一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统

技术领域

本发明涉及养殖系统技术领域，特别涉及一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统。

背景技术

微藻亦称浮游植物，是指在水中以浮游生活的体型微小且只能在显微镜下才能观察其形态结构，并能进行光合作用的低等植物总称，包括蓝藻、绿藻、硅藻、金藻、黄藻、甲藻、隐藻和裸藻等八个门的浮游植物种类。微藻富含蛋白、脂类、糖类、矿质元素等多种营养成分，并可合成不饱和脂肪酸(DHA、EPA等)、类胡萝卜素(β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素、玉米黄质等)、色素—蛋白复合体(藻蓝蛋白、藻红蛋白等)、藻多糖、抗氧化物质、色素、活性多肽等生物活性物质。在水产养殖业中，微藻在广泛应用于水产生物饵料、饲料添加、水质调控、病害防治及疫苗研发、贝类养殖育苗、藻相构建及水体净化等多个领域，具有重要的应用价值。

日本对虾是我国重要的对虾养殖品种之一。该虾甲壳较厚，耐干露，适于活体运销，利润较高。然而，在集约化，高密度养殖过程中，由于单位体积内生物量多，会导致鱼虾粪便和饲料残渣沉积，滋生有毒物质及有害微生物，导致水体恶化。有研究表明，使用微生物饲料可提高鱼虾抗病能力并促进生长。本研究通过检测不同微生物饲料饲养条件下，日本对虾肝胰腺中酶活性的变化，初步揭示微生物饲料在日本对虾养殖过程中的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统，以解决上述问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统，包括：

池塘清理模块，用于对池塘清理消毒并完成进水工作；

水生动物投放模块，用于对日本对虾、梭子蟹、硬壳蛤和黑鲷鱼的投放；

微藻投放模块，用于对微藻的投放；

活性检测模块，用于对日本对虾肝胰腺中GST、SOD、CAT以及LZM的活性检测；

检测模块，用于对日本对虾抗菌肽基因的检测。

本发明的进一步设置为：所述微藻的投入量为1升/亩，每20天投放一次。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾肝胰腺中GST、SOD、CAT以及LZM的活性检测时，首先取不同实验组以及对照组日本对虾的肝胰腺样本，称重，放入研磨管中，加入9倍体积的0.86％冷生理盐水，将研磨管放入样品匀质仪中匀浆两次，得到10％组织匀浆，将制备好的10％组织匀浆以2000r/min的速度离心15min，收集上清液。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾肝胰腺中GST的活性检测，包括以下步骤：

收集上清液以测定GST活性，GST活性的检测使用谷胱甘肽—S转移酶试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时412nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中GST活力；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾肝胰腺中SOD的活性检测，包括以下步骤：

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释5倍，至2％组织匀浆浓度，SOD活性的检测使用总超氧化物歧化酶测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时550nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中SOD活力；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾肝胰腺中CAT的活性检测，包括以下步骤：

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释5倍，至2％组织匀浆浓度，CAT活性的检测使用过氧化氢酶测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时405nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中CAT活力；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾肝胰腺中LZM的活性检测，包括以下步骤：

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释2倍，至5％组织匀浆浓度，LZM活性的检测使用溶菌酶测试盒，使用分光光度计测定反应结束时530nm处的样本透光度，按照公式计算组织中LZM含量；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白测定试剂盒，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

本发明的进一步设置为：所述用于对日本对虾抗菌肽基因的检测时，在日本对虾养殖基地进行实验，设置对照组池塘与实验组池塘，对照组池塘的日本对虾正常投喂，实验组投喂添加微藻的饲料，喂养足够时间后，取对照组，实验组池塘中健康日本对虾成体，取肠道组织，提取RNA，反转录合成cDNA，设计引物，后续使用RT-qPCR检测日本对虾肠道内抗菌肽基因表达。

本发明的有益效果是：

1、本发明提出了一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统，微藻营养全面且丰富，是最佳的活体饵料，在水体中不仅是日本对虾的开口饵料，提高日本对虾育苗存活率，而且微藻很多生物活性物质又能提高生长速度及体长、体重等各项性状指标；同时，微藻可以用于水产养殖生态调水、养殖尾水处理，在环境和生态领域具有重要的应用价值；

2、本发明提出了一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统，微藻起到净化水质，增加溶解氧，抑制有害微生物，肥水并提供饵料，构建养殖水体的生态系统。通过有益藻的健康活动来抑制有害藻、甚至有害病原菌、有害藻的爆发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。

图1是本发明提出的一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统的框图示意图。

图2是日本对虾肝胰腺中GST活力测定结果图。

图3是日本对虾肝胰腺中SOD活力测定结果图。

图4是日本对虾肝胰腺中CAT活力测定结果图。

图5是日本对虾肝胰腺中LZM活力测定结果图。

图6-10是微藻饲养条件下日本对虾抗菌肽基因的检测结果图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参见图1-10，本发明提供一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统，包括：

池塘清理模块，用于对池塘清理消毒并完成进水工作；

水生动物投放模块，用于对日本对虾、梭子蟹、硬壳蛤和黑鲷鱼的投放；

微藻投放模块，用于对微藻的投放，需要说明的是，微藻的投入量为1升/亩(微藻的数量为1毫升含1000万+个细胞)，每20天投放一次。在加藻前测定水体中总氮、氨氮、总磷、COD等数值，并在此基础上根据季节的变化以及水体的变化加入不同的藻类肥水与调水；

活性检测模块，用于对日本对虾肝胰腺中GST、SOD、CAT以及LZM的活性检测；

检测模块，用于对日本对虾抗菌肽基因的检测。

微藻、微生物菌剂等饲养条件下日本对虾肝胰腺中SOD、GST、CAT以及LZM活性检测的研究：

组织匀浆的制备

取不同实验组以及对照组日本对虾的肝胰腺样本，称重，放入研磨管中，加入9倍体积的0.86％冷生理盐水(此步骤在冰上进行)，将研磨管放入样品匀质仪中匀浆两次，得到10％组织匀浆，将制备好的10％组织匀浆以2000r/min的速度离心15min，收集上清液。

需要说明的是，对照组为鱼虾贝蟹传统养殖模式，不加藻、菌；

实验组有三个：

第1：加藻(每20天，加40升/40亩微藻)；

第2：加藻和菌(每20天，加40升/40亩微藻，加20升/40亩硅酸盐细菌)；

第3：加硅酸盐细菌(每20天，加20升/40亩硅酸盐细菌)。

日本对虾肝胰腺中GST活力测定

收集上清液以测定GST活性，GST活性的检测使用谷胱甘肽—S转移酶(GSH-ST)试剂盒(比色法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时412nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中GST活力(U/mgprot)；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

日本对虾肝胰腺中SOD活力测定

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释5倍，至2％组织匀浆浓度(最适取样浓度需根据实际情况自行摸索)，SOD活性的检测使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(羟胺法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时550nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中SOD活力(U/mgprot)；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

日本对虾肝胰腺中CAT活力测定

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释5倍，至2％组织匀浆浓度(最适取样浓度需根据实际情况自行摸索)，CAT活性的检测使用过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)(钼酸铵法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时405nm处的样本吸光度，按照公式计算组织中CAT活力(U/mgprot)；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

日本对虾肝胰腺中LZM活力测定

收集上清液，使用0.86％冷生理盐水稀释2倍，至5％组织匀浆浓度(最适取样浓度需根据实际情况自行摸索)，LZM活性的检测使用溶菌酶(LZM)测试盒(带标准)(比浊法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时530nm处的样本透光度，按照公式计算组织中LZM含量(μg/mL)；

其中，样本匀浆蛋白浓度的检测使用总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)(南京建成生物工程研究所)，按照试剂盒步骤操作，使用分光光度计测定反应结束时595nm处测量样本的吸光度。

检测结果

经检测，相较于空白对照组，微生物饲料实验组的各类酶活性，显著高于对照组(图2-5)，说明微生物饲料在日本对虾养殖过程中有明显影响，研究结果可进一步作为日本对虾抗病研究的参考。

微藻饲养条件下日本对虾抗菌肽基因的检测

在日本对虾养殖基地进行实验，设置对照组池塘与实验组池塘，对照组池塘的日本对虾正常投喂，实验组投喂添加微藻的饲料，喂养足够时间后，取对照组，实验组池塘中健康日本对虾成体，取肠道组织，提取RNA，反转录合成cDNA，设计引物，后续使用RT-qPCR检测日本对虾肠道内抗菌肽基因表达。

检测结果

微藻养殖日本对虾的池塘较之对照组池塘，日本对虾SOD3基因的表达量显著上调(图6)，有研究表明，SOD3可影响T细胞迁移，从而使机体更易受到基于T细胞的免疫治疗，起到增强鱼虾抗逆能力的作用，参与日本对虾先天免疫调节的Lyso3、Peri2、A2M3基因也有明显上调(图7，8，9)。此外，ALF2、ALF3、ALF4以及ALF5基因的表达量亦有显著上调(图10)，ALF具有结合和中和脂多糖(LPS)的能力，有着较强的抗菌能力。

以上结果表明，微藻饲养可对日本对虾抗菌肽基因起着正向调控作用，从而对日本对虾的先天免疫起正调控作用。

本研究首先探索“日本对虾+梭子蟹+硬壳蛤+黑鲷鱼+微藻(+菌剂)”的养殖模式，构建适宜于沿海地区多营养层级海水池塘综合养殖模式，研发海水虾蟹类疾病实施生态防控技术，建立相关示范区进行推广应用，促进自营养殖模式高质量发展。

因虾、蟹、鱼、贝在同一空间需要消耗大量的营养物质以及水中的溶解氧，而微藻营养全面且丰富，是最佳的活体饵料，在水体中不仅是虾、蟹、鱼、贝类等养殖动物的开口饵料，提高育苗测存活率，而且微藻很多生物活性物质又能提高生长速度及体长、体重等各项性状指标；同时，微藻可以用于水产养殖生态调水、养殖尾水处理。调水剂作为建立和维持养殖水体藻相的藻种，起到净化水质，增加溶解氧，抑制有害微生物，肥水并提供饵料，构建养殖水体的生态系统。在虾、蟹、鱼、贝的基础上，通过有益藻的健康活动来抑制有害藻、甚至有害病原菌、有害藻的爆发等，是最好的生态调节工程。

开展水质检测，养殖尾水相关指标应达到国家规定排放要求，目前已开展5次池塘水取样并进行检测，水样盐度范围在27.6‰-28.4‰，水质检测结果如下表所示，水质指标优于《池塘养殖尾水排放标准》(DB32/4043-2021)海水受纳水域养殖尾水排放限值一级标准。

池塘水质检测结果。

以上对本发明所提供的一种适合滩涂咸水池塘的多营养层级生态养殖系统进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。