一种复合生物酶制备白及多糖的方法

技术领域

本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种复合生物酶制备白及多糖的方法。

背景技术

白及为兰科植物白及(Bletilla striata(Thunb)Reichb.f.)的干燥块茎。其味苦、甘、涩，性平偏凉，归肺、胃、肝经。有清热利湿、收敛止血、消肿生肌之功效。研究表明白及块茎中含有大量天然水溶性多糖，即白及多糖，是白及的主要药效成分。白及多糖具有较高的黏度，是一种优良的天然增稠剂和乳化稳定剂，因其良好的生物相容性和可降解性，可用作各种形式的载药敷料、生物修复材料，医药原料、缓控释材料。在医药、化妆品及食品领域均有较广泛的应用，且具有无毒性、生物相容性等特征，使白及多糖备受关注，然而白及多糖的提取率不高，研究不够系统广泛，因此如何高效制备白及多糖是该领域急需解决的关键问题。

白及多糖的传统提取方法有水提和有机溶剂提取法等，但存在纯水高温操作会引起热敏性有效成分的分解，且提取物质有限，有机溶剂提取则提取物中的残余溶剂不易去除，成本较高等缺点。酶法提取则可以很好的解决这一问题，酶解条件温和，不破坏目标产物的化学结构，能有效的分解植物组织和细胞，提取效率高。本发明通过单因素及正交实验对各单酶添加量、复合酶配比确定、复合酶酶解时间、酶解温度、酶解pH值、复合酶添加量等因素考察，对白及多糖提取率的影响，优选出最佳复合生物酶法来提取白及多糖，获得切实可行的工艺参数，为白及资源的充分利用奠定基础。

发明内容

本发明目的旨在提供一种合理、稳定的复合生物酶制备白及多糖的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明所述的复合生物酶制备白及多糖的方法，包括如下步骤：

(1)称取适量白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)称取一定质量分数的复合酶，加入一定pH值磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

(3)按照质量体积料液比向白及粉末中加入酶解液，于恒温水浴中酶解；

(4)酶解结束后，热水中灭酶，趁热减压抽滤后干燥即得。

本发明步骤(1)中所述过筛的目数为：30目。

本发明步骤(2)中所述复合酶由相对底物质量分数的纤维素酶1-2％、果胶酶1.5-2.5％、酸性蛋白酶1-2％、木瓜蛋白酶0.5-1.5％组成；复合酶的添加量为：3-4％。

优选的，本发明步骤(2)中所述复合酶由相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％、木瓜蛋白酶0.5％组成；复合酶的添加量为：3％。

本发明步骤(2)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为3.5-4.5。

优选的，本发明步骤(2)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为4.0

本发明步骤(3)中所述质量体积料液比为1：30。

本发明步骤(3)中所述恒温水浴的温度为35-45℃；所述酶解时间为20-50min。

优选的，本发明步骤(3)中所述恒温水浴的温度为40℃；所述酶解时间为30min。

本发明步骤(4)中所述热水的温度为90℃；灭酶时间为10min。

有益效果：

1、白芨多糖提取率高。本发明采用复合酶配比通过单因素及正交试验考察，以白及多糖提取率为指标，结果：木瓜蛋白酶的影响不显著，纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶添加量对白及多糖的提取率影响最为显著；提取白及多糖的最佳复合酶比例为纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％、木瓜蛋白酶0.5％；测得白及多糖提取率为56.89％。

2、本发明通过正交试验法优化复合酶提取总多糖，将单因素考察得到的结果进行四因素三水平正交水平试验，结果：(1)酶解pH值>复合酶添加量>酶解温度>酶解时间，最优工艺组合为：酶解时间为30min，酶解温度40℃，酶解pH＝4.0，复合酶添加量为3％。各因素对白及多糖得率有极显著影响(p<0.01)；(2)按最优工艺条件分别进行3次提取实验，得到白及多糖的平均得率为51.97％±1.52％，高于正交实验表中的9个实验组合，表明本发明方法稳定、可行。

3、本发明制备白及多糖采用的复合酶成本低，提取白及多糖的酶解温度为40℃，酶解条件温和，不破坏白及多糖的化学结构，能有效的分解植物组织和细胞，酶解时间为30min，提取效率高，解决了传统方法高温操作会引起热敏性有效成分的分解、提取率低、有机溶剂提取残余溶剂不易去除以及成本较高等问题。

4、本发明提供的制备工艺简单，快速，稳定，可行。为白及资源的充分利用奠定基础。

附图说明

图1：纤维素酶添加量对总多糖提取率影响

图2：果胶酶添加量对总多糖提取率影响

图3：酸性蛋白酶添加量对总多糖提取率影响

图4：木瓜蛋白酶添加量对总多糖提取率影响

图5：酶解PH值对总多糖提取率影响

图6：酶解时间对总多糖提取率影响

图7：酶解温度对总多糖提取率影响

图8：复合酶添加量对总多糖提取率影响

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1复合生物酶法制备白及多糖的工艺

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数3％的复合酶，加入pH值＝4的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解30min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例2复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数3.5％的复合酶，加入pH值＝3.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于35℃恒温水浴中酶解50min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例3复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数4％的复合酶，加入pH值＝4.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于45℃恒温水浴中酶解20min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例4复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数3％的复合酶，加入pH值＝4的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于45℃恒温水浴中酶解50min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例5复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数4％的复合酶，加入pH值＝3.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解50min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例6复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数3％的复合酶，加入pH值＝4.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶0.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解30min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例7复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数4％的复合酶，加入pH值＝4.0的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶2％、果胶酶2.5％、酸性蛋白酶1.5％和木瓜蛋白酶1.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于35℃恒温水浴中酶解30min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例8复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数3.5％的复合酶，加入pH值＝3.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶1.5％、果胶酶2.5％、酸性蛋白酶2％和木瓜蛋白酶1.5％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于35℃恒温水浴中酶解50min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例9复合生物酶法制备白及多糖的方法

(1)称取1g白及，干燥，粉碎过筛，得白及粉末；

(2)按相对底物浓度称取质量分数4％的复合酶，加入pH值＝4.5的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液；

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶1％、果胶酶1.5％、酸性蛋白酶1％和木瓜蛋白酶1％，混合均匀即得；

(3)按照1：30(g/mL)的料液比向白及粉末中加入酶解液，于45℃恒温水浴中酶解20min；

(4)酶解结束后，于90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤，干燥即得。

实施例10复合生物酶法制备白及多糖的方法

上述所述的复合酶的制备为：分别取相对底物质量分数的纤维素酶1.5％、果胶酶1.5％、酸性蛋白酶1.5％和木瓜蛋白酶1％，混合均匀即得；

其余步骤同实施例1。

为了进一步验证本发明的可行性及有效性，筛选出最佳方案，发明人进行了一系列的试验，具体如下：

一、实验方法

1、白及多糖含量测定

1.1最大吸收波长确定

取样品溶液于具塞试管中，精密加入5％苯酚溶液1.0mL，浓硫酸溶液5mL，混匀，静置10min，反应液充分混合后，将试管放置于30℃水浴中反应20min，取出后静置10min。用紫外分光光度计在800～200nm处扫描。同法对对照品和空白对照(以蒸馏水)进行扫描。扫描结果表明在488nm处样品和对照品均有最大吸收峰出现，空白样品在600nm～400nm处无吸收波段。故以488nm为最佳测定波长。

1.2总多糖葡萄糖标准曲线的制作

配制浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取0mL、0.1mL、、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖标准溶液至10mL的具塞玻璃比色管中，用蒸馏水将总体积补足1mL。加1.0mL浓度为5％苯酚溶液和5.0mL浓硫酸，相互作用后的液体静置10min。反应液充分混合后，将试管放置于30℃水浴反应20min，取出静置10min。于488nm波长处测定吸光值。回归方程为：A＝10.663X+0.0032，R

1.3供试品的制备

称取白及样品1.0g置于100mL烧杯中，复合酶的添加量(相对底物浓度)为3％。加入pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液，按照1：30(g/mL)的料液比加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解30min。酶解结束后90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将所得滤液取1mL，用蒸馏水溶解，定容至100mL容量瓶，照“1.2.2”项下步骤显色，测定糖含量，计算多糖提取率。

2、工艺研究

2.1单因素试验

2.1.1各单酶的最佳添加量考察

称取白及样品1.00g置于100mL烧杯中，分别以纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加量(相对底物浓度)为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％。配制0.2mol/L柠檬酸-0.1mol/L磷酸氢二钠溶液，将两者混合配制一定pH值的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液，按照1：30(g/mL)的料液比加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解90min。酶解结束后90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将所得滤液取1mL，用蒸馏水溶解，定容至100m容量瓶，测定糖含量，计算多糖提取率。进而分析各单酶添加量对其影响，得各最佳添加量。

2.1.2复合酶配比确定

根据上述“2.1.1”试验结果，按照表1进行三因素三水平正交试验，以复合酶配比为自变量，保持酶解条件不变，按照“2.1.1”的试验步骤进行试验，以白及多糖提取率为指标，分析确定最佳复合酶配比。

表1复合酶配比正交试验设计因素与水平

2.1.3复合酶法提取白及总多糖单因素考察

精密称取白及样品1.00g置于100mL锥形瓶中，各分别称取一定质量分数的纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶(相对底物浓度)加入一定pH值磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液，按照1：30(g/mL)的料液比加入酶解液，考察酶解PH(3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5)、酶解时间(10、20、30、50、70、90、110min)、酶解温度(30、35、40、45、50、55、60℃)及复合酶添加量(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4％)。

2.1.4复合酶法正交设计

通过提取条件的单因素试验结果，分别得最佳水平；在此基础之上，以酶解时间(A)、酶解温度(B)、酶解pH值(C)、复合酶添加量(D)为自变量，按照表2的四因素三水平的试验设计试验方法进行对提取白及多糖条件的优化。

表2复合酶法提取白及总多糖条件的正交试验设计因素与水平

2.1.5数据统计分析

数据结果采用EXCEL、SPSS26.0处理，作图均用GraphPad prism8.0.1绘制。

3、结果与分析

3.1各单酶添加量单因素结果

3.1.1纤维素酶添加量对总多糖提取率影响

由图1可知，当纤维素酶添加量为1.5％时，白及总多糖的提取率最高，之后随着添加量的增大，于2.5％时也出现高点，但是不及添加量为1.5％时的提取效率。考虑到效益最大化，以最少的酶添加量得到最佳提取率。最终选择1.5％作为纤维素酶的最佳添加量。

3.1.2果胶酶添加量对总多糖提取率影响

由图2结果显示，果胶酶加酶量在1.0％以后出现起伏，当加酶量为2％是白及总多糖提取率达到最大提取，随后加酶量的继续增加，提取率的增加幅度逐渐不明显，选择2％为最佳加酶量。

3.1.3酸性蛋白酶添加量对总多糖提取率影响

由图3可知，酸性蛋白酶添加量1.5％时多糖提取率最高，虽然继续增加加酶量至2.5％时发现提取率又出现新的高值，但远不及1.5％的提取效果佳。选择1.5％为酸性蛋白酶的最佳添加量。

3.1.4木瓜蛋白酶添加量对总多糖提取率影响

由图4可知，木瓜蛋白酶的最佳添加量选择1.0％。在1.0％添加量下，白及多糖提取率达到最高22.89％，添加量为2.5％提取率是20.81％，从工业生产方面考量，仅可能以最低投入得到最大产率。综合来看，此时选择1.0％为木瓜蛋白酶的最佳添加量。

3.2复合酶配比的正交试验结果

复合酶的正交试验结果如表3所示，将单因素考察得到的结果进行四因素三水平正交水平试验，得到如下结果。

表3复合酶配比L

表4方差分析

注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。

由表3极差分析结果可知，极差RA(8.62)＞RB(5.64)＞RC(4.25)＞RD(1.89)，纤维素酶添加量的改变对白及多糖提取率影响最大。通过K值来看。最优方案为A

3.3复合酶法提取条件单因素考察结果

3.3.1酶解PH值对总多糖提取率的影响

从图5可知，随着酶解PH值的增加，多糖提取率显著升高，在酶解PH为4.0时提取率达到最高，之后随着PH增大提取率逐渐减小。PH在5.5以后提取率开始缓慢上升，但提取效果远不及PH＝4.0时的，所以选择4.0作为最佳酶解PH值。

3.3.2酶解时间对总多糖提取率的影响

从图6可知，随着酶时间的增大，多糖提取率增长，到30min时显著增长，随后开始下降。当时间至90min时，再次出现提取率上升趋势，且趋势变化缓慢，不及30min时明显。从效率方面考虑，酶解时间选择30min提取效果最佳。

3.3.3酶解温度对总多糖提取率的影响

从图7可知，不同的酶有着最适温度，本次考察的四种酶均有不同的最适温度，配比之后对其酶解温度进行考察，曲线成波状起伏，推测可能与四种酶各自的最适温度有关，当达到各自酶的最适温度时，此段温度的提取率出现高点。但综合来看提取率在40℃时提取率达到最大值，故选择40℃为最佳酶解时间。

3.3.4复合酶添加量对总多糖提取率的影响

从图8可知，添加量在1.5％时出现提取高峰，随着添加量的增加，在3.5％达到另一个最高值，且提取率显著高于1.5％，从工艺生产上考虑，要求总多糖提取最大化，将添加量3.5％作为最佳添加量。

3.4正交实验法优化复合酶法提取总多糖结果

正交试验法优化复合酶提取总多糖，将单因素考察得到的结果进行四因素三水平正交水平试验，得到以下结果。见表5-表6。

表5复合酶法提取L

表6方差分析

注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。

根据表2的因素和水平进行正交实验设计。由表5直观分析可以看出：极差RC(17.12)＞RD(15.09)＞RA(2.83)＞RB(1.20)；即影响复合酶法提取工艺的顺序大小为：酶解PH值(C)>复合酶添加-量(D)>酶解时间(A)>酶解温度(B)，最优工艺组合为：A

按最优工艺条件分别进行3次提取实验，白及多糖的平均得率为51.97％±1.52％，高于正交实验表中的9个实验组合，表明实验方案设计稳定、可行。见表7。

表7复合酶法提取白及多糖正交试验验证

3.5正交实验法优化复合酶法提取总多糖最佳工艺

称取白及样品1.0g置于100mL烧杯中，复合酶的添加量(相对底物浓度)为3％。加入pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液，按照1：30(g/mL)的料液比加入酶解液，于40℃恒温水浴中酶解30min。酶解结束后90℃热水中灭酶10min，趁热减压抽滤后，将所得滤液取1mL，用蒸馏水溶解，定容至100mL容量瓶，照“2.1.1”项下步骤显色，测定糖含量，计算多糖提取率为56.89％。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。