一种用于评估胃癌预后的生物标志物检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于评估胃癌预后的生物标志物检测方法。

背景技术

据2020年全球恶性肿瘤数据统计，胃癌的发病率和死亡率位居第5和第4位。多数患者早期无明显症状，发现是已至进展期或中晚期，导致胃癌患者术后生存率较低，复发率较高。目前尚缺乏稳定可靠的生物标记物来预测胃癌的发生发展。

现有预测胃癌预后方法为美国癌症联合会(AJCC)第八版TNM分期。具体分期方法如下表1所示，原发肿瘤定义(T)：

表1

肿瘤可以穿透固有肌层达胃结肠韧带或肝胃韧带或大小网膜，但没有穿透覆盖这些结构的脏层腹膜。在这种情况下，原发肿瘤的分期为T3。如果穿透覆盖胃韧带或网膜的脏层腹膜，则应当被分为T4期。

胃的邻近结构包括脾、横结肠、肝脏、膈肌、胰腺、腹壁、肾上腺、肾脏、小肠以及后腹膜。

经胃壁内扩展至十二指肠或食管的肿瘤不考虑为侵犯邻近结构，而是应用任何这些部位的最大浸润深度进行分期。

表2为区域淋巴结定义(N)表2

表3为远处转移的定义(M)表3

表4为AJCC预后病理分期(pTNM)表4

现有预后分期方法为针对手术切除标本的病理分期，根据肿瘤浸润深度，区域淋巴结转移个数，远处转移情况进行预测。但是胃癌组织学类型差异较大，且存在较大异质性。例如同为II期的胃癌，印戒细胞癌和高分化腺癌的预后差距十分巨大。因此同为II期患者，可能生存期存在极大差异。目前尚未有针对胃癌预后进行预测的分子病理学分期方法出现。

因此，针对以上不足，需要提供一种新型预测检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于现有的胃癌的预后预测只能基于手术切除标本的病理分期，但是相同病理分期的患者预后差距极大，某些一期胃癌的患者有可能很快复发，但某些四期胃癌的患者又能比较长时间的生存，预测检测效果不准。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于评估胃癌预后的生物标志物检测方法，所述生物标志物检测方法包括如下步骤：

(1)将胃癌组织进行浸泡，将切面修整后进行脱水和透明；

(2)将步骤(1)的胃癌组织放入液体石蜡中浸泡，然后将胃癌组织放入模具中，使切面平整的一面朝下，向模具中滴入液体石蜡，灌满模具，将模具移至冰台上静置得到蜡块；

(3)将步骤(2)得到的蜡块进行切片得到胃癌组织切片；

(4)将步骤(3)得到的胃癌组织切片进行烘烤，然后进行脱蜡水化，清洗；

(5)将步骤(4)清洗后的胃癌组织切片置于避光保湿盒中，使用过氧化氢溶液覆盖胃癌组织切片，然后进行清洗；

(6)将步骤(5)清洗后的胃癌组织切片放入修复盒中，使用修复液进行修复；

(7)将修复后的胃癌组织切片使用BSA溶液进行封闭，然后进行清洗；

(8)向步骤(7)清洗后的胃癌组织切片中加入一抗溶液，在湿盒中静置，静置后进行清洗；

(9)将步骤(8)清洗后的胃癌组织切片加入反应增强液，静置后进行清洗；

(10)将步骤(9)清洗后的胃癌组织切片中加入二抗溶液，覆盖静置后进行清洗；

(11)将步骤(10)清洗后的胃癌组织切片去除表面水分，加入DAB显色液至颜色变黄时停止，然后加入苏木素染液、分化液，染色完成后进行过缸；

(12)过缸后取出胃癌组织切片，使用中性树胶加至胃癌组织切片中央，使用扫片机扫片，获取图像，进行评分；

(13)制备胃癌组织切片，重复步骤(1)～(7)一次，向切片上加EB病毒诱导体3荧光抗体-YD7，孵育12小时后，于荧光显微镜下观察荧光强度；

(14)结合步骤(12)中的评分和步骤(13)中组织荧光强度进行评估，从而预测胃癌患者的预后，完成检测。

本发明提供的生物标志物检测方法，从免疫学角度出发，寻求有效的分子预测治疗靶点，从而便于患者和医生规划后续治疗，以及复查的频率和年限。本发明经过对胃癌肿瘤免疫微环境的单细胞RNA测序分析，结合癌症基因组图谱计划(TCGA)的生物信息学分析，筛选出了胃癌进展的关键基因，并且在不同人类胃癌细胞株、小鼠动物模型、胃癌患者组织标本库均进行了验证。因此对该基因所表达的蛋白进行免疫组织化学染色和免疫荧光，可以较好的预测胃癌患者的预后。本发明的理论基础是由胃癌发生发展的机制入手来进行预后的评估，出发点较为新颖，且临床应用价值较高，实施过程简便易行，所使用的耗材价格合理且获取方便。

本发明中，为寻找可能的造成胃癌预后较差的特征性基因，本发明对发生了腹膜转移的胃癌患者进行腹水或腹腔灌洗液的单细胞RNA测序，通过分析发现，EB病毒诱导体3高表达的患者，其腹水T细胞中调节性T细胞的比例上升。结合对癌症基因组图谱计划的生信分析发现，EB病毒诱导体3的表达与胃癌早期淋巴结转移相关。EB病毒诱导体在胃癌组织和正常胃黏膜组织间的表达存在统计学差异，因此通过本发明所述的检测方法，对组织染色后对结果评分，可以对结果进行很清晰的分析和确认。

本发明所述胃癌组织，可以是胃癌的确切组织，也可以是胃癌旁组织。

本发明所述重复步骤(1)～(7)一次的含义为，制备胃癌组织切片后，依次进行步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)、步骤(7)的过程一次。

优选地，步骤(2)中所述浸蜡为：将胃癌组织在石蜡I中浸泡30min，接着在石蜡II中浸泡90min。

石蜡I为二甲苯和石蜡混合溶液；石蜡II为100％石蜡溶液。

优选地，步骤(2)中所述静置为20～50min，例如可以是20min、30min、40min或50min等。

优选地，步骤(3)中所述切片的过程为：将蜡块固定于切片机上，上下左右修整切面，使切面与刀片平行，修整至组织能够暴露最大切面，设置切片厚度为4μm，将切片平铺至预热的水面上，分离切片，平展后将其置于载玻片中央位置，得到胃癌组织切片。

优选地，步骤(4)中所述烘烤的温度为60～70℃，例如可以是60℃、62℃、65℃、68℃或70℃等。

优选地，步骤(4)中所述烘烤的时间不低于4小时。烘烤的目的是为了防止组织脱片，后续可进行染色或保存一段时间。

优选地，步骤(4)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

步骤(4)中脱蜡水化的具体过程为：将切片放入液缸中，按照如下梯度依次进行脱蜡水化：二甲苯，30min；100％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇各5min。

优选地，步骤(5)中所述过氧化氢的浓度为3％。主要为了清除内源性过氧化物酶。步骤(5)使用过氧化氢覆盖前，用吸水纸小心擦净胃癌组织切片上周围的水滴，再放入湿盒中。

优选地，步骤(5)中所述覆盖的时间为20～30min，例如可以是20min、25min或30min等。

优选地，步骤(5)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

优选地，步骤(6)中所述修复液为1×EDTA抗原修复液，其作用是去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片的抗原表位，从而改善免疫染色效果。

优选地，步骤(6)中所述修复的时间为10～20min，例如可以是10min、12min、15min、17min或20min等。

步骤(6)中修复盒为耐酸耐碱耐高温的盒子，用于装载玻片。

优选地，步骤(7)中所述BSA溶液的浓度为5％。

优选地，步骤(7)中所述封闭的时间为20～40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min等。

优选地，步骤(7)中所述封闭的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。

优选地，步骤(7)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

优选地，步骤(8)中所述静置的时间为20～30h，例如可以是20h、22h、25h、28h或30h等。

优选地，步骤(8)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

优选地，步骤(9)中所述反应增强液能够增强二抗与组织片上的一抗反应形成免疫聚合物的物质，与HRP催化底物反应，形成棕色不溶性色原，从而在显微镜下显色。

优选地，步骤(9)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

优选地，步骤(10)中所述静置的时间为20～40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min等。

优选地，步骤(10)中所述清洗的清洗剂为PBS溶液，清洗次数为2～5次，例如可以是2次、3次、4次或5次等。

优选地，步骤(11)中加入苏木素染液后，持续30秒，然后涮洗终止染色，加入分化液，持续2～3秒。

本发明步骤(11)中，一般使用吸水纸吸净组织表面水分，然后立即加入DAB显色液，防止组织干燥。显微镜下观察组织颜色变化，当颜色变黄时立即在PBS中涮洗并终止染色。使用苏木素主要是为了将细胞核进行染色。涮洗终止染色后滴加分化液，洗去过多的染色剂。

苏木素的组成为苏木精、碘酸钠、乙醇和去离子水。

分化液为含1％盐酸的70％乙醇溶液。

步骤(11)中过缸的过程为：按照如下梯度依次过缸：70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，各5秒；100％乙醇，1min；二甲苯，10min。

本发明步骤(13)中所使用的EB病毒诱导体3荧光抗体-YD7为自主研究设计。本发明利用噬菌体展示的方法筛选出EB病毒诱导体3亲和力最强的7肽抗体，并于抗体尾部来链接荧光蛋白以发挥示踪功能。相较于普通抗体，本发明的荧光抗体操作简单，检验用时时间更短，可大幅节省实验人员的时间和精力；相较于普通抗体，本发明的抗体属于短肽小分子抗体，体内分部速度快，同时免疫原性低；相对于常规抗体，本发明的抗体携带报告荧光片段，便于使用更为便捷直观的检测方法，可通过简单的实验步骤得到准确的结果，从而降低了检验者的技术门槛。

实施本发明的方法，具有以下有益效果：本发明首次在人体胃癌标本中证实，EB病毒诱导体3在胃癌组织中高表达，并且在病理分期相同的情况下，高表达EB病毒诱导体3的患者预后较差。同时本发明证实EB病毒诱导体3能够抑制肿瘤微环境中T细胞功能，诱导T细胞耗竭，促进肿瘤的进展，这为肿瘤的免疫治疗寻找到了新的治疗靶点。在胃癌患者的组织标本中检测与患者预后相关的EB病毒诱导体3的表达，目前的检测方法技术成熟，花费较低，同时可以为手术后患者的随访制定更加个体化的随访策略，从而在早期发现胃癌的复发和转移以便进行进一步的治疗。

附图说明

图1是本发明中验证EB病毒诱导体3对T细胞耗竭指标影响的结果图。

图2是本发明中构建小鼠荷瘤模型验证EB病毒诱导体3对肿瘤增殖的结果图。

图3是本发明中小鼠荷瘤模型的成瘤结果图。

图4是本发明中小鼠荷瘤模型的肿瘤体积生长曲线图。

图5是本发明中小鼠荷瘤模型的成瘤体积对比图。

图6是本发明中免疫组化检测小鼠荷瘤模型的肿瘤组织中EB病毒诱导体3和细胞凋亡指标胱天蛋白酶3(caspase3)的表达结果图。

图7是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级为阴性的结果图。

图8是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级为“+级”的结果图。

图9是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级为“++级”的结果图。

图10是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级为“+++级”的结果图。

图11是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级折线图。

图12是本发明免疫组化检测胃癌组织样本中EB病毒诱导体3的表达水平免疫组化染色分级柱状图。

图13是本发明中所使用EB病毒诱导体3荧光抗体-YD7与EB病毒诱导体3结合验证的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以下实施例中，实验所用材料如下表5所示

表5

实施例中所用样本为收集于医院的胃肠外科接受胃癌根治术的患者的肿瘤和癌旁标本。

本发明通过以下实验验证EB病毒诱导体3是检测标志物。

EB病毒诱导体3的表达造成胃癌免疫微环境中T淋巴细胞耗竭的验证。

1)磁珠分选CD3 t细胞

①取健康人新鲜外周血20ml，储存于抗凝管中，加入等体积PBS溶液稀释全血。

②在50ml离心管中加入20ml分离液，使用巴氏管将稀释后的血液缓慢加至分离液液面上方，保持两液面界面清晰。

③室温，水平转子1000g，离心30min。离心后可出现明显分层，由上至下分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层。小心的吸取淋巴细胞层至干净离心管中，加入10ml PBS溶液，250g，离心10min洗涤淋巴细胞。弃上清，重复清洗1次。细胞计数后待用。

④本实验采用阳选法分选CD3+T淋巴细胞。计数外周血淋巴细胞，将细胞浓度定量至1.25×107/100μl。根据细胞数量，每107个细胞加入20μl磁珠微球。混匀后，置于冰上孵育15min。

⑤每107个细胞加入1ml PBS清洗残余未结合磁珠，300g/10min离心，弃去上清。PBS重悬细胞至108/500μl的浓度。

⑥将MS磁柱放置于磁场中，500μl PBS润洗磁柱。待液体排空后，将细胞悬液加入磁柱中，每次500μl。

⑦待细胞悬液完全过滤后，加入500μl PBS清洗一遍。将磁柱移出磁场，置于干净15ml离心管上，向其中加入1ml PBS，迅速打出。

⑧重复过柱一次，提高分选细胞阳性率。

⑨T淋巴细胞培养过程中需要加入刺激剂激活细胞活化和维持细胞生长，加入anti-CD3终浓度2μg/ml，anti-CD28终浓度2μg/ml，IL-2终浓度100ng/ml至10％完全培养基中，调整细胞浓度，于48孔板中培养，每孔1×106/ml，隔日换液。

2)混合淋巴细胞培养

①磁珠分选CD3+T细胞，培养备用。

②通过慢病毒感染的方法构建EB病毒诱导体3过表达和敲低的稳转胃癌细胞系，培养至一定细胞数备用。

③将过表达和敲低EB病毒诱导体3的稳转胃癌细胞系接种于24孔板，每孔1x105个。

④第二日，按照肿瘤细胞与T细胞1：5的比例加入CD3+T细胞，混合培养72小时，流式细胞术检测细胞耗竭情况。

EB病毒诱导体3对实验动物胃癌模型的进展的影响。

小鼠皮下荷瘤模型

①构建过表达EB病毒诱导体3的MFC稳转细胞系，培养扩增至所需细胞数，步骤同前。

②在细胞注射前前一周订购小鼠至饲养环境，确保小鼠有足够时间恢复并适应环境。注射前予小鼠注射部位剃毛。

③消化细胞，PBS清洗两次，防止血清干扰成瘤。细胞计数并重悬至3×107个/ml，细胞准备完成后，置于冰上以保持活力。

④抓持小鼠，注射部位皮肤酒精消毒。在皮下进针约1cm，针头可在皮下左右滑动。缓慢打出液体，注射体积为100μl。

⑤剪趾标记，定期观察并记录成瘤情况。

由图1可知，EB病毒诱导体3能够促进调节性T细胞(一种免疫抑制细胞)的分化，上调T细胞表面抑制性受体PD-1、LAG3的表达，抑制效应因子穿孔素、颗粒酶的分泌，从而抑制肿瘤免疫微环境，促进肿瘤进展(PD-1：程序性死亡受体-1；LAG3：淋巴细胞活化基因3；CD：分化抗原)。

图2至图6可知，EB病毒诱导体3能够促进胃癌细胞在小鼠体内的增殖速度和成瘤体积，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡，有利于肿瘤进展，间接的反映了EB病毒诱导体3对胃癌预后的不利影响。

由表6可知：EB病毒诱导体3高表达的患者，肿瘤的T分期、N分期、pTNM分期更高，分化水平更低，提示肿瘤的预后不良。

表6

/>

本发明中，通过实验确认的EB病毒诱导体3基因序列如下：

ATGACCCCGCAGCTTCTCCTGGCCCTTGTCCTCTGGGCCAGCTGCCCGCCCTGCAGTGGAAGGAAAGGGC

CCCCAGCAGCTCTGACACTGCCCCGGGTGCAATGCCGAGCCTCTCGGTACCCGATCGCCGTGGATTGCTC

CTGGACCCTGCCGCCTGCTCCAAACTCCACCAGCCCCGTGTCCTTCATTGCCACGTACAGGCTCGGCATG

GCTGCCCGGGGCCACAGCTGGCCCTGCCTGCAGCAGACGCCAACGTCCACCAGCTGCACCATCACGGATG

TCCAGCTGTTCTCCATGGCTCCCTACGTGCTCAATGTCACCGCCGTCCACCCCTGGGGCTCCAGCAGCAG

CTTCGTGCCTTTCATAACAGAGCACATCATCAAGCCCGACCCTCCAGAAGGCGTGCGCCTAAGCCCCCTC

GCTGAGCGCCAGCTACAGGTGCAGTGGGAGCCTCCCGGGTCCTGGCCCTTCCCAGAGATCTTCTCACTGA

AGTACTGGATCCGTTACAAGCGTCAGGGAGCTGCGCGCTTCCACCGGGTGGGGCCCATTGAAGCCACGTC

CTTCATCCTCAGGGCTGTGCGGCCCCGAGCCAGGTACTACGTCCAAGTGGCGGCTCAGGACCTCACAGAC

TACGGGGAACTGAGTGACTGGAGTCTCCCCGCCACTGCCACAATGAGCCTGGGCAAGTAG。

EB病毒诱导体3氨基酸序列如下：

MTPQLLLALVLWASCPPCSGRKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGM

AARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPL

AERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTD

YGELSDWSLPATATMSLGK。

EB病毒诱导体3荧光抗体-YD7氨基酸序列如下：

MGGGVYLHWHDMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKHHHHHH。

实施例1

(1)将收集的胃癌和癌旁组织在福尔马林溶液中浸泡48小时以上，取出组织并将切面修剪整齐，将装有组织的包埋盒按照梯度设置依次进行脱水和透明。

(2)将胃癌和癌旁组织进行浸蜡，在石蜡Ⅰ中浸泡30min；石蜡Ⅱ中浸泡90min。取出组织放置于模具中，调整组织切面后进行灌蜡，将模具移至冰台上，静置30min后取出蜡块，可于常温下保存。

(3)提前打开水浴锅，预热至50℃。将蜡块固定于切片机上，上下左右修整切面，使切面与刀片平行，修整至组织能够暴露最大切面，设置切片厚度为4μm。用镊子小心地将切片平铺至预热的水面上，使用预冷的镊子分离切片。待切片平展后用载玻片将切片捞起，使其位于载玻片中央位置，在载玻片标记相关组织样本信息。

(4)预热烤箱至65℃，将胃癌组织切片放入烤箱烘烤4小时以上，防止脱片，后续可进行染色或保存一段时间。

(5)将烘烤过的切片按照如下梯度依次放入液缸中进行脱蜡水化：二甲苯，30min；100％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇各5min；PBS溶液摇床清洗5min，清洗3次。

(6)PBS清洗后，用吸水纸小心擦净载玻片上组织周围的水滴，将载玻片放置于湿盒中，滴加3％过氧化氢溶液覆盖组织，室温静置25min，清除内源性过氧化物酶。PBS溶液清洗3次，每次5min。

(7)配制适量1×EDTA抗原修复液，置于100℃水浴锅中加热至沸腾。放入修复盒中，持续15min后取出，放置于室温自然降温。

(8)擦净载玻片上组织周围的水滴，滴加5％BSA溶液，37℃封闭30min，PBS溶液清洗3次，每次5min。

(9)向组织表面滴加适量一抗溶液，在湿盒内4℃放置过夜。

(10)第二日，取出湿盒，室温静置1小时，PBS溶液清洗3次，每次5min。

(11)滴加适量反应增强液，覆盖组织表面，室温静置20min，PBS溶液清洗3次，每次5min。

(12)滴加适量二抗，覆盖组织表面，室温静置30min，PBS溶液清洗3次，每次5min。

(13)用吸水纸吸净组织表面水分，立即加入DAB显色液，防止组织干燥。显微镜下观察组织颜色变化，当有颜色明显变黄时立即在PBS中涮洗终止染色。

(14)滴加适量苏木素染液，计时30秒，进行细胞核染色。涮洗终止染色后滴加分化液，作用2-3秒，洗去组织过多结合的染色剂。

(15)待切片染色完成后，按照梯度依次过缸。

(16)取出载玻片，滴加少量中性树胶于标本中央，待中性树胶晾干后，使用扫片机扫片，获取图像，进行评分。

具体的评分过程和评分标准如下：

EB病毒诱导体3表达的评分方法，预测患者预后较差的验证。

本实验中免疫组化的结果由2名研究人员独立评分，以减少评分误差和提高评分的可靠性。如果评分结果有分歧，可以再次讨论并达成一致意见。评分的判定根据阳性细胞的着色强度和所占视野的比例。染色强度分为无染色：0分；弱染色：1分；中等染色：2分；强染色：3分。染色比例分为4级，小于1％：0分；1％-25％：1分；26％-50％：2分；51％-75％：3分；大于75％：4分。染色评分＝染色强度×染色比例。根据染色评分进行染色分级，0分为阴性；1-3为“+”；4-6分为“++”；7-12分为“+++”。

(13)制备胃癌组织切片，重复步骤(1)～(8)一次，向切片上加入EB病毒诱导体3荧光抗体-YD7，孵育12小时后，于荧光显微镜下观察荧光强度；

(14)结合步骤(12)中的评分和步骤(13)中组织荧光强度进行评估，从而预测胃癌患者的预后，完成检测。

由图7-图10中的染色结果可知，胃癌组织免疫组化染色EB病毒诱导体3在胃癌细胞中存在高低表达情况；

图11和图12可知，EB病毒诱导体3在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织；在胃癌患者中，EB病毒诱导体3高表达的比例较高。

表6可知，EB病毒诱导体3在胃癌组织中的表达水平与患者的临床病理特征相关性分析中，T分期、N分期和肿瘤分化程度等和肿瘤恶性程度相关的指标具有相关性(P<0.05)。

图13中的染色结果可知，EB病毒诱导体3阳性的样本，荧光强度更高，具备较好的指示意义。

综上所述，本发明中：对胃癌患者术后或胃镜活检病理标本进行免疫组织化学染色和免疫荧光检测。免疫组织化学染色评分为3+，或免疫组织化学染色评分2+同时荧光染色阳性的患者预后较差，在根治手术后建议进行辅助治疗，如化疗等，并应密集随访复查，以便早期干预。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。