HIV-1Tat蛋白抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种HIV-1Tat蛋白抑制剂及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。根据联合国艾滋病规划署最近公布的信息，截至2020年底，全球约有3770万艾滋病病毒感染者，新增感染人数150万，有68万人死于艾滋病相关疾病，有2750万人正在接受抗病毒治疗(Antiretroviraltherapy，ART，俗称“鸡尾酒疗法”)。艾滋病流行以性传播、血液/体液传播和母婴传播为主，影响因素广泛复杂。

抗逆转录病毒治疗HIV-1感染和艾滋病的进展非常迅速。第一种艾滋病治疗药物，齐多夫定(Zidovudine，AZT)在发现病毒后的10年内被开发和使用。包括AZT在内的第一代抗HIV-1药物几乎都是HIV-1逆转录酶抑制剂。20世纪90年代中期，HIV-1蛋白酶抑制剂的开发和抗逆转录病毒疗法(ART)的引入使艾滋病的治疗发生了革命性的变化。截止2020年7月2日，美国FDA共批准了9类39种抗HIV药物，包括13种核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、6种非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、11种蛋白酶抑制剂(PIs)、4种整合酶抑制剂(INSTIs)、1种进入抑制剂、1种融合抑制剂、1种药代动力学增强剂、1种融合附着抑制剂和1种辅助受体拮抗剂附着后抑制剂，以及7种不同类型药物的合剂。将作用于不同靶点的抗HIV药物联合应用，可以将病毒复制抑制到现有方法检测不到的水平，在一定程度上重建免疫功能，改善临床症状，病人可以长期健康生存。然而，现有抗逆转录病毒药物的广泛使用也给艾滋病的治疗带来了一些障碍，例如，耐药毒株的出现和传播。目前抗病毒药物的作用靶点有逆转录酶、蛋白酶、整合酶等，但几乎所有的靶点都出现过耐药相关报道。在接受过抗逆转录病毒治疗的患者和没有接受治疗的HIV-1患者中，核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点主要以M184V/I为主，非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点主要以K103N/S，Y181C/I和G190A/S为主。这些耐药位点会引起患者对拉米夫定、依非韦伦或奈韦拉平药物产生高度耐药。因此，仍需寻找新的药物靶点，并针对其设计或筛选新的抗病毒药物。

Tat蛋白是HIV-1复制和基因表达所必须的反式激活蛋白，含有86-102个氨基酸，分子量约为14-16kDa。Tat蛋白可与HIV-1RNA 5'端LTR上的反式激活反应区(TransActivation Responsive region，TAR)结合，增强病毒复制起始，提高HIV-1基因转录水平。近年来的研究已经证实Tat不仅在HIV-1启动子反式激活中具有重要作用，还参与调节HIV-1致病相关的多种细胞和分子通路。例如，Tat蛋白可通过调节多种细胞通路以帮助HIV-1复制，如蛋白酶体机制和炎症相关途径。此外，Tat还被发现可与其他HIV-1蛋白相互作用，包括Vpr、Nef、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NC)和Rev。其中，Tat与Vpr和Nef的相互作用增加了其反式激活功能，而Tat与NC或Rev的相互作用导致Tat蛋白降解，从而抑制相关功能。还有研究结果表明，Tat与外泌体有关。基于Tat蛋白在HIV-1复制中的重要调控作用，我们将其作为筛选新型抗HIV-1药物的靶标。HIV-1Tat抑制剂的筛选将为发现并设计以Tat蛋白为靶标的新型抗HIV-1药物奠定基础，避免已存在的耐药毒株对于抗HIV-1药物治疗效果的影响；同时，筛选出的HIV-1Tat抑制剂还可用于Tat相关的逆转录病毒致病机制研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种HIV-1Tat蛋白抑制剂及其应用

本发明提供一种HIV-1Tat蛋白抑制剂，所述HIV-1Tat蛋白抑制剂的活性成分包括化合物WAY-297131，所述化合物WAY-297131的分子式为C

本发明提供一种治疗和/或治疗HIV-1病毒引起的疾病的药物,所述药物的活性成分包括化合物WAY-297131，所述化合物WAY-297131的分子式为C

本发明要求保护化合物WAY-297131在制备HIV-1Tat蛋白抑制剂中的应用，所述化合物WAY-297131的分子式为C

本发明还要求保护所述的化合物WAY-297131在制备预防HIV-1病毒引起的疾病的药物中的应用。

本发明还要求保护所述的化合物WAY-297131在制备治疗HIV-1病毒引起的疾病的药物中的应用。

本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包上述的化合物WAY-297131或上述的药物或上述的抑制剂。

所述试剂盒可以为用于预防或治疗HIV-1病毒引起的疾病的试剂盒。

所述试剂盒也可以为评价化合物WAY-297131对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的试剂盒，所述试剂盒包含化合物297131、HIV-1病毒和宿主细胞；

进一步，所述HIV-1病毒为NL4-3或GX002；

进一步，所述宿主细胞为MT-2细胞。

本发明提供一种评价化合物WAY-297131对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法，包括如下步骤：

(1)测定化合物WAY-297131对宿主细胞的半数中毒浓度，记作TC

(2)测定化合物WAY-297131在宿主细胞/HIV-1病毒系统的抗病毒活性，得到化合物对HIV-1病毒的半数抑制浓度，记作IC

(3)将步骤(1)得到的TC

进一步，所述宿主细胞/HIV-1病毒系统中所述HIV-1病毒可以在所述宿主细胞中进行复制。

进一步，所述HIV-1病毒为NL4-3或GX002；

进一步，所述宿主细胞为MT-2细胞。

所述步骤(2)中的IC

所述步骤(1)所采用的试剂盒的商品名称为CellTiter-Glo

所述步骤(2)所采用的试剂盒的商品名称为Bright-Glo

所述试剂盒为评价化合物297131对HIV-1Tat蛋白的抑制和/或激活作用的试剂盒，该试剂盒包括化合物297131和TZM-BL、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat和TZM-BL-pcDNA3.1细胞株。

本发明通风一种评价化合物WAY-297131对HIV-1Tat蛋白的激活或抑制效果的方法，包括如下步骤：

(1)测定化合物WAY-297131对宿主细胞的细胞毒性，得到最大无毒浓度；

(2)测定当浓度低于最大无毒浓度时，化合物对稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株的激活或抑制效果。

所述步骤(1)的测定方法为ATP活性检测法；

所述步骤(2)中的激活或抑制效果是通过荧光检测法得到。

上述方法中，步骤(1)所述宿主细胞为TZM-BL细胞。

上述方法中，步骤(2)所述稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株为TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002Tat和TZM-BL-pcDNA3.1细胞。其中，TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat为稳定转染有HIV-1的B亚型毒株NL4-3的Tat蛋白表达载体的TZM-BL细胞株，TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat为稳定转染有HIV-1的CRF01_AE重组型毒株GX002的Tat蛋白表达载体的TZM-BL细胞株,TZM-BL-pcDNA3.1为稳定转染有pcDNA3.1(+)空载体的TZM-BL细胞株，作为HIV-1Tat蛋白表达细胞株的阴性对照，以排除pcDNA3.1(+)空载体对化合物效果评价的影响。

上述任一所述的方法中，所述步骤(1)的测定方法为ATP活性检测法；

所述步骤(2)中的激活或抑制效果是通过荧光检测法得到。

所述步骤(1)所采用的试剂盒的商品名称为CellTiter-Glo

所述步骤(2)所采用的试剂盒的商品名称为Bright-Glo

本发明提供的HIV-1Tat蛋白抑制剂对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值和意义。本发明提供的HIV-1Tat蛋白抑制剂可以应用于阻断HIV转录过程，降低病毒的复制能力，还可涉及含有这两种化合物的药物组合物，进而达到抑制艾滋病的效果。

附图说明

图1为多样性化合物母核库中化合物对TZM-BL-pcDNA3.1-GX002Tat细胞作用效果初筛火山图。

图2为多样性化合物母核库中化合物对TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3Tat细胞作用效果初筛火山图。

图3为多样性化合物母核库中化合物对TZM-BL-pcDNA3.1细胞作用效果初筛火山图。

图4化合物WAY-297131对MT-2细胞的半数毒性浓度曲线。

图5为化合物WAY-297131对HIV-1CRF01_AE重组型毒株GX002的抗病毒效果。

图6为化合物WAY-297131对HIV-1B亚型毒株NL4-3的抗病毒效果。

图7为化合物WAY-297131的结构式。

图8为化合物WAY-297131对B亚型Tat蛋白(左)和CRF01_AE亚型Tat蛋白(右)的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

多样性化合物母核库购自Selleck公司。

化合物WAY-297131，为多样性化合物母核库(Selleck，目录号L3600)中编号为WAY-297131的化合物，分子式为C

TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1细胞在文献“[1]裴志超.人内源性逆转录病毒K族(HERV-K)在我国HIV感染者中的分布、表达及激活因素研究[D].安徽医科大学,2019.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。

MT-2细胞(人T淋巴细胞白血病细胞)在文献“Sonza S,Kiernan RE,Maerz AL,Deacon NJ,McPhee DA,Crowe SM.Accumulation of unintegrated circular viral DNAin monocytes and growth-arrested T cells following infection with HIV-1.JLeukoc Biol.1994Sep；56(3):289-93.doi:10.1002/jlb.56.3.289.PMID:8083601.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。

TZM-BL细胞在文献“Finnegan CM,Rawat SS,Puri A,Wang JM,Ruscetti FW,Blumenthal R.Ceramide,a target for antiretroviral therapy.Proc Natl Acad SciU S A.2004Oct 26；101(43):15452-7.doi:10.1073/pnas.0402874101.Epub2004Oct15.PMID:15489273；PMCID:PMC524434.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。

pNL4.3质粒在文献“Wang C,Mitsuya Y,Gharizadeh B,Ronaghi M,ShaferRW.Characterization of mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing:application to HIV-1drug resistance.Genome Res.2007；17(8):1195-201.；HoffmannC,Minkah N,Leipzig J,Wang G,Arens MQ,Tebas P,Bushman FD.NA bar coding andpyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations.Nucleic AcidsRes.2007；35(13):e91.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。pNL4.3质粒含有HIV-1B亚型野生株的全基因组序列，转染细胞并表达可以得到HIV-1B亚型毒株NL4-3。

NL4-3病毒由pNL4.3质粒转染293T细胞表达获得。该病毒的制备过程如下：用DMEM培养基(含100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)重悬293T细胞，得到4×10

HIV-1B亚型参考毒株ⅢB_LAI病毒在文献“Montagnier Luc,Krust Bernard,Chamaret Solange,Clavel Francois,Chermann Jean Claude,Barre SinoussiFrancoise,Alizon Marc,Sonigo Pierre,Stewart Cole,Danos Olivier,Wain HobsonSimon:Envelope antigens of lymphadenopathy associated virus and theirapplications.Pasteur Institut,Centre Nat Rech Scient November 20,1986:EPO201540-A1.”中公开过，公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。

HIV-1CRF01-AE亚型参考毒株GX002病毒在文献“[1]贾涤静.我国深圳地区HIV分子流行病学调查及优势毒株感染性克隆的制备[D].安徽医科大学,2017.”中公开过，公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获得。

Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

培养MT-2细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10％的胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基。

培养TZM-BL细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10％的胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMED培养基。

培养TZM-BL-NL4-3-Tat细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10％的胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，200μg/ml的G418的DMEM培养基。

培养TZM-BL-GX002-Tat细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10％的胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，200μg/ml的G418的DMEM培养基。

培养TZM-BL-pcDNA3.1细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10％的胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，200μg/ml的G418的DMEM培养基。

逆转录酶抑制剂依非韦伦(Efavirenz，EFV)购自SIGMA公司。

CellTiter-Glo

Bright-Glo

实施例1、筛选对B亚型和CRF01_AE重组型的Tat蛋白有抑制作用的化合物

一、ATP法测定化合物对TZM-BL细胞的细胞毒性。

(一)吸取1μl待测化合物(10mM)加入99μl的PBS中，混匀，将待测化合物进行稀释至100μM。将TZM-BL细胞接种于96孔板，每孔90μl，细胞浓度为1.1×10

(二)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每种化合物2个复孔，作为实验组；以不加化合物组作为对照组。于37℃，5％CO

(三)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlCellTiter-Glo

实验结果表明化合物WAY-297131对TZM-BL细胞无细胞毒性。

二、Tat蛋白表达检测

(一)吸取1μl待测化合物(10mM)加入99μl的PBS中，混匀，将待测化合物进行稀释至100μM。将TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat、TZMB-BL-pcDNA3.1细胞分别接种于96孔板，每孔90μl，细胞浓度为1.1×10

(二)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每种化合物2个复孔，作为实验组；以不加化合物组作为对照组。于37℃，5％CO

(三)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlBrightTiter-Glo

筛选的结果如图1-3所示，结合图1-3中的结果，发现化合物WAY-297131对TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat细胞均有抑制作用，对TZM-BL-pcDNA3.1细胞无抑制作用。

多样性化合物母核库中，化合物WAY-297131的分子式为C

三、确定化合物WAY-297131对Tat蛋白的有效浓度范围

(一)吸取2μl WAY-297131(10mM)加入98μl的PBS中，混匀，将待测化合物进行稀释至200μM，再将化合物进行三倍比稀释，共稀释9个梯度(对应的WAY-297131浓度分别为200μM、66.7μM、22.2μM、7.4μM、2.5μM、0.8μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM)，得到稀释好的化合物。将TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat、TZMB-BL-pcDNA3.1细胞分别接种于96孔板，每孔90μl，细胞浓度为1.1×10

(二)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每种浓度的化合物2个复孔，作为实验组；以不加化合物组作为对照组。于37℃，5％CO

(三)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlCellTiter-Glo

结果表明，化合物WAY-297131对Tat蛋白的有效浓度范围在0-20μM。

四、确定化合物WAY-297131对Tat蛋白的抑制作用

(一)吸取2μl待WAY-297131(10mM)加入98μl的PBS中，混匀，将待测化合物进行稀释至200μM，再将化合物进行三倍比稀释，共稀释9个梯度，得到稀释好的化合物(对应的WAY-2971315浓度分别为200μM、66.7μM、22.2μM、7.4μM、2.5μM、0.8μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM)。将TZM-BL-pcDNA3.1-NL4-3-Tat、TZM-BL-pcDNA3.1-GX002-Tat细胞分别接种于96孔板，每孔90μl，细胞浓度为1.1×10

(二)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每种浓度的化合物2个复孔，作为实验组；以不加化合物组作为对照组。于37℃，5％CO

(三)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlBrightTiter-Glo

结果表明如图8所示，化合物WAY-297131对两种亚型的Tat蛋白的抑制作用具有剂量依赖性。

实施例2、应用毒株评价化合物对HIV-1的作用效果

一、ATP法测定化合物对MT-2细胞的半数中毒浓度(TC

(一)吸取10μl化合物WAY-297131(10mM)加入90μl的PBS中，混匀，将待测化合物进行稀释至1mM，再将化合物进行三倍比稀释，共稀释9个梯度。将MT-2细胞接种于96孔板，每孔90μl，细胞浓度为2.2×10

(二)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每种化合物2个复孔，作为实验组；以不加化合物组作为对照组。于37℃，5％CO

(三)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlBrightTiter-Glo

结果如图4所示，图4为化合物WAY-297131对MT-2细胞的半数毒性浓度，化合物WAY-297131对MT-2细胞的最大无毒浓度都是20μM，在上述浓度下MT-2细胞形态与对照MT-2细胞相同。计算化合物WAY-297131对MT-2细胞的半数毒性浓度(TC

二、测定化合物抗病毒活性

(一)吸取2μl待测化合物(10mM)加入98μl的PBS中，混匀，将待测化合物稀释至200μM，再进行三倍比梯度稀释，共稀释9个梯度。

(二)吸取2μl EFV(10mM)加入98μl的PBS中，混匀，将EFV进行稀释至200μM，再将EFV进行三倍比稀释，共稀释9个梯度。

(三)将MT-2细胞分别与NL4-3毒株、GX002毒株共同接种于96孔板(每种毒株57个孔，包括3个病毒对照孔，54个样本孔)，每孔90μl，细胞浓度为2.2×10

(四)将稀释好的化合物加入96孔板中，每孔10μl，每个浓度2个复孔，作为实验组；将稀释好的EFV加入96孔板中，每孔10μl，每个浓度2个复孔，作为阳性对照；将不加任何化合物组作为病毒对照组；以不加任何化合物和病毒的组为细胞对照组，于37℃，5％CO

(五)72h后，从孵箱中拿出96孔板，平衡至室温，每孔加入16μlBrightTiter-Glo

结果如图5和图6所示，图5和图6分别是化合物WAY-297131对两种毒株(GX002和NL4-3毒株)的半数抑制浓度曲线。化合物WAY-297131在MT-2细胞系对NL4-3、GX002毒株的IC

其中，TI(Therapeutic Index，治疗指数)＝TC

结果如表1所示。

表1化合物抗HIV-1效果

结果表明，化合物WAY-297131有明显的在体外抑制HIV-1CRF01_AE亚型临床分离株GX002的复制的作用，治疗指数(TI)为3798。化合物WAY-297131有明显的在体外抑制HIV-1B亚型野生株NL4-3的复制的作用，治疗指数(TI)为470。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。