水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子及其两相制备方法

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子及其两相制备方法。

背景技术

过渡金属离子在生命系统中扮演着重要角色，它们是生物大分子的重要成分，在体内生理活动中参与信号传递、催化生化反应，与很多重大疾病的发生、发展及治疗密切相关。近年来，过渡金属离子在抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物医学领域展现出巨大潜力，在癌症诊疗方面的成像及治疗功能尤为突出。过渡金属离子具有核磁共振成像、光声成像、荧光成像、X射线断层扫描成像等成像功能，还可以通过诱导DNA损伤、催化芬顿反应产生高毒性羟基自由基、激活cGAS-STING免疫通路等机制引起癌细胞死亡。然而，游离的过渡金属离子缺乏靶向性，对正常组织的毒副作用极大，实际使用时必须进行络合处理。

紫草素是中药紫草中提取出的主要活性物质，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等药理作用。从抗肿瘤作用机制来看，紫草素具有抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和坏死以及诱导线粒体功能障碍等作用。目前限制紫草素应用的主要问题包括水溶性差、生物利用度低、半衰期短等。

如能借助纳米技术，实现过渡金属离子和紫草素结合，尤其是整合并优化二者功能，将为生物医药领域提供一类新材料。但是，由于紫草素的强疏水性，其金属复合物在水相溶液中会迅速沉淀，难以获得适合生物医学领域使用的纳米尺度粒子。目前，仅有强配位的三价铁离子能够与紫草素形成复合纳米粒子，其他过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子尚未开发成功。这是因为不同过渡金属离子的配位能力差别很大，很难建立制备复合纳米粒子的普适方法。因此，发展水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子的制备方法具有重要实用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子及其两相制备方法。

本发明以过渡金属离子盐和紫草素作为原料，预先将紫草素溶解在与水互溶的有机溶剂相中、过渡金属离子溶解在水相或与水互溶的有机溶剂相中，在室温下将两相涡旋混合数秒即可完成过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子的制备，两相溶剂起到促进金属离子与紫草素形成复合纳米粒子的作用。通过控制过渡金属离子盐以及反应溶剂的种类和用量，可以调控复合纳米粒子的组成以及尺寸，复合纳米粒子水相分散性良好，可均匀分散在水中形成透明溶液。该制备方法耗时短、重复性好、条件温和、提纯简单，适合批量生产。更重要的是，复合纳米粒子具有pH和氧化还原拆解特性，利于在弱酸性、高谷胱甘肽浓度的肿瘤微环境下发挥功能，同时避免金属离子在正常组织中过早泄露(如实施例14及实施例15)。此外，复合纳米粒子还可以作为载体负载小分子药物或生物活性物质，从而拓展在生物医学领域的深入应用。

本发明所述的水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子的两相制备方法，其步骤如下：

预先将紫草素溶解在与水互溶的有机溶剂相中，将过渡金属离子溶解在水相或与水互溶的有机溶剂相中，再将上述两种溶液直接混合或混合后加入水相溶剂并涡旋混匀，离心提纯后得到水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子。

其中，所用的过渡金属离子盐为乙酸铜(II)、二氯化铜(II)、硫酸铜(II)、硝酸铜(II)、乙酸锰(II)、二氯化锰(II)、硫酸锰(II)、硝酸锰(II)、乙酸钪(III)、三氯化钪(III)、硫酸钪(III)、硝酸钪(III)、乙酸铈(III)、氯化铈(III)、碳酸铈(III)、乙酸镱(III)、氯化镱(III)、硫酸镱(III)、硝酸镱(III)、乙酸铕(III)、氯化铕(III)、硫酸铕(III)、硝酸铕(III)等；过渡金属离子盐可以单独使用其中的一种，也可以混合使用上述的两种或多种；与水互溶的有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃；水相为纯水或三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液；金属离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.005～0.6mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.04～0.1mg/mL(进一步，过渡金属离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.008～0.58mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.041～0.082mg/mL)；涡旋混匀时间为5～10秒；通过调节紫草素的用量、金属离子盐的种类和用量、有机溶剂和水相的种类和体积，得到尺寸范围为30～200nm的水相分散的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子；离心提纯是在6000～10000转/分钟转速下离心5～10分钟，弃上清后用去离子水洗涤离心产物2～4次。

与现有技术相比，本发明存在如下有益技术效果：

(1)本发明所制得的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子在水以及水相溶液中以纳米尺寸存在，且分散性好、生物稳定性好。

(2)本发明所制得的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子中过渡金属离子可以是一种也可以是多种，并且其含量可以通过金属离子盐的用量调控，兼具多种过渡金属离子的功能，更好地用于纳米医学领域。

(3)本发明所制得的过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子可以作为纳米载体负载小分子药物等，还可以在其表面修饰靶向分子，从而增加功能性并提高靶向性，使其在生物医学领域中具有更大的应用潜力。

(4)本发明制备方法的反应条件温和、简单、进程快，数秒内即反应完毕，时间成本低；可通过调节紫草素的用量、过渡金属离子盐的种类和用量、有机溶剂和水相的种类和体积调控过渡金属离子/紫草素复合纳米粒子组成和尺寸；方法简单、重复性好，适合批量生产。

附图说明

图1：对应实施例1制备的铜/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，水的用量为4mL，复合纳米粒子的直径为80nm。

图2：对应实施例2制备的铜/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，水的用量为5mL，复合纳米粒子直径为70nm。

图3：对应实施例3制备的铜/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，水的用量为6mL，复合纳米粒子直径为90nm。

图4：实施例2制备的铜/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、二氯化铜的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至520nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明铜/紫草素复合纳米粒子的形成。

图5：对应实施例4制备的锰/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，使用的有机溶剂为丙酮，复合纳米粒子的直径为60nm。

图6：对应实施例5制备的锰/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，使用的有机溶剂为乙腈，复合纳米粒子的直径为55nm。

图7：实施例4制备的锰/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、二氯化锰的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至560nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明锰/紫草素复合纳米粒子的形成。

图8：对应实施例6制备的钪/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为80nm。

图9：实施例6制备的钪/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、三氯化钪的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至560nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明钪/紫草素复合纳米粒子的形成。

图10：对应实施例7制备的铈/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为75nm。

图11：实施例7制备的铈/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、乙酸铈的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至560nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明铈/紫草素复合纳米粒子的形成。

图12：对应实施例8制备的镱/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为65nm。

图13：实施例8制备的镱/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、乙酸镱的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至560nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明镱/紫草素复合纳米粒子的形成。

图14：对应实施例9制备的铕/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为85nm。

图15：实施例9制备的铕/紫草素复合纳米粒子及紫草素单体、乙酸铕的紫外可见吸收光谱图。从紫外可见吸收光谱图可见，复合纳米粒子在330nm出现金属与紫草素的特征配位吸收峰，并且在形成复合纳米粒子后，紫草素单体516nm处吸收峰红移至560nm处，这是由于紫草素在复合纳米粒子中堆积导致的能量降低，证明铕/紫草素复合纳米粒子的形成。

图16：对应实施例10制备的铜/钪/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为50nm。

图17：对应实施例11制备的铜/镱/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为150nm。

图18：对应实施例12制备的铜/铕/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为200nm。

图19：对应实施例13制备的锰/镱/紫草素复合纳米粒子的透射电镜照片，复合纳米粒子的直径为90nm。

图20：对应实施例14铜/紫草素复合纳米粒子的紫外可见吸收光谱，即拆解实验曲线。

图21：对应实施例15锰/紫草素复合纳米粒子在pH 6.5条件下的紫外可见吸收光谱，即拆解实验曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，而不是要以此对本发明进行限制。

实施例1

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入到4mL纯水中(铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.012mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.062mg/mL)，涡旋混合10秒，再以6000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为80nm的铜/紫草素复合纳米粒子。

实施例2

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入到5mL纯水中(铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.010mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.049mg/mL)，涡旋混合10秒，以6000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为70nm的铜/紫草素复合纳米粒子。

实施例3

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入到6mL纯水中(铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.008mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.041mg/mL)，涡旋混合10秒，以6000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为90nm的铜/紫草素复合纳米粒子。

实施例4

将紫草素溶解在丙酮中，配制浓度为5mg/mL的紫草素丙酮溶液；将无水二氯化锰溶解在三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(pH＝8.5)中，配制浓度为0.08mg/mL的二氯化锰的三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液；室温下将50μL紫草素丙酮溶液加入3mL二氯化锰三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(锰离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.079mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以10000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为60nm的锰/紫草素复合纳米粒子。

实施例5

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将无水二氯化锰溶解在三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(pH＝8.5)中，配制浓度为0.08mg/mL的二氯化锰三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL二氯化锰三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(锰离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.079mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以10000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为55nm的锰/紫草素复合纳米粒子。

实施例6

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将六水合三氯化钪溶解在水中，配制浓度为0.033mg/mL的三氯化钪水溶液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL三氯化钪水溶液(钪离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.032mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为80nm的钪/紫草素复合纳米粒子。

实施例7

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将乙酸铈水合物溶解在水中，配制浓度为0.59mg/mL的乙酸铈水溶液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL乙酸铈水溶液(铈离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.58mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为75nm的铈/紫草素复合纳米粒子。

实施例8

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将乙酸镱四水合物溶解在水中，配制浓度为0.16mg/mL的乙酸镱水溶液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL乙酸镱水溶液(镱离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.157mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为的65nm镱/紫草素复合纳米粒子。

实施例9

将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将乙酸铕水合物溶解在水中，配制浓度为0.16mg/mL的乙酸铕水溶液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL乙酸铕水溶液(锰离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.157mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为85nm的铕/紫草素复合纳米粒子。

实施例10

将六水合三氯化钪溶解在水中，配制浓度为0.033mg/mL的三氯化钪水溶液；将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入3mL三氯化钪水溶液(钪离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.032mg/mL，铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.016mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为50nm的铜/钪/紫草素复合纳米粒子。

实施例11

将乙酸镱四水合物溶解在水中，配制浓度为0.16mg/mL的乙酸镱水溶液；将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入3mL乙酸镱水溶液(镱离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.157mg/mL，铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.016mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为150nm的铜/镱/紫草素复合纳米粒子。

实施例12

将乙酸铕水合物溶解在水中，配制浓度为0.16mg/mL的乙酸铕水溶液；将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；将二水合二氯化铜溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的二氯化铜乙腈溶液；将50μL紫草素乙腈溶液与10μL二氯化铜乙腈溶液混合，配制混合溶液；室温下将上述混合溶液加入3mL乙酸铕水溶液(铕离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.157mg/mL，铜离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.016mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为200nm的铜/铕/紫草素复合纳米粒子。

实施例13

将乙酸镱四水合物和无水二氯化锰同时溶解在三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(pH＝8.5)中，配制乙酸镱和二氯化锰浓度分别为0.16和0.08mg/mL的三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液；将紫草素溶解在乙腈中，配制浓度为5mg/mL的紫草素乙腈溶液；室温下将50μL紫草素乙腈溶液加入3mL上述三羟甲基氨基甲烷水相缓冲液(镱离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.157mg/mL，锰离子盐在混合反应体系中的最终浓度为0.079mg/mL，紫草素在混合反应体系中的最终浓度为0.082mg/mL)，涡旋混合10秒，以8000转/分钟的转速离心5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到平均直径为90nm的锰/镱/紫草素复合纳米粒子。

实施例14

谷胱甘肽+新亚铜灵组：200μL、10mM谷胱甘肽水溶液与800μL、10mM新亚铜灵试剂乙醇溶液混合，室温反应20min，测定紫外可见吸收光谱。

铜/紫草素复合纳米粒子+谷胱甘肽组：200μL、10mM谷胱甘肽水溶液与800μL、50μg/mL铜/紫草素复合纳米粒子(实施例2制备得到)乙醇溶液混合，室温反应20min，测定紫外可见吸收光谱。

铜/紫草素复合纳米粒子+谷胱甘肽+新亚铜灵组：200μL、10mM谷胱甘肽水溶液与800μL、含有50μg/mL铜/紫草素复合纳米粒子(实施例2制备得到)和10mM新亚铜灵试剂的乙醇溶液混合，室温反应20min，测定紫外可见吸收光谱，如图20所示。

铜/紫草素复合纳米粒子+谷胱甘肽+新亚铜灵组相比于其他组，在紫外可见吸收光谱图中出现460nm处的特征吸收峰，证明谷胱甘肽将铜/紫草素复合纳米粒子中的二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与新亚铜灵试剂特异性反应生成吸收峰位于460nm处的黄色络合物。

实施例15

将锰/紫草素复合纳米粒子(实施例4制备得到)分散在水、pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)、pH 6.5的PBS中(锰/紫草素复合纳米粒子在各溶液中的终浓度均为50μg/mL)；将紫草素溶解在乙腈中(紫草素终浓度为0.1mg/mL)，摇床1小时，测定各溶液的紫外可见吸收光谱，如图21所示。pH 6.5条件下，330nm处的吸收峰消失，560nm处峰蓝移至516nm，整体吸收峰与紫草素单体基本一致，证明酸性条件下锰/紫草素复合纳米粒子被拆解，释放出紫草素单体。