一种烷氧基噻吩类极性荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，涉及用于细胞膜的红色荧光成像的探针，特别是指一种烷氧基噻吩类极性荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞膜是一种关键的细胞器，它在结构上构成了细胞的边界以保持整个细胞的完整性，又在功能上与细胞贴壁、迁移、增殖、胞吞、凋亡和信号转导等重要生命活动密切相关。因此，对细胞膜进行高特异性和长时间稳定的成像对生物学、病理学研究都具有非常重要的意义。

荧光成像由于成本低、生物相容性好和灵敏度高而广泛应用于生物医学成像领域。商品化的细胞膜染料包括DiD和FM家族，都存在易穿透细胞膜导致成像时间短等缺点。专利CN107941575A公开了一种由两端分别修饰有胆固醇和吲哚菁染料的聚乙二醇高分子的荧光探针，该探针用于无差别的识别细胞膜；专利CN111272518A公开了一种荧光探针，该荧光可以通过细胞染色的致密程度对白细胞和癌细胞进行区别；而本课题组研究发现，极性敏感的荧光探针在高极性介质中，与溶剂发生较强的溶剂效应，导致发射波长红移。而且极性荧光探针通过调节推拉电子效应达到近红外荧光区(650-900 nm)，避免细胞自发荧光，最大限度地减少光损伤。因此，开发一种极性敏感的探针用于特异性识别癌细胞摸，并进行长时间的荧光成像很有必要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种烷氧基噻吩类极性荧光探针及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供的一种烷氧基噻吩类极性荧光探针，具有式（I）结构：

。

上述的烷氧基噻吩类极性荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛、4-(二苯氨基)苯基硼酸、二(三叔丁基膦)钯和氢氧化钠混合物中加入无水四氢呋喃和水（经过除氧处理），油浴升温至80~100℃，反应4h，进行萃取、水洗、干燥，得化合物1；

技术路线为：

。

（2）用2mL无水乙腈溶解化合物1，加入吗啉，油浴升温至80~100℃，反应8h，进行水洗、干燥，得化合物2；

技术路线为：

。

（3）在化合物2中加入(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈，无水乙醇和哌啶，油浴升温至80~100℃，反应24 h，冷却，析出的沉淀用乙醇洗涤，离心，得到化合物3；

技术路线为：

。

（4）化合物3中加入无水乙腈和碘甲烷，油浴升温至80~120℃，反应10h，反应液减压浓缩，得到的粗品用乙醚洗涤，得到目标化合物（I）；

技术路线为：

。

上述步骤（1）~（4）均在氮气保护下进行。

上述步骤（1）中5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛、4-(二苯氨基)苯基硼酸、二(三叔丁基膦)钯与氢氧化钠的物质的量比为1:1~2:0.03~0.05:2。

上述步骤（2）中化合物1与吗啉的物质的量比为1:100~5:100。

上述步骤（3）中化合物2与(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的物质的量比为1:1~1:2，无水乙醇与哌啶体积比200:1~300:1。

上述步骤（4）中化合物3与碘甲烷的物质的量比为1:50~1:100。

上述的烷氧基噻吩类极性荧光探针具有快速点亮癌细胞的细胞膜，实现了长时间、高选择性的细胞膜红色荧光成像，在非疾病诊断为目的的、在癌细胞的细胞膜内保留长达2h的红色荧光成像中具有较佳的应用，2h后化合物就会慢慢穿透细胞膜进入细胞内，所以在细胞膜上停留最多2h,很多文献只能停留30分钟。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种新型的癌细胞细胞膜成像的荧光探针，该探针的合成方法简单易操作，产率高（≥80%），可以快速的进入细胞膜（加入染料到成像所用时间不超过15min），同时长时间共聚焦成像可达到2h，有利于商业化的推广应用。

2、本发明提供的荧光探针，其分子中的吗啉基团带的正电荷可以与细胞膜上的负电荷相互作用，使其锚定在细胞膜上。同时，分子中的D-π-A共轭结构具有较强的疏水性使其插入细胞膜夹层的疏水区。在这两种作用下，荧光分子可以靶向细胞膜并且较长时间的停留在细胞膜上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为荧光探针（I）的

图2为荧光探针（I）的

图3为荧光探针（I）的高分辨质谱图。

图4为荧光探针（I）在不同极性的四氢呋喃-水体系荧光光谱图，激发波长为535nm，狭缝宽度为3.0 nm。

图5为荧光探针（I）在四氢呋喃-水体系的荧光强度与其极性的线性关系。

图6为荧光探针（I）在癌细胞和正常细胞的成像图，激发波长为561 nm，浓度为10μM。

图7为荧光探针（I）在Hela细胞的成像时间，浓度为10 μM。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

烷氧基噻吩类极性荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在50ml Schlenk中加5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛（119.1 mg），4-(二苯氨基)苯基硼酸（113.1 mg），二(三叔丁基膦)钯（4.9 mg）氢氧化钠（25.7 mg），抽真空干燥，氮气保护下，加入无水四氢呋喃6 mL，水（经过除氧处理）2 mL，将Schlenk放入油浴升温至80℃；反应4h后，将反应液转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，加无水MgSO

（2）用2mL无水乙腈溶解化合物1（123.0 mg），转移至Schlenk中，N

（3）50ml Schlenk加入(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（19.5 mg），氮气保护下，加入化合物2（56.5 mg），无水乙醇（4 mL），哌啶（0.02 mL），油浴升温至85℃，反应24h。冷却，析出沉淀，沉淀用乙醇洗涤离心得到化合物3（59.6mg），产率80%；

（4）N

其表征如下：

1

13

HRMS (APCI) m/z: [M-I]

实施例2

烷氧基噻吩类极性荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在50ml Schlenk中加5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛（119.1 mg），4-(二苯氨基)苯基硼酸（139.2 mg），二(三叔丁基膦)钯（5.49 mg）氢氧化钠（25.7 mg），抽真空干燥，氮气保护下，加入无水四氢呋喃4 mL，水（经过除氧处理）4 mL，将Schlenk放入油浴升温至100℃；反应4h后，将反应液转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，加无水MgSO

（2）用2mL无水乙腈溶解化合物1（183.0 mg），转移至Schlenk中，N

（3）50ml Schlenk加入(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（29 mg），氮气保护下，加入化合物2（56.5 mg），无水乙醇（6 mL），哌啶（0.02 mL），油浴升温至85℃，反应24 h。冷却，析出沉淀，沉淀用乙醇洗涤离心得到化合物3(63.9mg)，产率85%；

（4）N

其表征如下：

1

13

HRMS (APCI) m/z: [M-I]

实施例3

烷氧基噻吩类极性荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在50ml Schlenk中加5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛（119.1 mg），4-(二苯氨基)苯基硼酸（167 mg），二(三叔丁基膦)钯（6.27 mg）氢氧化钠（25.7 mg），抽真空干燥，氮气保护下，加入无水四氢呋喃4 mL，水（经过除氧处理）4 mL，将Schlenk放入油浴升温至100℃；反应4h后，将反应液转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，加无水MgSO

（2）用2mL无水乙腈溶解化合物1（244.0 mg），转移至Schlenk中，N

（3）50ml Schlenk加入(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（34.7 mg），氮气保护下，加入化合物2（56.5 mg），无水乙醇（6 mL），哌啶（0.02 mL），油浴升温至100℃，反应24h。冷却，析出沉淀，沉淀用乙醇洗涤离心得到化合物3(62.4mg)，产率83%；

（4）N

其表征如下：

1

13

HRMS (APCI) m/z: [M-I]

实施例4

烷氧基噻吩类极性荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在50ml Schlenk中加5-溴-4-(6-溴-1-己氧基噻吩)-2-醛（119.1 mg），4-(二苯氨基)苯基硼酸（185.6 mg），二(三叔丁基膦)钯（7.84 mg）氢氧化钠（25.7 mg），抽真空干燥，氮气保护下，加入无水四氢呋喃4 mL，水（经过除氧处理）4 mL，将Schlenk放入油浴升温至100℃；反应4h后，将反应液转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，加无水MgSO

（2）用2mL无水乙腈溶解化合物1（366.0 mg），转移至Schlenk中，N

（3）50ml Schlenk加入(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈（38.6 mg），氮气保护下，加入化合物2（56.5 mg），无水乙醇（6 mL），哌啶（0.02 mL），油浴升温至90℃，反应24h。冷却，析出沉淀，沉淀用乙醇洗涤离心得到化合物3(62.4mg)，产率83%；

（4）N

其表征如下：

1

13

HRMS (APCI) m/z: [M-I]

应用例1

将实施例1制备的荧光探针（I）置于比色管中，分别加入不同比例的四氢呋喃和水的混合溶剂，定容至5mL，终浓度为10μM。图4为荧光探针（I）在不同极性的四氢呋喃-水体系荧光光谱图，激发波长为535 nm，狭缝宽度为3.0 nm。(图4的波长是发射波长,这个图是通过535nm的激发得到的谱图)。从图4可以看出，随着水含量的增加，混合溶剂极性也增大，探针的荧光强度降低了约174倍。图5是探针（I）的荧光强度与溶剂极性的线性关系。从图5可以看出，二者呈现良好的线性关系，线性方程为I =-1.02×10

应用例2

利用实施例1制备的探针进行癌细胞细胞膜成像测定：

将探针分别与正常细胞（HL-7702和RAW264.7）和癌细胞（Hela、HepG 2和MDA-MB-231）共孵育成像。将细胞分别接种到共聚焦小皿中，培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，加入10 μM的探针孵育20 min，弃掉培养基，用PBS洗涤后加入500 μL细胞固定液，在共聚焦显微镜下观察成像，探针采用561 nm激发，收集600-750 nm的光。如图6所示，在相同条件下，正常细胞在探针染色后荧光非常弱，而肿瘤细胞则呈现很强的红色荧光，两者有显著性差异。

应用例3

利用实施例1制备的探针进行癌细胞细胞膜成像时间测定：

将Hela细胞接种到共聚焦小皿中，培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，加入10 μM的探针孵育20 min，弃掉培养基，用PBS洗涤后加入500 μL细胞固定液，在共聚焦显微镜下观察成像时间。如图6所示，2小时时Hela细胞仍然在细胞膜呈现很强的红色荧光，说明探针具有长时间的细胞膜成像能力。

以上证明实施例1所合成的烷氧基噻吩类探针可以用于癌细胞的细胞膜红色荧光成像，而且具有较长时间成像能力，具有较好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。