二化螟抗药性基因CYP4G90、降低二化螟抗药性的基因片段及其应用

技术领域

本发明涉及一种二化螟抗药性基因CYP4G90、降低二化螟抗药性的基因片段及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

二化螟Chilo suppressalis(Walker)属于鳞翅目，草螟科，是一种危害水稻生产的重要害虫，主要分布于亚洲、中东和南欧地区。在中国，二化螟分布遍及各省市，尤以中国长江流域及以南稻区发生较多。二化螟是一种多食性的昆虫，它能够取食水稻、茭白、野茭白、甘蔗、高粱、玉米、小麦、粟、稗、慈姑、蚕豆、油菜、游草等多种植物。由于杂交稻的推广和耕作制度的变革，二化螟的发生量逐年增加，其幼虫通过蛀害可造成水稻枯心、枯鞘、枯孕穗、白穗和虫伤株，例如，在孕穗期、抽穗扬花期等特定时期大发生时，能造成50％～60％的白穗率，严重时高达80％以上，最终可导致减产50％以上。据统计，中国二化螟年发生面积为1400万公顷次，经济损失达115亿元。因此，如何通过阻止二化螟的爆发来增加水稻产量，是目前人类迫切需要解决的问题。

目前主要以化学农药来防治二化螟，但二化螟已对各类杀虫剂产生了不同水平的抗性，这与其爆发危害有直接关系。早在20世纪60年代的日本就已经发现有二化螟种群对敌百虫、对硫磷、甲基对硫磷和杀螟松产生抗性；80至90年代的中国发现有二化螟种群也对上述四种杀虫剂产生低至中等水平抗性。与此同时，杀虫单和杀虫双被引入稻田使用，到90年代中期，二化螟对它们产生高水平的抗性。进入21世纪初期，二化螟进化出对高效低毒的替代性有机磷杀虫剂毒死蜱和三唑磷的高水平抗性；阿维菌素对二化螟的药效显著地下降。氟虫腈于1994年引入水稻田用于防治二化螟，但因其对水生生物具有高毒性已于2009年被禁用。现阶段抗药性监测表明，二化螟已对新型双酰胺类杀虫剂产生了从低到高水平的抗性。鉴于二化螟抗药性发生的日益严重，亟需通过对二化螟进行抗药性监测和抗药性形成机制的研究，开发出治理技术和策略，实现二化螟的可持续防治。

抗药性监测是抗药性研究中的重要组成部分，建立科学、简便易行的抗药性监测方法是开展抗药性研究的前提条件。目前二化螟抗药性监测常采用稻苗浸渍法、稻茎浸渍法和点滴法，反映药剂对二化螟的毒力，从而确定二化螟对药剂的抗性水平，但这种活体生物测定技术的灵敏度较低，很难对二化螟田间低频率的抗药性发生进行预测。因此，随着对二化螟抗药性分子机制的深入研究，二化螟高灵敏度的抗药性分子检测技术应随之建立。

二化螟抗药性分子检测技术应是基于对二化螟抗药性分子机制的研究建立起来。目前二化螟对稻田常用杀虫剂的抗性主要涉及代谢抗性和靶标抗性，代谢抗性揭示杀虫剂到达分子靶标之前如何被代谢酶降解和转运，通过解毒代谢酶基因扩增或过量表达，导致解毒代谢活性显著升高，解毒代谢能力增强而对杀虫剂形成抗性。靶基因位点突变介导的靶标抗性揭示杀虫剂如何发挥致死效应，主要是杀虫剂的靶标构象发生变化，导致杀虫剂与靶标结合力下降，不能有效地杀死害虫，从而使害虫产生对杀虫剂的抗性。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是广泛存在于动物、植物和微生物中的普遍现象，可以作为防御的机制来抵抗体内非正常的核酸。RNA干扰主要是由后转录调控和双链RNA(dsRNA)引起的，压制靶基因的表达。目前，RNAi技术已成为研究基因功能和害虫治理的一种有利用价值的工具。在实际的应用中，通过导入需要沉默的基因的双链RNA(dsRNA)来特异性地降解细胞内的mRNA，压制靶基因的表达，产生功能表型缺失。RNAi可以沉默抗药性相关基因，提高昆虫对杀虫剂的敏感性。因此，RNAi为昆虫抗药性治理提供了理论依据和技术指导，明确了抗药性机制，通过转基因技术可以从实验室向田间实现对害虫抗药性的控制，有望从根本上解决这一问题。

发明人课题组一直致力于研究水稻虫害的抗药性基因，已申请并持有4项发明专利(CN 105969780 B、CN 106191003 B、CN 107266559 B、CN 107828791B)，其内容为针对灰飞虱或褐飞虱抗药性基因的研究成果。目前，发明人课题组针对二化螟抗药性基因的研究已获得重要成果，并以此申报本发明专利。

发明内容

本发明基于发明人课题组的最新研究成果，提出一种二化螟抗药性基因CYP4G90，利用该基因可获得降低二化螟抗药性的基因片段(即dsRNA)，然后对二化螟实施RNAi以降低其抗药性。同时，本发明还提出上述基因片段及其应用。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种二化螟抗药性基因CYP4G90，其特征是，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

该基因的核苷酸序列长度为2342bp，其中，开放阅读框为从5′端第252位到第1928位碱基，编码区长度为1506bp；5′端UTR区从第1位到第251位碱基，3′端UTR区从1929位到2342位碱基。该基因的等电点是8.8，分子重量是63.48kDa。

发明人经研究证实，该基因是二化螟的抗药性基因，针对该基因实施RNAi可降低二化螟的抗药性，提高二化螟对杀虫剂的敏感性。

本发明还提出：

由前文所述二化螟抗药性基因CYP4G90编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQ ID NO.2所示。

该多肽由558个氨基酸残基组成，包含全部的P450家族保守的区域特征，例如螺旋I(AGxxT)，螺旋C(WxxxR)，螺旋K(EXXRXXP)，血红素结合区(PFXXGXXXCXG)以及Meandermotif(PXXFXP)；包含六个不同底物识别位点(SRS)。

本发明还提出：

一种降低二化螟抗药性的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述基因片段的获得过程包括以下步骤：

第一步、从二化螟材料中提取二化螟总RNA；所述二化螟材料至少包括二化螟卵、二化螟幼虫、二化螟成虫之一；

第二步、先以二化螟总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成二化螟cDNA模板；

第三步、采用引物ds-F和引物ds-R、以及二化螟cDNA模板进行PCR扩增；其中，所述引物ds-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.5所示序列，所述引物ds-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO.7所示；将PCR扩增产物进行纯化后获得的dsRNA模板即目的基因片段；

所述基因片段的使用过程包括以下步骤：

第四步、先将基因片段经体外合成获得dsRNA，再将dsRNA施用于二化螟以实施RNA干扰。

更优选地，第一步的具体过程为：

采用总RNA提取试剂盒从二化螟材料中提取二化螟总RNA；以琼脂糖凝胶电泳检测二化螟总RNA完整性；以核酸蛋白定量仪检测二化螟总RNA的浓度以及吸光度值；将二化螟总RNA冻存，冻存温度为-80℃以下；

第二步的具体过程为：

以二化螟总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链；然后，采用cDNA第一链，于PCR仪中合成二化螟cDNA模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得二化螟cDNA模板冻存，冻存温度为-20℃±5℃；

第三步的具体过程为：

采用引物ds-F和引物ds-R、以及二化螟cDNA模板进行PCR扩增，并获得dsRNA模板，扩增时的PCR反应条件为：94℃3min，94℃30s，68℃30s，72℃1min 10个循环，94℃30s，72℃1min 28个循环，72℃10min，12℃保持；电泳纯化所得dsRNA模板，并以回收试剂盒进行纯化后保存，保存温度为-20℃±5℃；

第四步中获得dsRNA的具体过程为：

采用纯化后的dsRNA模板，以试剂盒体外合成dsRNA，并以2～5倍反应体系的无核酸酶水溶解所得dsRNA，然后冻存备用，冻存温度为-80℃以下。

本发明还提出：

一种降低二化螟抗药性的方法，其特征是，采用前文所述的降低二化螟抗药性的基因片段，所述降低二化螟抗药性的方法包括以下步骤：先将基因片段经体外合成获得dsRNA，再将dsRNA施用于二化螟以实施RNA干扰。

本发明还提出：

前文所述二化螟抗药性基因CYP4G90或前文所述降低二化螟抗药性的基因片段用以降低二化螟抗药性的应用。前文所述二化螟抗药性基因CYP4G90或前文所述二化螟抗药性基因CYP4G90编码的多肽用以检测二化螟抗药性的应用。

优选地，所述二化螟抗药性为二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。

本发明还提出：

含有前文所述降低二化螟抗药性的基因片段的药物组合物。

发明人经反复地深入实践研究发现，二化螟细胞色素P450基因中的基因CYP4G90是导致二化螟具有抗药性的关键基因，一方面，通过检测基因CYP4G90和/或其编码的多肽，可检测二化螟的抗药性，另一方面，通过以基因CYP4G90为模板最终体外合成dsRNA，并施用于二化螟以实施RNA干扰，可有效地降低二化螟的抗药性，实现对二化螟的抗药性治理。

附图说明

图1为本发明实施例1中二化螟CYP4G90基因CDS全长电泳图，图中，1～2泳道为二化螟PCR产物的电泳结果；M为DL2000 Marker。

图2为本发明实施例2中二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因荧光定量分析结果图。

图3为本发明实施例3中二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因相对拷贝分析结果图。

图4为本发明实施例4中二化螟的增加T7启动子的抗药性基因CYP4G90序列。

图5为本发明实施例4中增加T7启动子的加强型绿色荧光蛋白基因EGFP序列。

图6为本发明实施例4中二化螟抗药性基因CYP4G90体外合成的dsRNA、以及加强型绿色荧光蛋白基因EGFP体外合成的dsGFP的电泳图。

图7为本发明实施例5中注射后二化螟抗药性基因CYP4G90表达量变化结果图。

图8为本发明实施例5中二化螟氯虫苯甲酰胺抗性基因CYP4G90沉默后氯虫苯甲酰胺抗性的毒理分析结果图。

具体实施方式

一、本发明的主要研究过程如下：

1、确定抗药性基因

本发明利用深圳华大基因研究院测序得到的二化螟细胞色素P450转录组数据获取基因片段序列，通过NCBI-nr数据库同源性比对，得到转录组注释信息，P450的家族姓名由Dr.D.R.Nelson分配(University of Tennessee，Memphis，TN)。利用RT-PCR技术对CYP4G90基因片段进行分子克隆和鉴定，二化螟CYP4G90基因转录本与NCBI的蛋白数据库比对具有相似性。二化螟与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis、黄野螟Heortia vitessoides、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、烟草粉螟Ephestia elutella和棉红铃虫Pectinophora gossypiella的CYP4G90氨基酸序列一致性分别为92％、91％、90％、89％和89％。CYP4G90基因序列为SEQ ID NO.1，其编码的多肽序列为SEQ ID NO.2。

本发明采用氯虫苯甲酰胺抗性二化螟、敏感性二化螟为研究材料，分别提取两者的总RNA，反转录，利用荧光定量PCR技术分析细胞色素P450基因CYP4G90在抗感品系中的不同表达情况，同时为证实CYP4G90表达上调的原因，利用荧光定量PCR技术对CYP4G90的拷贝数进行分析。分别设Actin A1和钠离子通道(para)作为内参基因进行实时定量PCR分析，重复3次试验，反应完成后进行溶解曲线检验，并按照2-

引物CYP4G90q-F：5′-CGACTGTCATCATTGCTA-3′；

引物CYP4G90q-R：5′-TCTCTGGTAGGAAGTTGT-3′。

荧光定量PCR的方法结果显示，CYP4G90的表达水平在氯虫苯甲酰胺的抗性品系中是敏感品系的5.35+倍。相对于敏感品系，CYP4G90在基因组水平上基因拷贝数没有变化，可以认为CYP4G90为单拷贝，可见CYP4G90是由基因转录水平增强而非基因组水平上拷贝扩增引起，过表达的CYP4G90可能由调控区域的突变引起。

综上可知，通过细胞色素P450基因鉴定克隆和基因表达分析，表明过表达的抗药性基因CYP4G90参与二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的形成，使得抗药性基因CYP4G90及其编码的多肽在二化螟的抗药性分子检测方面具有重要的应用价值。

2、研究相关的RNAi技术手段

RNA干扰是通过专一性的外源和内源的双链RNA沉默基因的现象。因此，可以利用RNAi的技术沉默靶基因，成为害虫防治策略的主流手段。

本发明根据二化螟的抗药性基因CYP4G90设计dsRNA引物，根据加强型绿色荧光蛋白基因EGFP设计dsGFP引物(注：本试验采用的加强型绿色荧光蛋白基因EGFP来源于海洋生物发光水母Aequorea victoria)，之后，提取二化螟氯虫苯甲酰胺抗性品系的总RNA，反转录，以二化螟cDNA为模板，用加过T7序列的引物，进行PCR扩增，合成dsRNA模板(即SEQ IDNO.3)；以预先构建的含加强型绿色荧光蛋白基因EGFP的质粒为模板，用加过T7序列的引物，进行PCR扩增，合成dsGFP模板(即SEQ ID NO.4)。在PCR扩增中，用于合成dsRNA模板的引物为引物ds-F和引物ds-R，用于合成dsGFP模板的引物为引物dsGFP-F和引物dsGFP-R。

其中，引物ds-F的核苷酸序列为：

dsCYP4G90-F：5′-CCTGGACTTGCTTTTGGA-3′，即SEQ ID NO.5，在其5′端加T7启动子序列；

引物ds-R的核苷酸序列为：

dsCYP4G90-R：5′-GCGTAGTAGTGACGGTTGG-3′，即SEQ ID NO.6，在其5′端加T7启动子序列；

引物dsGFP-F的核苷酸序列为：

dsGFP-F：5′-GGAGCGCACCATCTTCTT-3′，在其5′端加T7启动子序列；

引物dsGFP-R的核苷酸序列为：

dsGFP-R：5′-CTTCTCGTTGGGGTCTTTG-3′，在其5′端加T7启动子序列；

T7启动子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，即SEQ ID NO.7。

利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)回收试剂盒对dsRNA模板和dsGFP模板进行纯化。使用T7RiboMAX

将dsRNA、dsGFP和焦碳酸二乙酯处理水分别注射二化螟4龄幼虫，其中，处理组注射仅含dsRNA的焦碳酸二乙酯处理水(dsRNA组)；对照组中：dsGFP组注射仅含dsGFP的焦碳酸二乙酯处理水，CK组注射不含dsRNA和dsGFP的焦碳酸二乙酯处理水；其中dsRNA和dsGFP的浓度均为4μg/μL。每处理注射30头4龄幼虫，进行3次独立重复实验。

采用点滴法对各组二化螟幼虫进行毒力测定，同时取处理组的二化螟幼虫，提取总RNA，反转录获得cDNA第一条链，用实时定量PCR检测CYP4G90表达量的变化。

本发明研究中，用基因CYP4G90的dsRNA注射二化螟幼虫，以注射加强型绿色荧光蛋白基因EGFP合成的dsGFP和焦碳酸二乙酯处理水为对照组，对注射干扰后的二化螟幼虫进行毒理分析。

本发明发现沉默氯虫苯甲酰胺抗性相关的CYP4G90基因后，可以显著地提高二化螟对氯虫苯甲酰胺的敏感性，因此CYP4G90基因是氯虫苯甲酰胺抗性的关键作用基因。通过合成CYP4G90基因的dsRNA进行注射RNAi可以降低靶基因的表达量，增加二化螟对杀虫剂的敏感性，因此CYP4G90基因双链RNA的合成在二化螟抗药性治理方面具有重要的应用价值。

3、研究成果的总结

本发明通过对二化螟转录组的分析，获得了二化螟细胞色素P450家族基因，然后利用RT-PCR技术克隆鉴定P450家族基因，获得二化螟细胞色素P450家族基因序列。通过荧光定量PCR技术对二化螟氯虫苯甲酰胺抗性品系和敏感品系进行对比分析，发现CYP4G90基因表达上调，利用RACE技术获得CYP4G90全长基因，然后以CYP4G90基因片段为模板合成相应dsRNA，并利用注射目的片段dsRNA的方法分析CYP4G90基因在RNAi沉默后二化螟中CYP4G90 mRNA的表达水平，并对抗药性二化螟成虫进行毒力测定。以上研究结果表明，CYP4G90基因的分离克隆，对于二化螟高灵敏度的抗药性分子检测和二化螟的抗药性治理具有重要作用。

现有技术利用RNAi技术抗虫的思路主要有两种：第一种是找到害虫的致死基因，然后据此设计合成dsRNA，能直接导致害虫死亡；第二种是找到害虫的致死基因，然后据此设计转基因农作物，使农作物具备能直接导致害虫死亡的能力。然而，考虑到社会公众对转基因技术普遍带有很深的误解，转基因农作物很难被直接接受；同时，能直接导致害虫死亡的dsRNA，容易被社会公众误认为该dsRNA本身带有毒性，使这种dsRNA也不容易被接受。与之相比，本发明利用RNAi技术，采用dsRNA降低二化螟抗药性，使二化螟更容易被杀虫剂杀灭，可有效地避免社会公众产生类似的误解，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。

二、本发明的具体实施例：

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

本发明所用的氯虫苯甲酰胺抗性品系2009年采自安徽芜湖市，用氯虫苯甲酰胺筛选25代获得；敏感品系2009年采自安徽芜湖市，在未接触任何杀虫剂情况下室内连续饲养获得。

本发明所涉及的试剂均为市购。

下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

本实施例为：CYP4G90基因的克隆和序列分析。

本发明通过构建二化螟转录组文库进行高通量测序的方法获得转录组数据，在此基础上获得CYP4G90基因片段。

(1)二化螟总RNA提取。

以敏感品系二化螟为研究材料，选取二化螟卵、1～5龄幼虫和雌雄成虫使用TRIzol总RNA提取试剂盒(上海英骏生物技术有限公司)对其进行混合提取，操作方法参照试剂盒说明书。提取的二化螟总RNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，用Nanodrop2000核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，确认RNA的质量，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

(2)cDNA模板的制备。

以二化螟总RNA为模板，使用反转录试剂盒PrimeScript

(3)引物的设计。

本发明以转录组中CYP4G90基因片段序列，利用primer premier 5.0软件设计引物，设计的引物为：

CYP4G90-F：5′-TGGCTGTGATGAAGATGTG-3′；

CYP4G90-R：5′-TAGGAAGTTGTCAGGGTCG-3′。

引物CYP4G90-F和CYP4G90-R由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

(4)PCR扩增、回收纯化及测序。

以二化螟的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL：2.5μL 10×PCRBuffer，2.5μL MgCl

(5)测序结果分析。

用基因探索者软件分析所测得的序列，并通过NCBI的BLAST程序进行同源性比对分析，用GeneDoc进行比较分析。

(6)CYP4G90全长基因克隆。

以二化螟总RNA为模板，使用Clontech

(7)全长引物设计。

CYP4G90基因的5′和3′端引物使用Primer Premier 5.0软件设计，设计的5′端引物为：

5CYP4G90GSP：5′-TCCAAAAGCAAGTCCAGGAAAGCGAG-3′；

5CYP4G90NGSP：5′-GTCGTTTTCGTGGCAGGGATTTCAGT-3′。

设计的3′端引物为：

3CYP4G90GSP：5′-ACTGAAATCCCTGCCACGAAAACGAC-3′；

3CYP4G90NGSP：5′-ACCCACCAGTGCCTATCATTACTCGCC-3′。

CYP4G90基因CDS扩增引物分别为：

CYP4G90-CDSFP：5′-TCTCCCATATGGTCGACCTG-3′；

CYP4G90-CDSRP：5′-TACTTTGAATCCTTCAGCGC-3′。

(8)PCR扩增。

CYP4G90基因全长克隆以二化螟的5′(3′)cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL：3μL 10×LA buffer，3μL MgCl

CYP4G90基因CDS克隆以二化螟的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL：2.5μL 10×PCR Buffer，2.5μL MgCl

回收纯化、测序及测序结果分析同本实施例中(4)和(5)的相关步骤。

二化螟CYP4G90基因CDS全长电泳图如图1所示。1～2泳道为二化螟PCR产物的电泳结果；M为DL2000 Marker。

实施例2

本实施例为：二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因荧光定量分析。

选取幼虫期的氯虫苯甲酰胺抗性和敏感性二化螟为材料，利用荧光定量PCR分析这些材料中CYP4G90基因的表达水平，从而可以证实CYP4G90基因表达水平与氯虫苯甲酰胺抗性的关系。

(1)二化螟总RNA提取。

以幼虫期的氯虫苯甲酰胺抗性和敏感性二化螟为材料，使用SV Total RNA提取试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)依照操作步骤提取总RNA，提取的二化螟总RNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，用Nanodrop2000核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，确认RNA的质量，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

(2)cDNA模板的制备。

以二化螟总RNA为模板，使用反转录试剂盒PrimeScript

(3)荧光定量PCR。

利用氯虫苯甲酰胺抗性和敏感性二化螟cDNA为模板分别进行荧光定量PCR扩增。CYP4G90基因和内参Actin A1的引物使用Beacon Designer 7软件设计，CYP4G90基因引物为前文所述的引物CYP4G90q-F和引物CYP4G90q-R，内参Actin A1的引物序列是：

5′-GTCGCTTCCCAAATTACATC-3′和5′-CTCCATATCGTTCCAGTCG-3′。

实时定量PCR(quantitative real-time PCR)试验操作在ABI 7300实时定量PCR仪上进行，其反应体系及程序参照

(4)本实验将采用2-

ΔΔCt＝(Ct

每个品系设置3个生物学重复，每个生物学重复3次。数据使用SPSS 15.0软件完成(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)。数据以mean±SE表示，mRNA相对表达量的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和邓肯氏新复极差法测验比较目标基因在各品系中的表达量的差异。

二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因荧光定量分析结果如图2所示。结果显示，CYP4G90的表达水平在氯虫苯甲酰胺的抗性品系中是敏感品系的5.35+倍。

实施例3

本实施例为：二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因相对拷贝分析。

选取幼虫期的氯虫苯甲酰胺抗性和敏感性二化螟为材料，利用荧光定量PCR分析这些材料中CYP4G90基因的相对拷贝数，初步证实CYP4G90基因表达上调的原因。

(1)基因组DNA提取。

以幼虫期的氯虫苯甲酰胺抗性和敏感性二化螟为材料，按CTAB法提取基因组DNA，提取的二化螟基因组DNA使用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳，确认其大小和质量。然后放入冰箱中在-20℃条件下冻存。

(2)荧光定量PCR。

荧光定量PCR使用二化螟的para基因作为内参，二化螟的para基因是单拷贝的基因。基因拷贝数的定量PCR的扩增效率与基因转录水平的定量PCR是一致的。para基因引物序列分别是：5′-AGCCATACCTTCCATCTT-3′和5′-TTCGTGACTTAGTGTTGTG-3′。荧光定量PCR试验操作、反应体系、程序及数据分析依据实施例2的相关步骤进行。

二化螟氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系中CYP4G90基因相对拷贝分析结果如图3所示。结果显示，相对于敏感品系，抗性品系的CYP4G90在基因组水平上基因拷贝数没有变化。

实施例4

本实施例为：体外合成二化螟抗药性基因CYP4G90的dsRNA；体外合成加强型绿色荧光蛋白基因EGFP的dsGFP。

(1)以二化螟氯虫苯甲酰胺抗性品系为研究材料，二化螟总RNA提取和cDNA模板的制备依据实施例1进行操作。

(2)引物设计。

引物使用Primer Premier 5.0软件设计，抗药性基因CYP4G90的dsRNA的引物、加强型绿色荧光蛋白基因EGFP的dsGFP的引物核苷酸序列分别为：

dsCYP4G90-F：5′-CCTGGACTTGCTTTTGGA-3′；

dsCYP4G90-R：5′-GCGTAGTAGTGACGGTTGG-3′；

dsGFP-F：5′-GGAGCGCACCATCTTCTT-3′；

dsGFP-R：5′-CTTCTCGTTGGGGTCTTTG-3′。

上述上下游引物序列均在5′端加T7启动子序列，T7启动子序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。

(3)合成dsRNA模板和dsGFP模板。

以二化螟cDNA为模板、以预先构建的含加强型绿色荧光蛋白基因EGFP的质粒为模板，分别用加过T7序列的引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系总体积为50μL：5μL 10×PCR Buffer，5μL MgCl

为达到dsRNA合成需要，上述PCR体系需增加10～20倍。

PCR反应条件：94℃3min，94℃30s，68℃30s，72℃1min 10个循环，94℃30s，72℃1min 28个循环，72℃10min，12℃保持。

(4)dsRNA模板和dsGFP模板的回收纯化。

选择Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)回收试剂盒对PCR电泳产物进行纯化，操作步骤依据说明书进行。回收产物-20℃保存备用。

(5)dsRNA和dsGFP的体外合成。

使用T7 RiboMAX

二化螟的增加T7启动子的抗药性基因CYP4G90序列如图4所示；增加T7启动子的加强型绿色荧光蛋白基因EGFP序列如图5所示。抗药性基因CYP4G90体外合成的dsRNA、以及加强型绿色荧光蛋白基因EGFP体外合成的dsGFP的电泳图如图6所示。

实施例5

本实施例为：二化螟抗药性基因CYP4G90的RNAi效应检测。

(1)注射dsRNA、dsGFP

本发明利用dsRNA微量注射的方法干扰二化螟抗药性基因CYP4G90。首先制备微量注射针，设置拉针仪(Model P-97，Sutter Instruments Co.，Novato，CA)参数将玻璃毛细管拉成外径1mm、内径0.5mm的毛细针。磨针时将毛细针倾斜坡度放在20°～30°之间，在磨石上加水，打开开关转动磨石，粗调让针尖靠近磨石，然后微调，当水倒吸时，说明针已磨通，同时要保证针头尖细且坚硬。

试验中所注射的dsRNA和dsGFP用焦碳酸二乙酯处理水溶解，最终稀释浓度为4μg/μL。所使用的微量注射系统包括注射器(Eppendorf，FemtoJet)、操纵仪(Eppendorf，InjectMan NI 2)、体式显微镜(Nikon，DXM1200)。

采用氯虫苯甲酰胺抗性品系二化螟。将二化螟四龄幼虫放置于试管中，封口后通CO

注：处理组(即dsRNA组)注射含dsRNA的焦碳酸二乙酯处理水；对照组中，dsGFP组注射仅含dsGFP的焦碳酸二乙酯处理水，CK组注射不含dsRNA和dsGFP的焦碳酸二乙酯处理水。

(2)氯虫苯甲酰胺生物测定。

注射后间隔3h，采用稻苗浸渍法对干扰过后的抗药性二化螟幼虫进行毒力测定。每个浓度使用30头幼虫测试，重复三次。各组采用50ppm，25ppm和12.5ppm三个浓度的氯虫苯甲酰胺进行毒理分析。处理后二化螟幼虫放置于温度为28℃±1℃、相对湿度70～80％、光周期16L:8D的环境内饲养。48h后检查死亡率。本实验统计方法为Duncan test(P<0.05)，字母不同代表有显著差异。统计软件为SPSS 15.0。

(3)实时定量PCR引物设计。

根据已知二化螟抗药性基因CYP4G90的序列、加强型绿色荧光蛋白基因EGFP的序列，运用Beacon Designer 7软件设计PCR引物，以Actin A1和G3PDH为内参基因。

实时定量PCR上下游引物设计如下：

CYP4G90q-F：5′-CGACTGTCATCATTGCTA-3′；

CYP4G90q-R：5′-TCTCTGGTAGGAAGTTGT-3′；

GFPq-F：5′-CACCATCTTCTTCAAGGA-3′；

GFPq-R：5′-GTGGCTGTTGTAGTTGTA-3′；

Actin A1q-F：5′-GTCGCTTCCCAAATTACATC-3′；

Actin A1q-R：5′-CTCCATATCGTTCCAGTCG-3′；

G3PDHq-F：5′-GTTGTGCCTCACCAATTTGTCAG-3′；

G3PDHq-R：5′-GCCACCTTCAGCGATGTCG-3′。

(4)实时定量PCR。

二化螟总RNA提取和cDNA模板的制备，依据实施例2的相关步骤进行。荧光定量PCR试验操作、反应体系、程序及数据分析依据实施例3的相关步骤进行。

注射后各组二化螟基因CYP4G90表达量变化结果如图7所示。

二化螟氯虫苯甲酰胺抗性基因CYP4G90沉默后氯虫苯甲酰胺抗性的毒理分析结果如图8所示。

结果表明，对二化螟的氯虫苯甲酰胺抗性品系：

48ppm氯虫苯甲酰胺浓度处理干扰后二化螟的氯虫苯甲酰胺抗性品系结果显示，dsGFP组和CK组的毒理死亡率分别为55.37％和50.32％，dsRNA组的二化螟死亡率为88.56％。

24ppm氯虫苯甲酰胺浓度处理干扰后二化螟的氯虫苯甲酰胺抗性品系结果显示，dsGFP组和CK组的毒理死亡率分别为40.25％和42.33％，dsRNA组的二化螟死亡率为65.45％。

12ppm氯虫苯甲酰胺浓度处理干扰后二化螟的氯虫苯甲酰胺抗性品系结果显示，dsGFP组和CK组的毒理死亡率分别为25.35％和22.37％，dsRNA组的二化螟死亡率为43.16％。

以上结果表明，沉默氯虫苯甲酰胺抗性相关的CYP4G90基因后，可以显著地提高二化螟对氯虫苯甲酰胺的敏感性。

上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。