉曼光谱仪测定条件：激光波长785nm，激光强度380mV，扫描范围2800～0cm

一、实验步骤

1、合成纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt

(1)金纳米粒子(Au NPs)分散液制备

首先，采用柠檬酸钠还原法制备了金纳米粒子(Au NPs)分散液，具体为：用加热套加热100mL超纯水至沸腾，然后加入1mL 0.01g/mL柠檬酸三钠溶液并加入转子并在590rpm下涡旋。1分钟后，向沸腾溶液加入0.1mL(0.1g/mL)的氯金酸溶液，沸腾液体的颜色迅速从无色变为透明的酒红色。待颜色稳定不再变化后，停止加热，继续搅拌20min，自然冷却至室温后获得Au NPs分散液，在4℃下储存供进一步使用。

(2)4-TEAE/Au NPs分散液制备

将步骤(1)制备的Au NPs分散液10mL加入0.5mL浓度为1mM的4-[三甲基硅基]乙基苯胺(4-TEAE)水溶液，在涡旋振荡器中震荡孵育1h，6000rpm下离心15分钟，收集沉淀，用超纯水清洗3次，沉淀分散在5mL PBS缓冲液(pH＝7)中，获得4-TEAE/Au NPs分散液；

(3)啶虫脒适配体溶液的准备

啶虫脒配体(Apt)用EDTA(0.5M)溶液溶解至100μM，再用PBS缓冲液(pH＝7)稀释至10μM进一步使用。

(4)纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt溶液制备

步骤(2)制备的4-TEAE/Au NPs分散液1mL与步骤(3)制备的浓度为10μM的巯基修饰啶虫脒适配体溶液20μL，在室温下震荡共孵育4h，在6000rpm下离心15min，收集沉淀，用超纯水洗涤3次，再充分分散于PBS缓冲液(pH＝7)中，获得纳米探针4-TEAE/Au NPs/Apt分散液，以4℃的温度保存在冰箱中待用。

2、捕获探针Fe

cApt固定在Fe

(1)Fe

采用共沉淀法制备，将5.2g FeCl

(2)制备羧基保护的Fe

将100μL Fe

(3)cApt(10μM)溶液的准备

啶虫脒适配体补链(cApt)用EDTA(0.5M)溶液溶解至100μM，再用PBS缓冲液(pH＝7)稀释至10μM进一步使用。

(4)制备捕获探针Fe

将0.2mL cApt(10μM)溶液加入到羧基保护的Fe

3、拉曼光谱检测

(1)最佳探针合成工艺选择

首先，吸取2、3、4、5、6mM 4-TEAE溶液10μL与1mL胶体金分散液(上述步骤(1)制备的Au NPs分散液)混合，室温下涡旋振荡器中连续震荡1h，随后，6000rpm下离心15min，收集沉淀，并用超纯水复溶至1mL，并加入到透明小瓶中进行拉曼检测。对比各个浓度下三次平行实验的4-TEAE/Au NPs在1998cm

为了研究适配体浓度对纳米性能的影响，将适配体初始浓度为100、200、300、400、500nM的0.5mL纳米探针与捕获探针等体积混合，并用外磁体分离。用纯水复溶至1mL的复合探针分散液通过拉曼光谱仪检测在1998cm

(2)啶虫脒、捕获探针与纳米探针竞争反应最佳条件选择

为了获得最佳竞争反应时间，设定一系列反应时间(10、15、20、25、30min)并将0.5mL纳米探针、0.5mL捕获探针和20μL啶虫脒混合来确定最佳反应时间；比较时，上述两种分散液中cApt和Apt浓度分别固定为200nM，竞争反应pH固定为pH＝7。各个时间的竞争反应重复三次，每次反应时间结束后进行外部磁铁分离，用超纯水清洗两遍后复溶至1mL并用拉曼光谱仪检测。统计每个反应时间的三次平行实验在1998cm

最佳反应pH是竞争反应的另一个影响适体传感器灵敏度的关键因素。为此，设定一系列反应pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)并在该pH下将0.5mL纳米探针、0.5mL捕获探针和20mL啶虫脒混合来确定最佳反应pH；比较时，上述两种分散液中cApt和Apt浓度分别固定为200nM，竞争反应时间固定为1小时。各个pH的竞争反应重复三次，反应结束后进行外部磁铁分离，用超纯水清洗两遍后复溶至1mL并用拉曼光谱仪检测。统计每个反应pH的三次平行实验在1998cm

此外，将拉曼报告分子(4-TEAE)在1998cm

二、方法学验证

1、线性

将制备好的500μL Au NPs/4-TEAE/Apt纳米分散液和500μL Fe

2、方法可行性

为了验证适配体传感器的实用性，通过网购购买了葡萄(品种：巨峰)作为真实的食品样品进行了测试。1mL真实样品(葡萄清洗后去梗打浆)分别加入1nM、5nM和10nM的啶虫脒作为待测溶液。将20μL待测溶液引入适体传感器系统中完成检测。由表1可知，加药样品的回收率在89.2～95.4％之间，相对标准偏差(RSD)小于8％。这些结果表明，本发明的方法能够检测真实样本中的啶虫脒，真实样本的干扰可以忽略不计。

表1抗干扰检测技术对加标葡萄样品中啶虫脒检测结果(n＝3)

3、方法的识别特异性

选择杀虫剂唑苯腈(azoxynil)、甲基恶唑啉(thiamethoxaline)、环氧苯丙胺(cymoxanil)、氰唑咪胺(cyazofamid)和氟虫腈(fipronil)来验证方法特异性。在相同的条件下，分别对300nM的唑苯腈、甲基恶唑啉、环氧苯丙胺、氰唑咪胺和氟虫腈和30nM的啶虫脒(acetamiprid)以及各毒素的混合进行检测。重复测定3次，比较1998cm

实施例2：样品检测

1、建立SERS技术

按照实施例1所述的方法制备纳米探针Au NPs/4-TEAE/Apt分散液、合成捕获探针Fe

2、建立回归方程

将制备好的500μL Au NPs-4/TEAE/Apt溶液和500μL Fe

3、样品检测

网购购买了葡萄(品种分别为：巨峰、红珍珠、巨峰、红提、夏黑)作为真实的食品样品，取50μL真实样品用于SERS检测。每个样品水平重复3次。

4、检测结果

检测结果如表2所示，其中啶虫脒检测含量最高为3.73nM，低于检测标准。

表2基于SERS技术对六个不同葡萄样品中啶虫脒检测结果(n＝3)

“–”低于检测限。