一种多肽环肽的制备方法

本申请主张中国在先申请，申请号:202110851741.0，申请日2021年7月27日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。

技术领域

本发明涉及生物医学技术及个人护理领域，具体而言，涉及一种多肽环肽的制备方法。

背景技术

很多在体外具有很好的生物活性和稳定性的直链肽，进入体内后活性很快消失。因为体内环境复杂，存在各种各样的酶。直链肽在酶的作用下容易被降解代谢，进而失去活性。为了得到生物活性好、半衰期长，受体选择性更高的多肽，文献报道过很多多肽修饰的方法，其中包括将直链肽改造成环肽。这种大环分子具有明确的固定构象，能够与受体更好地契合，且对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低。因此环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。

环肽根据环合方式分为首尾相连环肽(Head-to-tail)、侧链和侧链相连环肽(Sidechain-to-sidechain)、侧链和端基相连环肽(Sidechain-to-end)、含二硫桥的环肽(Disulfid e-bridge)、订书肽(Stapled Peptide)、以及含有其他桥连结构的环肽。从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。因为直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，而是有利于分子间缩合。

首尾相连的环肽通常是N端和C端游离的直链肽在稀溶液中(10

由于环肽的前体——直链肽所包含的氨基酸的数目和种类的千差万别，造成了环肽合成方法的多样化。对某种直链肽表现出高效、快速缩合作用的试剂和方法对另外一种肽链就可能变得低效或无效。因此，根据目标环肽的序列寻找对应的环肽合成方法必须通过长期认真的探索和艰辛的努力。

首尾环化是提高肽结构刚度和稳定性的一种重要方法。由于外切蛋白酶，如氨肽酶或羧肽酶，可以识别直链肽的N端或C端基团进而将其水解。因此，相比直链肽，环肽对酶的蛋白水解更有抵抗力。环状结构预先限制了环状肽的构象，封闭了两端暴露的氨基和羧基，使得酶切效果变差，从而降低了受体结合过程中的熵成本。这一特征增加了它们对受体和蛋白质靶点的结合亲和力和特异性。因此，它们适用于探测和调节蛋白-蛋白的相互作用。通过适当的设计，环肽可以模拟作为受体识别关键模块的蛋白质二级结构(如α螺旋和β发夹)，它们是受体识别的关键模块。所有这些有利的药理特征都使环肽成为潜在的候选药物。

肽链的合成方法主要有液相合成和固相合成。液相合成使用完全保护的线性前体(两个环化末端除外)，在偶联试剂存在下的直接偶联。然而，这种策略存在几个缺点，导致合成效率低。首先，环化必须在高稀释溶液中进行，以防止/减少分子间反应引起的低聚化，因为肽环化是一个熵减的过程，导致溶剂的大量浪费，以及操作与后处理过程的繁琐。其次，活化的C端羧酸容易发生差向异构化进而产生一对环异构体，而差向异构体也可能会在碱性条件下，通过α质子的去质子化，将激活的C端羧酸烯醇化而产生，因此液相合成对纯化过程要求非常高，导致合成产量降低。最后，在有机溶剂中，一些完全保护的线性肽前体的溶解度很差，会阻止其发生环化反应。因此固相多肽合成(SPPS)方法更有竞争力。

目前现有的首尾环化方法主要包括：树脂上的环化(on-resin cyclization)、化学连接(chemical ligation)、叠氮-烯烃环加成(azide–alkyne cycloaddition)、关环复分解(ring-closing metathesis)和静电控制的大环化(electrostatically-controlledmacro-cyclizations)等。

已有采用转肽酶Sortase A法制备环化Hst1的相关报道(Sortase A as a toolfor high-yield histatin cyclization，Jan G.M.Bolscher，The FASEBJournal.Research Communication)，合成高活性的Hst1环肽，但由于采用Sortase A酶法步骤繁琐，催化效率低(0.1-1摩尔当量)，反应时间长(20小时以上)，制得的环肽溶解性差。此外，该方法需要大的识别单元，在首尾两端引入冗余的氨基酸序列，不必要地增加了原始多肽的长度和序列复杂度，原子经济性差，且有多聚物产生风险。而且其转肽酶反应的机理具有可逆性，有导致已生成的环肽裂解的风险。同时由于Sortase A酶价格高，而且属于细菌酶，容易含有细菌产物残留，从而带来免疫原、致病微生物等工艺安全问题。综上原因，Sortase A酶法难以制备规模化可工业生产的高纯度的Hst1环肽。此外，CN103249426A公开了一种采用二硫键法制备的富组蛋白环状类似物，但二硫键法制备的通常为与侧链相连的环肽，难以制得稳定的首尾连接环肽，且不适用于不含有半胱氨酸残基的多肽序列。

因此急需一种更简便、高效、副反应少、环化产物溶解性高、安全无菌、可规模化生产的多肽首尾环肽的制备方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种多肽环肽的制备方法，通过特定条件下的叠氮-炔环加成反应制得带有三唑环的组胺素首尾环肽，其活性与线性组胺素相比提高了1000倍，能以线性组胺素千分之一的剂量，达到线性组胺素相同的效果，高于已有的组胺素环肽，且相对于二硫键环化肽拥有显著提升的稳定性和抗生物代谢降解作用，相对于Sortase A酶法环化肽明显改善了溶解性，构象独特，环化过程温和简便、效率高、并能制得高纯度的组胺素首尾环肽，可明显提升组胺素的生物活性和临床功效，具有非常好的产业化前景。

一方面，本发明提供了一种多肽环肽，其结构式如式1或式2所示：

其中，Xaa

在一些方式中，所述Xaa

组胺素的首尾连接环肽的构建非常困难，对反应条件要求高，且容易出现副反应现象。本发明创造性地通过叠氮-炔基环加成反应，并经过大量的反应试剂的筛选和工艺条件的摸索，成功制得一系列含有三唑环的组胺素环肽，其活性为线性组胺素的1000倍以上。

本发明提供的含有三唑环的组胺素环肽，可以提高组胺素的生物活性和临床功效。通过环化通过锁定多肽分子的空间构象提高其稳定性，从而提高疗效和体内半衰期。通过在肽链的首尾中引入叠氮基和炔基，同时结合树脂，经叠氮-炔环加成反应制得多种类型的组胺素环肽。

由于三唑环的构建，本发明提供的组胺素环肽可以对抗生物代谢降解作用，拥有极佳的代谢稳定性，可以与生物分子靶点形成氢键结合，能模拟天然多肽肽键反式结构等二级结构，改善溶解性，还可对抗酶的降解作用，并且对水解反应和氧化反应表现出优秀的稳定性。

进一步地，所述衍生修饰包括烷基化、酰化、酯化、磷酸化、磺酸化、糖苷化、PEG化、生物素标记、荧光标记、同位素标记、D型、链接linker、载体蛋白偶联或特殊氨基酸等中的一种或多种。

在一些方式中，所述特殊氨基酸，包括组成天然蛋白质的20种基本氨基酸的衍生氨基酸，及组成某些特种蛋白质的特殊氨基酸，如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、Υ-羧基谷氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、锁链素、异锁链素，以及β、γ、δ-氨基酸等。

在一些方式中，所述Hst1～Hst12中任一项的衍生修饰肽段，所述衍生修饰包括但不限于甲基化、烷基化、酰化、酯化、磷酸化、磺酸化、糖苷化、PEG化、生物素标记、荧光标记或同位素标记、D型、链接各种linker、载体蛋白偶联或特殊氨基酸等。

在一些方式中，所述Hst1～Hst12中任一项的衍生修饰肽段，包括在Hst1～Hst12中任一项的肽段首尾加/减几个氨基酸、L型氨基酸改为D型氨基酸、或者氨基酸基团的磷酸化、脂酰化、糖基化、甲基化、羟基化、泛素化、脂质化、脂肪烃基、脂环烃基、芳烃基、杂环基或卤代等衍生修饰方法而获得的肽段。

在一些方式中，所述Hst1～Hst12中任一项的衍生修饰肽段，包括对Hst1～Hst12中任一项的肽段的N端修饰(如Ac乙酰化等)；N端脂肪酸修饰(Myr豆蔻酸、Pal棕榈酸、Ste硬脂酸、月桂酸，癸酸，辛酸修饰等)；C端修饰(-NH2酰胺化、-PNA、-AMC、-OME、-OET等)。

在一些方式中，所述Hst1～Hst12中任一项的衍生修饰肽段，包括对Hst1～Hst12中任一项的肽段的荧光标记修饰，所述荧光标记如Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等。

在一些方式中，所述Hst1～Hst12中任一项的衍生修饰肽段，包括对Hst1～Hst12中任一项的肽段的生物素标记修饰(如BIOTIN等)、或PEG化修饰(修饰位点在多肽的N端、C端，Lys侧链和Cys的巯基等)、或磷酸化修饰(如p-Ser、p-Thr、p-Tyr等)、甲基化修饰(如Lys(Me)、Arg(Me)等)。

进一步地，所述的组胺素环肽的结构式如式3或式4所示：

其中，n＝1～6，m＝0～3，x＝0或1，a＝1～6，b＝0～2，R基为任意一种氨基酸的R基。

所述R基为任意一种氨基酸的R基，所述氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸、L型氨基酸、特殊氨基酸(D型氨基酸，beta氨基酸，homo氨基酸)、以及其他各种侧链修饰氨基酸等。

在一些方式中，所述R基包括但不限于H、脂肪烃基、脂环烃基、芳烃基、杂环基、卤代基等。

在一些方式中，所述R基为20种天然氨基酸与C原子相连的第四个基团，根据氨基酸的不同，R基也分别不同，主要包括：-H、-CH

进一步地，所述R基包括(取代的)脂肪烃基、脂环烃基、芳烃基、杂环基或卤代等。

进一步地，所述R基包括-H、或甲基、乙基、苯基中的任意一种。

进一步地，式3或式4中的氨基和/或羧基可被进一步衍生化，从而获得-NH

进一步地，所述式3或式4中的氨基被衍生化包括氨基被酰化、烷基化、PEG化、生物素标记或荧光标记中的任意一种或多种；所述式3或式4中的羧基被衍生化包括羧基被酰胺化、酯化、糖苷化、PEG化等中的任意一种或多种。

所述氨基衍生修饰包括但不限于酰化、烷基化、PEG化、生物素标记、荧光标记等；羧基衍生修饰包括但不限于酰胺化、酯化、糖苷化、PEG化等。

所述氨基-NH

进一步地，所述peptide sequence为Hst1的序列，或Hst1的衍生修饰肽段，所述Hst1具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用天然的Hst1氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用第二个AA的Ser磷酸化后的Hst1氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用第二个AA未经Ser磷酸化的Hst1氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的衍生修饰肽段，比如Hst1的氨基酸序列磷酸化、脂酰化、糖基化、甲基化、羟基化、泛素化及脂质化后的序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的N端修饰(如Ac乙酰化等)的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的N端脂肪酸修饰(如Myr豆蔻酸、Pal棕榈酸、Ste硬脂酸、月桂酸，癸酸，辛酸修饰等)的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的C端修饰(如-NH2酰胺化、-PNA、-AMC、-OME、-OET等)的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的荧光标记(Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等)修饰的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的生物素标记(BIOTIN等)修饰的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的PEG化(修饰位点在多肽的N端、C端，Lys侧链和Cys的巯基等)修饰的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的磷酸化(如p-Ser、p-Thr、p-Tyr等)修饰的氨基酸序列。

在一些方式中，Hst1序列可以采用Hst1的甲基化修饰(如Lys(Me)、Arg(Me)等)修饰的氨基酸序列。

进一步地，所述组胺素环肽的R基为H，此时组胺素环肽的结构式如式5或式6所示：

其中，n＝1～6，m＝0～3，x＝0或1，a＝1～6，b＝0～3。

在一些方式中，所述组胺素环肽的结构式如式7或式8所示：

其中，n＝1～3，a＝4。

在一些方式中，所述Xaa

另一方面，本发明提供了一种组胺素环肽的制备方法，主要通过在Hst1～Hst12中任一项序列及其片段的一端连接含有炔基的任意氨基酸，另一端连接含有叠氮基的任意氨基酸，并在任意一端结合树脂，所述炔基和叠氮基环化加成，脱去树脂，获得组胺素环肽，所述Hst1～Hst12分别具有如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

进一步地，本发明提供了一种组胺素环肽的制备方法，主要通过在Hst1～Hst12中任一项序列及其片段的C端连接含有炔基的Xaa

或是通过在H1～H12中任一项序列及其片段的C端连接含有叠氮基的Xaa

其中，Xaa

所述衍生修饰包括但不限于烷基化、酰化、酯化、磷酸化、糖苷化、PEG化、生物素标记、荧光标记、同位素标记或特殊氨基酸等。

进一步地，所述含有炔基的Xaa

所述含有叠氮基的Xaa

其中，n＝1～6，m＝0～3，R基为任意一种氨基酸的R基，x＝0或1。

在一些方式中，所述R基包括但不限于H、脂肪烃基、脂环烃基、芳烃基、杂环基、卤代。

进一步地，式11或式12中的氨基-NH

所述氨基和/或羧基的衍生化，其中氨基衍生修饰包括但不限于酰化、烷基化、PEG化、生物素标记、荧光标记等，羧基衍生修饰包括但不限于酰胺化、酯化、糖苷化、PEG化等

在一些方式中，所述氨基-NH

进一步地，所述peptide sequence为Hst1的序列，所述Hst1具有如序列表中SEQID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述R基为-H。

进一步地，反应前，所述Xaa

在一些方式中，所述衍生化包括但不限于酰化、烷基化、PEG化、生物素标记、荧光标记等。

进一步地，反应前，所述Xaa

在一些方式中，所述衍生化包括但不限于酰化、烷基化、PEG化、生物素标记、荧光标记等。

所述氨基-NH

进一步地，所述含有炔基的Xaa

所述含有叠氮基的Xaa

所述含有叠氮基的Xaa

所述含有炔基的Xaa

其中，n＝1～4，a＝4，x＝0或1。

进一步地，所述Xaa

在一些方式中，所述制备方法的反应式如式17所示。

再一方面，本发明提供了一种组胺素环肽的制备方法，包括以下步骤：

1)将固相多肽合成(SPPS)工艺制备的直链肽置于容器内，加入溶剂；所述直链肽为线性组胺素的C端连接含有炔基的Xaa1，N端连接含有叠氮基的Xaa2，所述Xaa2上结合树脂；或为线性组胺素C端连接含有叠氮基的Xaa3，N端连接含有炔基的Xaa4，所述Xaa4上结合树脂；

2)加入催化剂；

3)加入配体；

4)用氮气吹泡；

5)盖紧容器并封闭，静置搅拌；

6)用乙二胺四乙酸二钠清洗，去除洗涤液；

7)用水清洗，用有机溶剂清洗，去除洗涤液；

8)真空干燥；

9)加入切割混合液将多肽从树脂上切割下来；

10)纯化多肽。

在一些方式中，所述溶剂可以是质子性溶剂如选自甲醇、乙醇、叔丁醇、聚乙二醇PEG、三氟乙醇TFE、六氟异丙醇HFIP、水，偶极非质子溶剂如乙腈MeCN,、二甲基亚砜DMSO、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺DMF、N,N-二异丙基乙胺DIPEA、N-甲基吡咯烷酮NMP、吡啶、哌啶，非极性溶剂如二氯甲烷DCM、三氯甲烷、四氢呋喃THF、乙酸乙酯、乙醚、苯、甲苯、四氯化碳、二氧六环、正己烷、环己烷等，可以是其中两者或者三者按一定比例的混合，比如叔丁醇/水、甲醇/二氯甲烷、二氯甲烷/乙腈、二氯甲烷/水、乙腈/二甲基亚砜/水、丙酮/二甲基亚砜、乙醇/水、N-甲基吡咯烷酮/乙腈、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷/水、正己烷/二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺/三氟乙醇、N,N-二甲基甲酰胺/六氟异丙醇等中的任意一种或多种。

溶剂的位阻、电性、极性、质子性、氢键键和能力和比例影响反应速度、副反应副产物如二聚体、三聚体多聚体和分解产物生成比例等。

进一步地，本发明采用乙腈和二甲基亚砜的混合溶液作为溶剂。

进一步地，本发明采用乙腈和二甲基亚砜(MeCN:DMSO)按4:1比例配置溶液作为溶剂。

研究发现，直链多肽浓度在溶液中的高低会影响反应速度，导致副反应副产物如二聚体、三聚体多聚体的比例升高，但总体而言SPPS固相合成相比液相合成方法，其更利于分子内环化而非分子间环化等副反应，这也是本发明选择SPPS的原因之一。

在一些方式中，本发明优选采用500mg直链多肽，加入20ml乙腈和二甲基亚砜(MeCN:DMSO＝4:1)的溶剂。

进一步地，本发明所述树脂选自Wang Resin、Rink Amide AM Resin、Rink AmideMBHA Resin、2-Chlorotrityl Resin、PEGylated Rink-modified TentaGel(TGR)resin、Aminomethyl Resin、Sieber Amide Resin、PAM Resin等中的任意一种。

不同的树脂会影响反应速度，并导致副反应副产物增多。

在一些方式中，所述树脂采用Rink Amide MBHA Resin，可加快反应速度，并明显降低副反应副产物的发生。

进一步地，本发明所述催化剂可以为铜或铑试剂。

在一些方式中，本发明所述催化剂为铜试剂，所述铜试剂可选自一价铜盐及其复合物如碘化亚铜CuI、氯化亚铜CuCl、碘化亚铜/亚磷酸三乙酯CuI·P(OEt)

此外，铜/铑试剂的载入量也一定程度影响反应完成度，从0.05eq到4eq不等，也可以是非铜/铑试剂如HBTU/HOBt，但效果差异性明显。

进一步地，本发明所述铜催化剂为碘化亚铜。

进一步地，所述碘化亚铜的加量为20mM。

进一步地，本发明所述配体一般为含氮配体，可选自2,6-二甲基吡啶(2,6-lutidine)、二乙胺、三乙胺、正丙胺、二异丙基胺、三丁胺、二异丙基乙胺DIPEA、二甲氨基吡啶DMAP、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯DBU、五甲基二乙烯三胺PMDETA、六甲基三亚乙基四胺HMTETA、三(2-二甲氨基乙基)胺Me6TREN、哌啶、吡啶、双吡啶、2,2′:6′,2″-三联吡啶tpy、三(2-吡啶基甲基)胺TPMA、bipyridine、叔丁基三氯乙酰亚胺酯TBTA、三(3-羟丙基三唑甲基)胺THPTA、TTTA、BTTAA、TABTA、BTTE、BTTP中的任意一种；也可以是含磷配体，可选自三苯基膦、三环己基磷PCy3、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦BINAP、1,2-双(二苯基膦)乙烷DPPE、1,3-双(二苯基膦)丙烷DPPP、1,4-双(二苯基膦)丁烷DPPB、1,5-双(二苯基膦)戊烷DPPPe中的任意一种；还可以是含硫配体，可选自4,4’-硫代双(6-特丁基-3-甲基苯酚BPS、BTTES、BTTPS中的任意一种。

本发明所述催化剂为铜试剂时，配体的碱性、供体性能和位阻能稳定一价铜离子，阻止其被氧化或发生歧化反应，同时促进乙炔亚铜复合物的形成，降低铜试剂的载入量，提高环合反应效率，配体和铜的比例从0.5/1到4/1及过量不等，取决于配体、铜试剂、溶剂的相对活性、极性和供体能力。

进一步地，本发明所述配体为2,6-二甲基吡啶(2,6-lutidine)。

进一步地，本发明所述2,6-二甲基吡啶的加入量为30μL。

进一步地，本发明所述的叠氮-炔基环加成反应的反应条件也有严格限制。

在一些方式中，本发明所述反应的反应体系可容忍酸度为4～12的宽范围。

进一步地，本发明的反应过程必须脱氧；

氧气会氧化铜试剂，从而导致环化过程失败，因此脱氧很重要，同时湿度也会影响反应效率。

进一步地，本发明的反应过程需用氮气吹泡2到5分钟。可用氮气吹泡2到5分钟来保证反应过程脱氧。

进一步地，还需隔绝空气：盖紧并封闭，隔绝氧气。

进一步地，本发明的反应温度为室温到100℃。反应温度会影响反应速度和产物/副产物和分解产物的相对比例及其稳定性。

进一步地，本发明的反应时间为10min到100h。

在一些方式中，本发明的反应还可在微波(室温到100℃)条件下进行，可以加速反应，但我们的研究证明，微波条件容易产生副产物和分解产物。

进一步地，反应完成后需用饱和乙二胺四乙酸二钠溶液(saturated of disodiumEDTA)摇晃清洗，螯合剂EDTA用于除去铜离子。

进一步地，采用EDTA摇晃清洗2次，每次10分钟。

进一步地，还需采用水清洗1次，用乙腈清洗1次，二氯甲烷清洗1次，用乙醚清洗一次，去除洗涤液。

进一步地，洗地完成后需真空干燥1小时。

进一步地，干燥完成后进行裂解：按照标准流程：20ml混合液(95.5％的三氟乙酸、2％的苯酚水溶液、2％的苯甲硫醚、0.5％的三异丙基硅烷)，3小时摇晃，将多肽从树脂上剪切下来。用冷乙醚过滤多肽，清洗3次，干燥。

进一步地，还需通过高液相质谱(HPLC)进一步纯化，采用含0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈水溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为210nm。

进一步地，所述制备方法包括以下步骤：

1)500mg固相多肽合成工艺制备的直链肽置于容器内，加入乙腈和二甲基亚砜按1:1～10:1比例配置的混合溶液20ml；所述直链肽为线性组胺素的C端连接含有炔基的Xaa1，N端连接含有叠氮基的Xaa2，所述Xaa2上结合树脂；或为线性组胺素C端连接含有叠氮基的Xaa3，N端连接含有炔基的Xaa4，所述Xaa4上结合树脂；

2)加入500mg树脂；

3)加入20mM碘化亚铜；

4)加入30μL 2,6-二甲基吡啶；

5)用氮气吹泡2-5分钟；

6)盖紧容器并封闭；

7)在室温下搅拌反应40分钟；

8)用饱和乙二胺四乙酸二钠溶液摇晃清洗2次，每次10分钟，去除洗涤液；

9)用水清洗1次，用乙腈清洗1次，二氯甲烷清洗1次，用乙醚清洗一次，去除洗涤液；

10)真空干燥1小时；

11)切割：配置切割混合液，包括三氟乙酸:苯酚:苯甲硫醚:三异丙基硅烷＝95.5:2:2:0.5,v/v)，取20ml切割混合液加入步骤10)获得的样品中，摇晃3小时，将多肽从树脂上切割下来。用冷乙醚过滤多肽，清洗3次，干燥；

12)高效液相质谱纯化。

研究证明，采用本发明提供的环化方法，可以对长肽链进行首尾环化，对任意组胺素Hst1～Hst12均能成功环化，从而制得含三唑环的组胺素环肽，制备环肽过程简便、纯度高、活性高、且易于规模化工业生产。

再一方面，本发明提供了一种组胺素环肽在促进伤口愈合或皮肤护理方面的用途，所述组胺素环肽的结构式如式7或式8所示：

其中，n＝1～3，a＝4。

本发明通过铜催化叠氮-炔环加成反应制得含有三唑环的组胺素环肽，该反应仅生成1,4-双取代的[1,2,3]三唑类产物，在很多方面都与天然肽键有相似之处，如形成氢键的能力、平面性、1,4位取代基的距离以及肽骨架的构象限制等。因此用该修饰肽中三唑替代肽键，可展现出与天然多肽相似的二级结构。

本发明的有益效果为：

1、创造性地采用铜催化叠氮-炔环加成反应制得一系列带有三唑环的组胺素首尾环肽；

2、制得的组胺素首尾环肽的活性与线性组胺素相比提高了1000倍以上，拥有极佳的稳定性和抗生物代谢降解作用，并能改善溶解性，构象独特，显提升组胺素的生物活性和临床功效；

3、本发明采用的环化过程温和简便、效率高、制得的组胺素首尾环肽纯度更高，具有非常好的规模化及工业化应用前景。

附图说明

图1为实施例1中的环化反应产物的质谱MS检测图谱；

图2为实施例1中的环化反应产物的高效液相色谱HPLC检测图谱；

图3为实施例1中的环化反应产物的红外IR检测图谱；

图4为实施例10中的四组小鼠创面在3、5天的愈合情况照片；

图5为实施例10中的四组小鼠创面在3、5、7天的创面愈合率情况对比示意图；

图6为实施例10中的四组创面组织第10天的HE染色照片；

图7为实施例10中的四组创面肉芽组织新生厚度和真皮间隙长度对比示意图，其中(1)为真皮间隙对比示意图，(2)为新生肉芽组织厚度对比示意图；

图8为实施例10中的四组创面组织第10天的Masson染色照片；

图9为实施例10中的四组创面组织第10天的创面胶原表达量对比示意图；

图10为实施例10中的四组创面组织第10天新生CD31阳性血管数结果示意图；

图11为实施例10中的四组创面组织第10天新生CD31阳性血管数定量分析对比示意图；

图12为实施例10中的四组创面组织第10天VEGF表达量结果示意图；

图13为实施例10中的四组创面组织第10天VEGF表达量定量分析对比示意图；

图14为实施例11中的五组划痕细胞培养0、12、24h后的显微镜照片；

图15为实施例11中使用GraphPad Prism 5.0对五组创面面积进行统计分析结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明采用的试剂均为市售试剂。

实施例1丙炔甘氨酸-Hst1环肽的制备

本实施例的制备方法为：

1、在甘氨酸上引入炔基和保护基团Fmoc，在赖氨酸上引入叠氮基和保护基团Fmoc，得到用于连接C端的Fmoc-丙炔甘氨酸(式18)(本实施例直接采用购自Merck KGaA的Fmoc-丙炔甘氨酸)和用于连接N端的Fmoc-叠氮赖氨酸(式19)(本实施例直接采用购自Merck KGaA的Fmoc-叠氮赖氨酸)，结构式如下所示：

2、在Fmoc-叠氮赖氨酸的基础上，从右向左，采用多肽固相合成法(SPPS)，一步步合成Hst1的直链氨基酸，并在Hst1的C端连接Fmoc-丙炔甘氨酸；

3、利用步骤2制备的Hst1直链多肽，通过铜催化叠氮-炔环加成反应制备Hst1环肽，所述制备方法包括以下步骤：

1)500mg Hst1直链多肽置于容器内，加入乙腈和二甲基亚砜按4:1比例配置的混合溶液20ml；

2)加入500mg树脂Rink Amide MBHA Resin(购自Merck KGaA)；

3)加入20mM碘化亚铜；

4)加入30μl 2,6-卢替丁(二甲基吡啶)；

5)用氮气吹泡5分钟；

6)盖紧容器并封闭；

7)在室温下搅拌反应40分钟；

8)用饱和乙二胺四乙酸二钠溶液摇晃清洗2次，每次10分钟，去除洗涤液；

9)用水清洗1次，用乙腈清洗1次，二氯甲烷清洗1次，用乙醚清洗一次，去除洗涤液；

10)真空干燥1小时；

11)剪切：配置剪切混合液，包括95.5％的三氟乙酸、2％的苯酚水溶液、2％的苯甲硫醚、0.5％的三异丙基硅烷，取20ml剪切混合液加入步骤10)获得的样品中，摇晃3小时，将多肽从模板上剪切下来；用冷乙醚过滤多肽，清洗3次，干燥；

12)高液相质谱(HPLC)纯化，采用含0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈水溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为210nm。

制得456mg的丙炔甘氨酸-Hst1环肽。

丙炔甘氨酸-Hst1环肽的结构式如式20所示：

经质谱检测，检测图谱如图1所示，其纯度为95％以上，其回收率为91％。经HPLC检测，检测图谱如图2所示；经红外IR检测，检测图谱如图3所示，显示有三氮唑特征峰(3100cm

用同样的方法，可依次得到Hst2～Hst12首尾环肽，在此不赘述。

实施例2高丙炔甘氨酸-Hst1环肽的制备

本实施例的制备方法为：

1、在甘氨酸上引入炔基和保护基团Fmoc，在赖氨酸上引入叠氮基和保护基团Fmoc，分别制得用于连接C端的Fmoc-丙炔甘氨酸(式21)(本实施例直接采用购自MerckKGaA的Fmoc-丙炔甘氨酸)，和用于连接N端的Fmoc-叠氮赖氨酸(式19)(本实施例直接采用购自Merck KGaA的Fmoc-叠氮赖氨酸)，结构式如下所示：

2、在Fmoc-叠氮赖氨酸的基础上，从右向左，采用多肽固相合成法(SPPS)，一步步合成Hst1的直链氨基酸，并在Hst1的C端连接Fmoc-丙炔甘氨酸；

3、利用步骤2制备的Hst1直链多肽，通过铜催化叠氮-炔环加成反应制备Hst1环肽，所述制备方法按照实施例1提供的方法制备。

制得451mg的丙炔甘氨酸-Hst1环肽。

丙炔甘氨酸-Hst1环肽的结构式如式22所示：

经质谱检测，其纯度为95％以上，其回收率为90％。经红外IR检测，显示有三氮唑特征峰(3100cm

用同样的方法，可依次得到Hst2～Hst12首尾环肽，在此不赘述。

实施例3双高丙炔甘氨酸-Hst1环肽的制备

本实施例的制备方法为：

1、在甘氨酸上引入炔基和保护基团Fmoc，在赖氨酸上引入叠氮基和保护基团Fmo，分别制得用于连接C端的Fmoc-丙炔甘氨酸(式23)(本实施例直接采用购自Merck KGaA的Fmoc-丙炔甘氨酸)和用于连接N端的Fmoc-叠氮赖氨酸(式19)(本实施例直接采用购自Merck KGaA的Fmoc-叠氮赖氨酸)，结构式如下所示：

2、在Fmoc-叠氮赖氨酸的基础上，从右向左，采用多肽固相合成法(SPPS)，一步步合成Hst1的直链氨基酸，并在Hst1的C端连接Fmoc-丙炔甘氨酸；

3、利用步骤2制备的Hst1直链多肽，通过铜催化叠氮-炔环加成反应制备Hst1环肽，所述制备方法按照实施例1提供的方法制备。

制得453mg的丙炔甘氨酸-Hst1环肽。

丙炔甘氨酸-Hst1环肽的结构式如式24所示：

经质谱检测，其纯度为95％以上，其回收率为91％。经红外IR检测，显示有三氮唑特征峰(3100cm

用同样的方法，可依次得到Hst2～Hst12首尾环肽，在此不赘述。

实施例4多肽浓度对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用100、300、500、700mg的直链多肽加入20ml乙腈和二甲基亚砜按4:1比例配置的混合溶液中，进行反应，计录反应所需时间，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例(包括分子间缩合的二倍体、三倍体及四倍体等副产物，通过质谱分子量确认，计算副产物占多肽首尾环肽的比例)，从而考察不同的多肽浓度对环化反应的影响，结果如表1所示。

表1不同直链多肽加量对环化反应的影响

由表1可见，通过不同的直链多肽加量对环化反应存在明显影响，随着直链多肽加量的上升，反应速度变慢，收率和副反应发生比例也都相应发生变化，其中直链多肽加量为500mg时，反应速度仍较快，而且收率达到91％，且副反应发生比例非常低，因此20ml溶剂中，最优选的直链多肽加量为500mg。

实施例5不同的溶剂对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用如表2所示的不同溶剂进行反应，计录反应所需时间，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例，从而考察不同的溶剂对环化反应的影响，结果如表2所示。

表2不同溶剂对环化反应的影响

由表2可见，通过不同的溶剂对环化反应存在明显影响，其原因主要是因为不同溶剂产生的位阻、电性、极性、质子性、氢键键和能力和比例不一样，影响反应速度、副反应副产物如二聚体、三聚体多聚体和分解产物等。因此优选采用乙腈：二甲基亚砜(4:1)作为溶剂。

实施例6不同的树脂对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用WangResin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin、2-Chlorotrityl Resin、PEGylated Rink-modified TentaGel(TGR)resin、Aminomethyl Resin、Sieber AmideResin、PAM Resin，共计8种树脂，进行反应，计录反应所需时间，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例，从而考察不同的树脂对环化反应的影响，结果如表3所示。

表3不同树脂对环化反应的影响

由表3可见，选用不同的树脂对环化反应存在明显影响，反应时间、收率和副反应发生比例都发生明显变化，最优选采用Rink Amide MBHA Resin树脂，能使产物收率达到91％以上，副反应比例降至3％，可见与Rink Amide MBHA Resin树脂结合能阻止副反应的发生，提高环化反应的效率。

实施例7不同的催化剂对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用碘化亚铜CuI、氯化亚铜CuCl、碘化亚铜/亚磷酸三乙酯CuI·P(OEt)

表4不同催化剂对环化反应的影响

由表4可见，选用不同的催化剂对环化反应存在明显影响，反应时间、收率、副反应发生比例都存在明显变化，因此最优选碘化亚铜作为催化剂。

实施例8不同配体对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用2,6-二甲基吡啶(2,6-lutidine)、二乙胺、三乙胺、正丙胺、二异丙基胺、三丁胺、二异丙基乙胺DIPEA、二甲氨基吡啶DMAP作为配体，进行反应，计录反应所需时间，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例(包括分子间缩合的二倍体、三倍体及四倍体等副产物，通过质谱分子量确认，计算副产物占多肽首尾环肽的比例)，从而考察不同的配体对环化反应的影响，结果如表5所示。

表5不同配体对环化反应的影响

由表5可见，选用不同的配体对环化反应存在明显影响，反应时间、收率、副反应发生比例都存在明显变化，因此最优选2,6-二甲基吡啶作为配体，可以显著缩短反应时间，提高收率，并降低副反应发生比例。

实施例9反应条件对环化反应的影响

本实施例按照实施例1提供的方法制备丙炔甘氨酸-Hst1环肽，分别采用如表6所示的不同反应条件进行反应，计录反应所需时间，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例(包括分子间缩合的二倍体、三倍体及四倍体等副产物，通过质谱分子量确认，从而计算副产物占多肽首尾环肽的比例)，从而考察不同的反应条件对环化反应的影响，结果如表6所示。

表6不同反应条件对环化反应的影响

由表6可见，选用不同的反应条件对环化反应存在明显影响，反应速度、纯度、及副反应发生比例都存在明显变化，因此最优选反应条件为氮气吹泡5分钟，25℃。

实施例10环肽Hst1对伤口修复的作用

本实施例采用实施例1提供的丙炔甘氨酸-Hst1环肽(Click-Histatin1)、实施例4提供的Sortase A酶法制备的环化Hst1(Sortase A-cyclic histatin1)，以及直链肽Hst1(Histatin1)进行动物试验，观察丙炔甘氨酸-Hst1对小鼠创面愈合率的影响，其中直链肽Hst1的浓度为10μM，丙炔甘氨酸-Hst1环肽浓度为0.1μM、Sortase A酶法制备的环化Hst1浓度分别为0.1μM。

1材料与方法

本研究经过中国人民解放军南部战区总医院医学动物中心和伦理委员会批准。

1.1动物及主要试剂与仪器来源

12只健康雄性无特殊病原体级C57 BL/6小鼠，6-8周龄，体质量22-28g，购自广东省实验动物中心。二氨基联苯胺(DAB)购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗CD31抗体,鼠抗VEGF抗体，羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购自于美国Servicebio公司，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原缓冲液、免疫组化笔、牛血清白蛋白、胶原酶A、苏木素均购自武汉谷歌生物科技有限公司，倒置荧光显微镜购自日本尼康有限公司，脱水机购自武汉俊杰电子有限公司，石蜡切片机购自上海徕卡仪器有限公司。

1.2动物分组与处理

12只健康雄性无特殊病原体级C57 BL/6小鼠(购自广东省实验动物中心)，6-8周龄，体质量22-28g。腹腔内注射5ml/kg 1％戊巴比妥钠进行麻醉，待小鼠无角膜反射后，小心脱去小鼠背部的毛发，并用酒精消毒。每只小鼠背部用圆形皮肤打孔器制备2个1cm×1cm全层皮肤缺损创面。将12只小鼠按照随机数字表法分为Control(空白)组3只、10μM直链肽Hst1(Histatin1)组3只、0.1μM丙炔甘氨酸-Hst1环肽(Click-Histatin1)组3只、0.1μMSortase A酶法制备的环化Hst1(Sortase A-cyclic histatin1)组3只。每个创面分别加入0.5ml的四种药物，每天给药直到实验组创面愈合，在手术后的0、3、5、7、10天分别进行拍照，并于第10天进行创面组织取材，进行后续病理染色。

1.3观测指标

1.3.1创面愈合率

伤后0、3、5、7、10天，观察小鼠创面愈合大体情况，用数码相机进行拍照(见图4)并计算创面愈合率(见图5)。创面愈合率＝(伤后即刻创面面积–各时间点未愈合创面面积)÷伤后即刻创面面积×100％。

1.3.2组织形态学检测

将创面标本放于4％多聚甲醛固定48小时，自来水冲洗10分钟，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作4μm厚切片。取部分切片行HE染色和Masson染色，分别于40倍、100倍、200倍，400倍倒置荧光显微镜下观察创面肉芽组织厚度，真皮间隙的长度，胶原新生情况(见图6和图7)。每只鼠取5张切片，每张切片选取5个视野。用软件Image-pro Plus进行数据分析。

1.3.3免疫组织化学法染色

将1.3.2中制备的伤后10天石蜡切片，经二甲苯脱蜡、复水，0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH值6.0)抗原热修复20分钟，体积分数10％过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10分钟，50g/L牛血清白蛋白封闭2小时。加入兔抗鼠CD31一抗(稀释比1:300)和鼠抗VEGF(稀释比1:100)，4℃孵育过夜，PBS清洗。复温1小时，PBS清洗，滴加即用型生物素化的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗，孵育2小时，PBS清洗。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片。每只鼠取5张切片，每张切片选取5个视野，400倍倒置荧光显微镜下观察并用Image-pro Plus软件分析CD31阳性血管数(见图8)和VEGF表达量(见图9，棕色所示)。

1.4统计学处理

计量数据采用M±SD表示，应用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析和独立样本t检验来检测各组间差异是否有统计学意义，两两比较采用Bonferroni检验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为差异有统计学意义，p>0.05时没有统计学意义。

2结果

2.1大体观察和创面愈合率

手术后3、5、7、10天，四组创面随着时间增长均逐渐缩小，0.1μM Click-Histatin1组在3天和5天时创面面积均小于其余三组(图4)。由图5可见，在第3、5、7天，0.1μM Click-Histatin1组创面愈合率均显著高于Control组，并在第3天显著高于0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组(P＜0.05)，而10μM Histatin1组在第7天创面愈合率和0.1μM Click-Histatin1组无显著性差异，这主要是由于第7天时小鼠伤口已基本完成修复，没有借鉴意义；其中§：0.1μM Click-Histatin1组，10μM Histatin组与Control组有显著性差异；﹟：0.1μM Click-Histatin1组和0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组有显著性差异(P＜0.05)。可见0.1μM Click-Histatin1组能够更好的促进创面愈合。

2.2组织形态学观察

为了评估四组在创面肉芽组织新生厚度和真皮间隙长度，将创面组织进行HE染色(图6)。第10天，0.1μM Click-Histatin1组创面两端真皮间隙长度最短，0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组其次，Control组和10μM Histatin1组真皮间隙最长(P＜0.05)(图7(1))；且0.1μM Click-Histatin1组新生肉芽组织厚度高于其余三组(图7(2))；其中，§：0.1μM Click-Histatin1组、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组与Control组有显著性差异；﹟：0.1μM Click-Histatin1组和10μM Histatin1组有显著性差异(P＜0.05)。表明0.1μMClick-Histatin1组能够更好的促进创面肉芽组织再生。

为了进一步评估0.1μM Click-Histatin1、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1和10μM Histatin1对于创面胶原新生的效果，将组织标本进行Masson染色(图8)。由图8可见，术后10天，0.1μM Click-Histatin1组、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组和10μMHistatin1组沉积大量新生胶原，排列整齐(蓝色为阳性表达)标尺＝100μm。量化分析表明(图9)：在第10天，0.1μM Click-Histatin1组、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组和10μM Histatin1组创面胶原表达量显著高于Control组(P＜0.05)，胶原排列规则致密，其中0.1μM Click-Histatin1组创面胶原表达量最高。

2.3免疫组化染色

CD31和VEGF是血管生成标志物，通过免疫组化染色评估0.1μM Click-Histatin1、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1和10μM Histatin1对于创面血管新生的影响。

免疫组化染色评估4组创面新生CD31阳性血管数结果如图10和11所示。由图10可见，术后10天，0.1μM Click-Histatin1组和10μM Histatin1组每个视野下CD31阳性血管数显著高于Control(箭头所示)标尺＝50μm；由图11可见，定量分析CD31阳性血管数，0.1μMClick-Histatin1组新生血管数更多(19.8±2.6)，高于其他三组。§：0.1μM Click-Histatin1组、10μM Histatin1组、0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组与Control组有显著性差异(P＜0.05)。

免疫组化染色评估4组创面VEGF表达量结果如图12和13所示。由图12，术后10天，0.1,μM Click-Histatin1组和10μM Histatin1组VEGF阳性表达水平更高(箭头所示)标尺＝50μm；由图13，VEGF定量分析表明0.1μM Click-Histatin1组和10μM Histatin1组VEGF表达量比Control组高，且0.1μM Click-Histatin1组显著高于0.1μM Sortase A-cyclichistatin1组。§：0.1μM Click-Histatin1组、10μM Histatin1组与Control组有显著性差异(P＜0.05)；﹟：0.1μM Click-Histatin1组和0.1μM Sortase A-cyclic histatin1组有显著性差异(P＜0.05)。

实施例11划痕实验

同时将成纤维细胞(NIH/3T3；GNM 6；Chinese Academy of Sciences,China)按照2×106/孔的数量接种至6孔板中并培养至70～80％密度。在进行实验前对细胞饥饿处理8-12小时。向培养基中加入丝裂霉素C(Sigma Aldrich,USA)使其在培养基中浓度为15μg/ml，处理3小时后更换培养基。使用200μl枪头垂直于孔板底部用同样的力度进行划痕，划痕结束后用PBS漂洗2次。向每孔中加入适量DEME培养基(10％FBS，1％双抗)，除空白对照组外分别加入10μΜ直链Hst1、0.01μΜ丙炔甘氨酸-Hst1环肽、0.1μΜ丙炔甘氨酸-Hst1环肽、1μΜ丙炔甘氨酸-Hst1环肽设置为实验组。在0小时的时候使用显微镜(Olympus,Japan)对各组细胞进行拍照。之后将细胞放置于37℃，5％CO

W％(划痕愈合率)＝(W0-Wt)/W0×100％

W0＝初始划痕面积

Wt＝剩余划痕面积

使用GraphPad Prism 5.0对各组创面面积进行统计分析，结果如图15所示。由图15可见，0.01μΜ丙炔甘氨酸-Hst1环肽对创面修复作用依然能达到甚至超过10μΜ直链Hst1的效果。

本实施例还经实验证明，0.01μΜ高丙炔甘氨酸-Hst1环肽和双高丙炔甘氨酸-Hst1环肽对创面修复作用也能达到10μΜ直链Hst1的效果。

实施例12环肽的活性对比

本实施例分别采用实施例1、2、3制备的丙炔甘氨酸-Hst1环肽、高丙炔甘氨酸-Hst1环肽、双高丙炔甘氨酸-Hst1环肽与直链Hst1，以及采用如Sortase A as a tool forhigh-yield histatin cyclization，Jan G.M.Bolscher，The FASEB Journal.ResearchCommunication文献提供的Sortase A酶法和酰胺键成环的方法制备环化Hst1，计算反应速度，并通过检测HPLC检测反应产物的收率，计算反应产物中副反应发生的比例(包括分子间缩合的二倍体、三倍体及四倍体等副产物，通过质谱分子量确认，从而计算副产物占多肽首尾环肽的比例)，并进行活性对比，活性对比方法为通过如实施例11所提供的划痕实验，计算达到相同药效所需的剂量，结果如表7所示。

表7活性比较

由表7可见，采用本发明提供的方法制备的环肽，其活性比直链肽提高了1000多倍，而且收率更高，副反应非常少，且仅需要催化剂量的环合试剂，制备成本低。使用传统酰胺键直接成环的方法，仅得到3％目标环合产物，且反应时间过长，需要使用当量级别的催化剂及反应试剂，其原因是Hst1肽链较长，传统酰胺键直接成环难以实现长肽链的首尾成环。而采用Sortase A酶法制备的环化Hst1，催化效率低(摩尔当量高达底物肽的三分之一)，反应时间长(21小时)，制得的环肽溶解性差；此外，该方法需要大的识别单元，需要在首尾两端同时引入冗余的氨基酸序列，不必要地增加了原始多肽的长度和序列复杂度，原子经济性差，且有多聚物产生风险；而且其转肽酶反应的机理具有可逆性，有导致已生成的环肽裂解的风险；同时由于Sortase A酶属于细菌酶，容易含有细菌产物残留，从而带来免疫原、致病微生物等工艺安全问题，因此Sortase A酶法难以制备规模化可工业生产的高纯度的Hst1环肽。

序列表

SEQ ID NO.1

线性的Hst1：Asp pSer His Glu Lys Arg His His Gly Tyr Arg Arg Lys PheHis Glu Lys His His Ser His Arg Glu Phe Pro Phe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ser AsnTyr Leu Tyr Asp Asn

SEQ ID NO.2

线性的Hst2：Arg Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Glu Phe ProPhe Tyr Gly Asp Tyr Gly Ser Asn Tyr Leu Tyr Asp Asn

SEQ ID NO.3

线性的Hst3：Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys PheHis Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr Arg Ser Asn Tyr Leu Tyr Asp Asn

SEQ ID NO.4

线性的Hst4：Arg Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr ArgSer Asn Tyr Leu Tyr Asp Asn

SEQ ID NO.5

线性的Hst5：Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys PheHis Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr

SEQ ID NO.6

线性的Hst6：Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys PheHis Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr Arg

SEQ ID NO.7

线性的Hst7：Arg Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr

SEQ ID NO.8

线性的Hst8：Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr

SEQ ID NO.9

线性的Hst9：Arg Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr Arg

SEQ ID NO.10

线性的Hst10：Lys Phe His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr Arg

SEQ ID NO.11

线性的Hst11：Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg

SEQ ID NO.12

线性的Hst12：Lys Arg His His Gly Tyr Lys