一种从红托竹荪中制备蛋白质冻干粉、多肽冻干粉与氨基酸冻干粉的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质提取技术领域，尤其涉及一种从红托竹荪中制备蛋白质冻干粉、多肽冻干粉与氨基酸冻干粉的方法。

背景技术

竹荪(Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers)Fisch)是鬼笔科竹荪属真菌，又名竹笙、竹参，是寄生在枯竹根部的一种隐花菌类。常见并可供食用的竹荪有4种：长裙竹荪、短裙竹荪、棘托竹荪和红托竹荪。干品竹荪中粗蛋白的含量高达37.94％，总糖含量为35.41％，粗纤维含量为4.74％，粗脂肪含量为4.98％，灰分含量为10.56％。可见，竹荪菌体含有丰富的蛋白质及氨基酸成分，为蔬菜和水果所不及，且所含的氨基酸大多以菌体蛋白的形态存在，不易流失，因此竹荪可以作为良好的蛋白质来源。

但由于竹荪的细胞特性，导致其蛋白提取率较低，而少量食用竹荪又不能达到有效摄入优质蛋白质的目的。因此，如何高效提取竹荪蛋白质并提高人体利用率是目前需要解决的技术问题之一。

发明内容

为解决上述问题，本发明以红托竹荪为原料，将有机溶剂浸泡、碱法沉淀、酶解等方法相结合，通过离心，冷冻干燥等工艺实现了红托竹荪蛋白质、多糖与氨基酸的高效提取。

本发明所述从红托竹荪中制备蛋白质冻干粉、多肽冻干粉与氨基酸冻干粉的方法包括以下步骤：

(1)将红托竹荪鲜品洗净，沥干水分后制成匀浆；

(2)将所述匀浆与脱脂试剂按质量比为20:1进行搅拌混合，以对所述匀浆进行脱脂处理；

(3)调整脱脂后匀浆的pH值为9～11；

(4)将步骤(3)处理后的匀浆进行超声处理，离心后取上清液；

(5)调整所述上清液pH值为2.0～5.5，静置酸沉处理，离心后收集上沉淀固体；

(6)将步骤(5)所述沉淀固体进行真空冷冻干燥，得到红托竹荪蛋白质冻干粉；

(7)将步骤(5)所述沉淀固体与蒸馏水按料液比1g:50mL混合，经超声溶解后，再加入碱性蛋白酶，在温度为55℃水浴中加热3h进行酶解，加热完毕灭酶处理，最后进行浓缩处理，将浓缩液进行冻干得到红托竹荪菌托多肽；

(8)将步骤(5)所述沉淀固体与6mol/L HCl溶液按料液比为1g/mL的比例进行混合，在110℃水解22h，过滤后浓缩，冻干得到红托竹荪氨基酸冻干粉；

其中所述HCl溶液中含有0.1％(w/v)苯酚。

进一步地，步骤(2)中脱脂试剂为石油醚，搅拌混合时间为10-30h。

进一步地，步骤(3)是采用氢氧化钠溶液调整脱脂后匀浆的pH值。

进一步地，步骤(4)中超声功率为330～550W，超声温度为45℃，超声时间为10～30min。

进一步地，步骤(4)中离心转速为5000r/min，离心时间为20min。

进一步地，步骤(5)是利用盐酸调整上清液的pH值，所述盐酸的浓度为1mol/L。

进一步地，所述步骤(5)中的离心转速为5000r/min，离心时间为25min。

进一步地，步骤(7)所述灭酶温度为95℃，灭酶时间为10min。

进一步地，步骤(7)所述碱性蛋白酶以3000U的酶活进行添加。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明的红托竹荪蛋白质的提取方法快捷且操作简便，实验周期短，得到的红托竹荪蛋白质、多肽、氨基酸具有良好的生物活性与人体利用率。

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1为不同提取条件对红托竹荪蛋白质提取率的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明提供的技术方案进行进一步说明。

实施例1

以脱脂红托竹荪匀浆原料，对各项条件进行单因素对照实验。

所述脱脂红托竹荪匀浆的制备工艺为：将红托竹荪菌托鲜品洗净，沥干水分，置于破壁机中榨成匀浆；以石油醚为脱脂试剂，按料液比为1：20(g/mL)的比例进行24h脱脂处理，得到脱脂红托竹荪匀浆；

(1)对料液比进行优化：

向脱脂红托竹荪匀浆中加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，加入pH调节剂(1mol/L的HCl和/或1mol/L的NaOH)调整pH值为4，500W，45℃超声提取30min后5000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为2进行酸沉淀，酸沉后5000r/min离心25min，沉淀经真空冷冻干燥后得到红托竹荪菌托蛋白质。

由图1D可知，随料液比增大，溶剂不断增加，溶质得到充分分散，大大增加了红托竹荪菌托蛋白质与溶剂的接触面积，促进了蛋白质的溶出，至1:20时，蛋白质提取率达到最大值(2.86％)，继续增加溶剂用量，提取率趋于平缓。此外，考虑到溶剂用量过大，会增加后处理的经济成本，故料液比选择1:20(g/mL)较为适宜。

(2)对pH进行优化：

按照料液比为1:20的比例向脱脂红托竹荪匀浆中加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，加入pH调节剂调整pH值，500W，45℃超声提取30min后5000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为2进行酸沉淀，酸沉后5000r/min离心25min，沉淀经真空冷冻干燥后得到红托竹荪菌托蛋白质。

由图1A可知，随着溶液pH的不断升高，蛋白质得率也不断上升。而在pH值越靠近其等电点时，蛋白质溶解度最低最终导致蛋白质得率降低。在pH大于等单点时，产生较多的净负电荷。由于同性电荷相斥，蛋白质变的更加松散从而提高了蛋白质得率。

(3)对超声功率进行优化：

按照料液比为1:20的比例向脱脂红托竹荪匀浆中加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，加入pH调节剂调整pH值为4，在特定功率下，45℃超声提取30min后5000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为2进行酸沉淀，酸沉后5000r/min离心25min，沉淀经真空冷冻干燥后得到红托竹荪菌托蛋白质。

由图1C可知，随着超声波功率的增加蛋白得率呈现上升后降的趋势。超声波的空化效应和机械效应破坏蛋白质四级结构，使蛋白质小分子的亚基释放，一些极性氨基酸残基向蛋白质分子外部迁移，增强蛋白与水分子的相互作用，使溶解度增加。当超声波功率大于495W时反应体系中的蛋白质得率达到最大值为3.02％。

(4)对提取时间进行优化：

按照料液比为1:20的比例向脱脂红托竹荪匀浆中加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，加入pH调节剂调整pH值为4，500W，45℃超声提取特定时间后5000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L的HCl溶液调节pH值为2进行酸沉淀，酸沉后5000r/min离心25min，沉淀经真空冷冻干燥后得到红托竹荪菌托蛋白质。

由图1B可知，随着提取时间的增加蛋白质得率呈现先增后减的趋势。红托竹荪菌托蛋白提取率随浸提时间延长，不断上升。25min时，提取率达到最大值，为2.8%，继续延长提取时间，提取率开始下降。这可能是由于长时间浸提，析出蛋白相互作用形成絮凝沉淀所致。故提取时间选择25 min较为适宜。

结果表明：在提取PH＝11，超声功率为550W，料液比为1:20(g/mL)，提取时间为25min的条件下，能够获得较高的红托竹荪蛋白提取率，同时又不会消耗过多的时间，可降低材料成本。

实施例2

一种红托竹荪蛋白质的提取方法，步骤如下：

(1)将红托竹荪菌托鲜品洗净，沥干水分，置于破壁机中榨成匀浆；

(2)以石油醚为脱脂试剂添加比例为1：20(g/mL)，24h脱脂处理；

(3)按照1：5的料液比加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，以1mol/L的HCl和NaOH溶液调节pH＝11；

(4)在超声550W条件下45℃超声加热提取25min后，5000r/min离心20min，取上清液；

(5)用1mol/L的HCl溶液调pH＝2.5进行酸沉淀，5000r/min离心25min，取沉淀；

(6)真空冷冻干燥，得到红托竹荪菌托蛋白质冻干粉。

对实施例2制得的红托竹荪蛋白质的抗癌活性进行检测：

检测方法如下：选用A549，HELA，K562，MDA-231，PC3癌细胞作为红托竹荪蛋白质抗癌活性的筛选，设置红托竹荪蛋白质浓度分别为30μg/mL，60μg/mL，90μg/mL，120μg/mL，150μg/mL，检测结果如下：

经检测得出，本发明制备的红托竹荪蛋白质对A549，HELA，K562，MDA-231，PC3癌细胞均有显著的抑制活性。

实施例3

一种红托竹荪多肽的提取方法，步骤如下：

(1)将红托竹荪菌托鲜品洗净，沥干水分，置于破壁机中榨成匀浆；

(2)以石油醚为脱脂试剂添加比例为1:20(g/mL)，24h脱脂处理；

(3)按照1：5的料液比加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，以1mol/L的HCl和NaOH溶液调节pH＝11；

(4)在超声550W条件下45℃超声加热提取25min后，5000r/min离心20min，取上清液；

(5)用1mol/L的HCl溶液调pH＝2.5进行酸沉淀，5000r/min离心25min，取沉淀；

(6)取步骤(5)的沉淀物以1：50加入蒸馏水，转用550W超声10min使其溶解，以3000U的酶活加入碱性蛋白酶，在55℃中水浴加热3h，加热完毕后取出以95℃水浴灭酶10min。然后将溶液转移到茄型烧瓶中使用旋转蒸发仪使其浓缩，取浓缩样品真空冷冻干燥，得到红托竹荪菌托多肽。

对实施例2制得的红托竹荪多肽抗癌活性进行检测：

检测方法如下：选用A549，HELA，K562，MDA-231，PC3癌细胞作为红托竹荪蛋白质抗癌活性的筛选，设置浓度为30μg/mL，60μg/mL，90μg/mL，120μg/mL，150μg/mL，检测结果如下：

经检测得出，本发明制备的红托竹荪蛋白质对A549，HELA，K562，MDA-231，PC3癌细胞均有显著的抑制活性。

实施例3

一种红托竹荪氨基酸的提取方法，步骤如下：

(1)将红托竹荪菌托鲜品洗净，沥干水分，置于破壁机中榨成匀浆；

(2)以石油醚为脱脂试剂添加比例为1:20(g/mL)，24h脱脂处理；

(3)按照1：5的料液比加入浓度为30％的氢氧化钠溶液，以1mol/L的HCl和NaOH溶液调节pH＝11；

(4)在超声550W条件下45℃超声加热提取25min后，5000r/min离心20min，取上清液；

(5)用1mol/L的HCl溶液调pH＝2.5进行酸沉淀，5000r/min离心25min，取沉淀；

(6)将步骤(5)的沉淀物在6mol/l HCl(含0.1％(w/v)苯酚)中于110℃水解22h，水解产物用定性滤纸过滤，浓缩，冷冻干燥得到氨基酸。

精确取10mg所述氨基酸冻干粉末溶解在1mL蒸馏水中，0.45μm滤膜过滤样品溶液，用氨基酸分析仪(S-433D)，测定氨基酸组成，结果如下：

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。