热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-氨基酸合成中的应用

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-氨基酸合成中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

D-氨基酸是一种重要的非天然氨基酸，广泛分布在微生物、植物和动物中。D-氨基酸可以合成各种抗生素类药物，而其中的一些药物如阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素等被世界卫生组织定义为必须药物。不仅如此，D-氨基酸在食品、农业及化工行业都有着广泛的作用。

可用于合成光学纯D-氨基酸的生物催化剂主要有三类，分别为水解酶、氧化还原酶和D-氨基酸转氨酶。其中水解酶是制备D-氨基酸较为广泛的一类酶，它们通常以外消旋化合物作为底物，通过拆分理论上可以达到50％的得率，结合消旋酶可以实现100％的理论得率，具有底物范围广，产物得率高，副产物少等优点。目前报道的用于合成D-氨基酸的水解酶主要包括D-海因酶和D-氨甲酰水解酶偶联的海因酶过程、N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶、D-氨基酸酰胺酶、D-氨基肽酶和D-肽酶。

D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，HyuC)是属于腈水解酶超家族的第6类(EC3.5.1.77)，它可以将N-氨甲酰-D-氨基酸水解得到D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯D-氨基酸。然而已鉴定的野生型酶及其突变体的热稳定性普遍较低。为满足工业化应用的需求，不同属性的D-氨甲酰水解酶的定向挖掘与热稳定性分析，以及基于定向进化和理性设计的D-氨甲酰水解酶热稳定性分子改造等研究已被广泛开展。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体，在发明人前期研究的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶的基础上进行了适当的突变，从而获得了热稳定性提高的突变体，使其能在食品和医药领域中有广泛应用。

本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体，所述D-氨甲酰水解酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶为亲本，分别将其第138、202、204、208、277及284位的氨基酸进行突变。

进一步地，所述D-氨甲酰水解酶突变体为将亲本的第138位点的谷氨酸Glu突变为色氨酸Trp或丝氨酸Ser；或，

将亲本的第202位点的丝氨酸Ser突变为脯氨酸Pro；或，

将亲本的第204位点的丝氨酸突变为天冬氨酸Asp或天冬酰胺Asn；或，

将亲本的第208位点的谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp；或，

将亲本的第277位点的精氨酸Arg突变为亮Leu、谷氨酰胺Gln或谷氨酸Glu；或，

将亲本的第284位点的组氨酸His突变为苏氨酸Thr或天冬酰胺Asn。

进一步地，所述D-氨甲酰水解酶突变体为将亲本的第202位点的丝氨酸Ser突变为脯氨酸Pro，并将第208位的谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp，并将第277位的精氨酸Arg突变为亮Leu。

本发明的第二个目的是提供一种所述D-氨甲酰水解酶突变体的编码基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述D-氨甲酰水解酶突变体的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

进一步地，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

进一步地，所述基因工程菌是以pET-28a(+)为表达载体。

本发明的第五个目的是提供所述D-氨甲酰水解酶突变体或所述基因工程菌在制备D-氨基酸中的应用。

进一步地，所述应用是以N-氨甲酰-D-氨基酸为底物，以所述D-氨甲酰水解酶突变体或所述基因工程菌为催化剂，催化生成D-氨基酸。

进一步地，所述催化的条件是38～42℃，150～250rpm。

本发明的有益效果是：

本发明在来源于Nitratireductor indicus的D-氨甲酰水解酶(NiHyuC-M4)的基础上通过定点突变获得了热稳定性不同程度提高的突变体。其中，单突变体E138W、E138S、S202P、S204D、S204N、E208D、R277L、R277Q、R277E、H284T、H284N在40℃的t

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g·L

LB固体培养基：蛋白胨10g·L

下述实施例中涉及的蛋白纯化缓冲液如下：

结合液A：20mM咪唑，500mM氯化钠，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5％甘油，用HCl调至pH 7.4；

洗脱液B：500mM咪唑，500mM氯化钠，20mM Tris，5％甘油，用HCl调至pH 7.4。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

D-氨甲酰水解酶酶活的检测：在1.5mL的EP管中进行反应。取10μL蛋白浓度为1mg·mL

HPLC分析条件：流动相为KH

酶活力单位定义：30℃，每分钟催化N-氨甲酰-D-氨基酸转化生成1μmol的氨基酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

实施例1：热稳定性D-氨甲酰水解酶突变酶的初筛

具体步骤如下：

1、(1)突变体的构建：

突变引物如下所示，下划线为突变位点：

表1突变引物

以将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的D-氨甲酰水解酶第202位突变为脯氨酸(S202P)的质粒构建为例，将连接有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的pET-28a(+)载体为模板，以S202P-F、S202P-R为引物，进行PCR扩增得到编码氨基酸序列第202位丝氨酸突变为脯氨酸的突变体(S202P)的核苷酸序列；

将上一步得到的含有重组基因的PCR产物用DpnI消化去除模板，将消化产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到转化液；将转化液涂布于含50ng·mL

利用表1中的引物及与步骤(1)相同的方法，构建得到突变体E138W/S、S202P、S204D/N、E208D、R277L/Q/E、H284T/N的重组质粒。

PCR扩增：反应体系参照表2，总体积为20μL：

表2PCR反应体系

表3PCR扩增程序

(2)热稳定性D-氨甲酰水解酶的初筛

以D-氨甲酰水解酶S202P为例，初筛热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体，步骤如下：

将步骤(1)构建得到的含有D-氨甲酰水解酶突变体S202P的重组大肠杆菌，转接至含终浓度为50ng·mL

将突变体S202P粗酶液分别先在40℃和30℃孵育15min，再冰浴2min，然后进行酶反应。粗酶液在40℃孵育15min后测得的比活力与在30℃孵育15min后测得的比活力比值记为残余活力，以此来初筛热稳定性提高的突变体(M4残余活力约为82％)。

D-氨甲酰水解酶初筛反应体系：以终浓度为2mM的N-氨甲酰-D-色氨酸为底物，加入粗酶液(M4或突变体酶)20μL，并用100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)补足至1mL。于30℃反应10min，并与甲醇按1:3比例添加终止反应。

实施例2：热稳定性D-氨甲酰水解酶突变体酶的复筛

(1)D-氨甲酰水解酶突变体酶的纯化

将实施例1筛选得到的热稳定提高的突变体质粒进行转化，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落到含终浓度为50ng·mL

在收集菌体的每个50mL离心管分别加入适量结合液A，超声破碎后经8000rpm，4℃离心30min，过膜，经镍亲和层析柱纯化。待上样结束后，使用结合液A和洗脱液B配制的不同浓度梯度的咪唑洗脱液进行蛋白洗脱和收集，每个浓度梯度的洗脱体积约为5-10个柱体积。待洗脱结束后，将收集液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，根据SDS-PAGE的结果收集纯度较高的蛋白进行超滤浓缩去除咪唑。液氮速冻后-80℃保存。

(2)热稳定性D-氨甲酰水解酶的复筛

热稳定性的检测方法：将保存的突变体纯酶稀释至1mg·mL

D-氨甲酰水解酶复筛反应体系：以终浓度为2mM的N-氨甲酰-D-色氨酸为底物，加入1mg·mL

突变体热稳定性由高到低依次为R277L，E208D，S202P，R277Q，E138W，H284T，S204D，H284N，S204N，E138S，R277E。

之后又利用与实施例1和实施例2相同的方法最终获得热稳定性明显提高的组合突变体酶S202P/E208D、S202P/R277L、E208D/R277L、S202P/E208D/R277L(表4)。其中S202P/E208D/R277L的热稳定性最好，t

表4热稳定性突变体的比活力及半衰期

实施例3：热稳定性D-氨甲酰水解酶突变体酶的性质研究

1.最适温度

将M4和突变体酶(S202P、E208D、R277L、S202P/E208D、S202P/R277L、E208D/R277L、S202P/E208D/R277L)分别在不同温度(25-55℃)下进行酶反应。定义各酶显示出最高活性的温度为最佳温度。

结果如表5所示，突变体酶S202P、E208D、S202P/E208D的最适温度为50℃，与M4相比提高了5℃；但突变体酶R277L、S202P/R277L、E208D/R277L、S202P/E208D/R277L的最适温度下降为40℃，与M4相比降低了5℃。

2.热力学稳定性实验

通过Nano-DSC测定解折叠温度(T

(1)基线扫描：对缓冲液Tris-HCl(100mM，pH8.0)进行10min的脱气处理后，加入样品池和参比池，去除气泡后进行基线扫描。设置运行程序为：温度扫描范围25-85℃，升温速率1℃·min

(2)样品扫描：将M4或突变体酶稀释至1mg·mL

(3)结果处理：利用NanoAnalyze

结果如表5所示，尽管M4Th3在40℃下的热稳定性明显高于M4，但其T

表5热稳定性突变体的性质表征

3.动力学稳定性实验

采用测定

结果如表5所示，对于S202P和E208D，

4.动力学参数测定

在标准酶活力的测定条件下，测定一定浓度的D-氨甲酰水解酶对不同底物浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0mM)的反应初速率，并用Origin 2019软件拟合得到反应初速率与底物浓度关系的米氏方程曲线，求得K

表6动力学参数

结果如表6所示，尽管S202P/E208D/R277L的V

实施例4：评估热稳定性D-氨甲酰水解酶突变体在D-色氨酸合成中的应用

为进一步探究热稳定性D-氨甲酰水解酶突变体S202P/E208D/R277L在D-色氨酸合成中的应用，测定了40℃下M4与S202P/E208D/R277L对100mM N-氨甲酰-D-色氨酸的反应情况。

将D-氨甲酰水解酶(5kU·L

结果如表7所示，尽管在前2h内S202P/E208D/R277L因比活力略低而转化率低于M4，但注意到在这之后S202P/E208D/R277L的转化率明显高于M4。且M4在反应12h后转化率基本维持不变，24h时转化率为60.8％；而S202P/E208D/R277L则在12h时转化率达到94.5％，并在24h时完成99.4％的转化。这说明S202P/E208D/R277L具有明显优于M4的热稳定性，有利于其工业化应用。

表7D-氨甲酰水解酶催化100mM N-氨甲酰-D-色氨酸的反应进程

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。