大豆GmTFL1b基因及其在调控种子大小中的应用

技术领域：

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及大豆GmTFL1b基因在调控种子大小中的应用。

背景技术：

大豆(Glycine max)是世界上重要的粮油兼用作物，它不仅是人类与畜牧业等所需油类营养物质和食用植物蛋白的重要来源，还具有很好的保健作用。这使得大豆在农业及食品加工、制药等工业中都有很重要的经济价值。在农业生产上，大豆种子的大小和重量是构成大豆产量的重要因素，是育种的重要目标。随着经济的发展和生活水平的提高，我国大豆需求量近年急剧增加，现已经成为全球最大的大豆进口国，这对培育高产高质的大豆品种提出迫切的需求。因此，通过精准遗传改良大豆品种对提高大豆产量、加快大豆优良品种选育、促进大豆品质等方面具有重要意义。

近年来，利用遗传学及分子生物学的方法，科研人员已经克隆并鉴定出了一些控制大豆种子大小的基因并初步进行了初步验证和调控机制解析。例如，GmST05的自然变异影响了大豆的种子大小和质量，使其成为大豆分子育种的重要基因资源。还有GmSWEET10a、GmSWEET10b等糖转运相关基因，GmCYP78A72和GmCYP78A5等细胞色素相关基因，以及GmKIX8-1、PP2C-1、GmWRKY15a和GmFAD3等对大豆种子大小的调控都在大豆中得到了验证。但目前为止，调控大豆种子大小的主效位点基因仍需进一步地挖掘和分析，这对于促进人们对大豆种子发育机理的理论认知和提高大豆高产优质分子育种效率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从大豆中分离的调控种子大小的基因GmTFL1b基因和利用其编码的蛋白在提高大豆种子大小中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该基因是大豆种子大小的关键调控基因，其编码的蛋白可以用于大豆不同种子大小品种的培育。

本发明的第一个目的是提供大豆种子大小调控GmTFL1b蛋白，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述大豆种子大小调控GmTFL1b蛋白的编码基因-大豆种子大小调控基因GmTFL1b。

优选，所述的大豆种子大小调控基因GmTFL1b的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第三个目的是提供大豆种子大小调控GmTFL1b蛋白、大豆种子大小调控基因GmTFL1b或其相关生物材料在大豆育种中的应用。

所述的大豆育种是调控大豆种子大小的应用。所述的调控大豆种子大小可以应用于培育新品种大豆或者鉴定与筛选大豆品种。

进一步地，所述的调控大豆种子大小，是通过提高所述GmTFL1b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性，使大豆的种子变小；或通过降低所述GmTFL1b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性，使大豆的种子变大。

本发明的第四个目的是提供一种改变大豆种子大小的方法，包括以下步骤：

将GmTFL1b基因转入大豆细胞中，大豆细胞再生成植株，筛选获得转基因纯合植株，从而得到种子更小的转基因大豆。

优选，具体步骤为：

a.将GmTFL1b基因转入大豆细胞中；

b.将步骤a中的大豆细胞再生成植株；

c.从T0代开始筛选抗除草剂且转基因纯合植株，从而得到种子更小的转基因大豆。

本发明公开了以下技术效果：

本发明将GmTFL1b基因转入栽培型大豆Kariyutaka中，转入该基因的大豆种子明显比对照Kariyutaka更小、百粒重显著降低。表明GmTFL1b基因可以抑制种子大小。本发明首次揭示了大豆GmTFL1b基因控制大豆种子大小的生物学功能。

本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源，可将大豆GmTFL1b基因广泛应用于大豆育种中。

附图说明

图1为本发明大豆GmTFL1b基因的表达载体。

图2为对照植株Kariyutaka和转入GmTFL1b基因后的T2代植株(GmTFL1b#1、GmTFL1b#2)叶片中GmTFL1b基因的表达情况。

图3为对照植株Kariyutaka和转入GmTFL1b基因后的T2代种子(GmTFL1b#1、GmTFL1b#2)大小表型图，比例尺为5毫米。

图4为对照植株Kariyutaka和转入GmTFL1b基因后的T2代种子(GmTFL1b#1、GmTFL1b#2)百粒重柱形图，误差性代表标准误差(n＝10)。单尾T检验用于显著性差异分析。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。

下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序可自主完成或委托第三方基因公司完成。

本实施方式大豆种子大小调控基因GmTFL1b的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本实施方式大豆种子大小调控基因GmTFL1b编码蛋白的核氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本实施方式大豆种子大小调控基因GmTFL1b在提高或降低百粒重方面的用途。

植物材料：供试是大豆品种为Kariyutaka。

实施例1、GmTFL1b基因的分离和结构分析

1、基因的分离

从大豆品种Williams82的种子中提取mRNA，以其为模板，以Oligo(T)17为引物合成cDNA第一条链，并以此链为模板，利用引物TFL1b-F：TAGCTAAATCTAAATTATGTATTGC和TFL1b-R：GCCTACCAAACCTCTTATTTCT进行PCR扩增，反应体系为40μl，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，进行40个循环，72℃延伸反应5min。

电泳切胶回收目的条带后于pMD18-T载体(TaKaRa公司)相连。转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂板后挑单克隆摇菌并提质粒，酶切验证后测序。测序结果表明GmTFL1b基因的cDNA片段长为1026bp，其中CDS编码区大小为522bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码具有172个氨基酸的序列，如SEQ ID No.2所示。

2、基因的结构分析

以大豆品种Williams82的幼嫩叶片为材料，提取基因组DNA，以其为模板，利用以上TFL1b-F和TFL1b-R引物进行PCR扩增，获得GmTFL1b基因组的片段，克隆到pMD18-T载体中。GmTFL1b基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，共1633bp，它含有3个内含子和4个外显子。

实施例2、GmTFL1b正义表达载体的构建

以大豆品种Williams82的幼嫩叶片基因组DNA为模板，用启动子的重组引物pro-F：

PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，进行40个循环，72℃延伸反应5min。

将GmTFL1b的基因组片段(3kb启动子、外显子、内含子和UTR区)一起构建到载体pTF101.1(BioVector，0134768)上，载体图谱如图1所示。首先，用Hind III和Xbal I双酶切载体后，将该基因的启动子片段用前面的pro-F和pro-R引物扩增后，利用ClonExpressUltra One Step Cloning Kit(Vazyme，C115-01)通过重组的方法插入到载体上。其中，酶切反应体系如下：

随后再用Mlu I(Thermo Fisher，FD0685)和Smal I(Thermo Fisher，FD0663)用同样的反应体系对上一步构建完的载体进行双酶切反应，并利用同样的同源重组方法，用引物1b-F：

实施例3、农杆菌介导法转化大豆

1、获得大豆外植体

选取表面光滑、无裂纹、无病斑、无霉菌的Kariyutaka成熟大豆种子，以氯气灭菌10-14h。将灭菌后的种子浸泡在无菌水中，黑暗处理16h。待其萌发后，在超净工作台上将两片子叶沿中线轴切开，去除两片原始叶芽，并在子叶与下胚轴结合处形成长约3mm的伤口。

2、大豆子叶结遗传转化

利用农杆菌EHA101菌株介导的遗传转化将上述含有GmTFL1b的载体导入大豆愈伤组织中，获得从愈伤组织转化而来的植株。

3、可遗传的转基因植株筛选

用草铵膦(160mg/L)筛选T0代转基因阳性植株，对其基因组的PCR鉴定后，繁殖T1代纯和转基因植株。提取T2代纯和转基因植株叶片的mRNA，反转录为cDNA后，对其进行荧光定量PCR，使用的引物为QF：ATATGAGGTCCTTCTTTACACTGATC和QR：TTCCAATATTAGGCTTTGGGACCT，GmTFL1b基因的表达明显高于对照植株Kariyutaka，结果如图2所示。对获得的纯合植株的种子进行观察，对种子籽粒大小表型拍照，拍照结果如图3所示，用分析天平称量百粒重，结果如图4所示。

综上所述，大豆GmTFL1b基因可以参与调控大豆的种子大小和百粒重，通过转基因的手段可以改变大豆种子的大小百粒重，从而达到改变大豆种子百粒重和产量的目的。

大豆种子大小调控基因GmTFL1b的CDS序列(SEQ ID NO.1)

ATGGCAAAAA TGCCTTTAGA GCCTCTAATA GTGGGGAGAG TCATAGGAGA 50

AGTTCTTGAT TCTTTCACCA CAAGCACAAA AATGACTGTG AGTTACAACA 100

AGAAGCAAGT TTACAATGGC CATGAGCTCT TCCCTTCCAC TGTCAACACC 150

AAGCCCAAGG TTGAGATTGA GGGTGGTGAT ATGAGGTCCT TCTTTACACT 200

GATCATGACT GACCCTGATG TTCCTGGCCC TAGTGACCCT TATCTGAGAG 250

AGCACTTGCA CTGGATAGTG ACAGATATTC CAGGCACAAC AGATGCCACA 300

TTTGGGAAAG AGTTGGTGAG CTATGAGGTC CCAAAGCCTA ATATTGGAAT 350

CCATAGGTTT GTGTTTGTCC TGTTCAAGCA AAAGCGTAGA CAGTGTGTTA 400

CTCCACCCAC TTCAAGGGAC CACTTCAACA CACGCAAATT CGCAGCAGAG 450

AACGACCTTG GCCTCCCTGT GGCTGCTGTC TACTTCAATG CACAGAGGGA 500

AACGGCTGCA AGAAGACGCTAG 522

大豆种子大小调控基因GmTFL1b编码蛋白(SEQ ID NO.2)

MAKMP LEPLI VGRVI GEVLD SFTTS TKMTV SYNKK QVYNG HELFP STVNT 50

KPKVE IEGGD MRSFF TLIMT DPDVP GPSDP YLREH LHWIV TDIPG TTDAT 100

FGKEL VSYEV PKPNI GIHRF VFVLF KQKRR QCVTP PTSRD HFNTR KFAAE 150NDLGLPVAAV YFNAQ RETAA RR 172

大豆种子大小调控基因GmTFL1b的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO.3)

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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明群里要求书确定的保护范围。