柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记及其应用和检测方法。

背景技术

柑橘木虱Diaphorina citri(Kuwayama)，是一种为害芸香科植物的刺吸式植食性害虫，由于其具有繁殖能力强、世代重叠和生活周期短等生物学特性，导致柑橘木虱易对杀虫剂产生抗药性，更重要的是，作为我国一类农作物病害——柑橘黄龙病的主要自然传播媒介而备受重视。大量杀虫剂的不科学使用，导致柑橘木虱的抗药性迅速发展，暴发成灾的态势明显上升。

甲氰菊酯是一种拟除虫菊酯类杀虫剂，在农业害虫的防控中被广泛应用。由于长期大量使用，导致害虫的抗药性快速发展。而在田间抗性监测过程中，发现柑橘木虱崇左种群的LC

发明内容

本发明的目的之一是针对柑橘木虱对甲氰菊酯敏感和抗性品系分类领域的空白，提供一种柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记，所述分子标记具有核苷酸序列如SEQ IDNO.9和/或SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.11所示的柑橘木虱电压门控钠离子通道基因，如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列编码的氨基酸发生DcVGSC_L925M突变，如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列编码的氨基酸发生DcVGSC_M918T突变，如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列编码的氨基酸发生DcVGSC_M918L突变，野生型柑橘木虱电压门控钠离子通道基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

野生型柑橘木虱电压门控钠离子通道基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供上述的分子标记在柑橘木虱对甲氰菊酯敏感种群和抗性种群分类中的应用。

本发明的再一目的是提供一种扩增上述分子标记的特异性引物对，所述引物对为Dc_VGSC3_F/Dc_VGSC3_R，引物序列如下：

Dc_VGSC3_F：5’-GGCCTTGTTGCTTAGAGT-3’，

Dc_VGSC3_R：5’-GACGTCCTCTTTCACTCAAC-3’。

本发明的最后目的是提供一种柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记的检测方法，先提取待测柑橘木虱的总DNA，以总DNA为模板用前述的特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物Dc_VGSC基因片段，分析PCR扩增产物是否含有上述的分子标记，即可判断取待测柑橘木虱是对甲氰菊酯的敏感种群还是抗性种群。

分析PCR扩增产物是否含有上述的分子标记的具体方法为:

将PCR扩增产物进行测序，与上述的柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记进行序列比对，如果PCR扩增产物的序列与SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的序列相同，说明检测的柑橘木虱属于甲氰菊酯抗性种群。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为12.5μL 2×PrimeSTARMax Premix、浓度为10uM的正、反向引物各1μL、2μLDNA模板，补充ddH

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、35次循环；最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果是：首次确定了柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记，首次在柑橘木虱中发现与菊酯类药剂抗性相关的VGSC基因突变位点L925M、M918T/L，这两个突变位点未在半翅目柑橘害虫中报道过与抗药性相关。本发明建立了快速检测柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的分子标记的方法，操作简单，可同时检测大量样本，可快速有效的检测柑橘木虱田间种群是否存在DcVGSC_L925M突变或DcVGSC_M918T/L突变，可快速有效的评估相应位点在某地理种群中的突变频率，为柑橘木虱对甲氰菊酯的田间抗性提供一种分子检测手段。

附图说明

图1是引物Dc_VGSC3_F/Dc_VGSC3_R的引物位点示意图。

图2是柑橘木虱Dc_VGSC基因目的片段PCR扩增电泳检测结果图。

图3是柑橘木虱对甲氰菊酯抗性的DcVGSC_M918T/L与DcVGSC_L925M突变分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂，均可商购获得。

本发明实施例中主要试剂来源如下：

CTAB十六烷基三甲基溴化铵：(江苏艾康生物医药，中国)

Proteinase K(蛋白酶K)：(QIAGEN公司，德国)

2×PrimeSTARMax premix(Takara公司，日本)

实施例1柑橘木虱对甲氰菊酯敏感性检测

田间种群：选取我国南方各主要柑橘产区：广西(桂林，崇左)、江西赣州和浙江台州共4个地区的柑橘木虱田间种群进行检测，具体地理位置及寄主信息见下表1。每个园区随机采样，采集超1000头成虫用于生物测定，同时采集1000头以上成虫保存于无水乙醇中供后续DNA的提取。对前述4个田间种群成虫进行生物测定，结果如表2所示，4个地区的药剂敏感性水平差异较大，其中崇左和赣州种群对甲氰菊酯表现出高水平抗性。

表1

表2

实施例2田间快速检测柑橘木虱对甲氰菊酯的抗性

根据实施例1的检测情况，对从田间采集的不同地区田间柑橘木虱进行抗性标记检测：

(1)制备PCR扩增模板：将采集的不同地区柑橘木虱成虫(表3)区分雌雄各75头置于1.5ml无核酶离心管中作为样本，每个地区雌雄虫样本分别设置10个重复。提取待测柑橘木虱的总DNA的方法为：1)向装有试虫的2.0mL EP离心管中加入200μL CTAB-Triton DNA抽提液，随后放入4颗直径2mm的研磨钢珠。离心管置于震荡研磨机上以50Hz频率震荡研磨90s(研磨前将放置离心管的配套铁板在液氮中冷却1min，防止钢珠摩擦管壁产热致核酸降解)，研磨完成后，立即将匀浆转入新的2.0mL EP离心管中。2)加入800μL CTAB-Triton DNA抽提液，轻微震荡混匀。3)加入20μLProteinase K，轻摇混匀，然后65℃水浴60min(期间轻柔颠倒2～3次)。4)趁热离心，12,900rpm离心3min。5)吸取上清液700μL置于新2ml离心管中，加入等体积的Tris-酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀(呈乳状)，室温静置5min，12,900rpm离心3min。6)吸取上清液600μL置于新2ml离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，轻柔混匀，12,900rpm离心3min，重复两次。7)吸取上清液置于新1.5ml离心管中，加入1/10体积的NaAc溶液和等体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置2～3min至管中出现白色絮状物，12,900rpm离心1min。8)弃上清，加入1mL 75％乙醇，轻柔颠倒洗涤，室温7,000rpm，离心1min，重复三次后，12,000rpm，1min。9)弃上清，将沉淀干燥至半透明状，加入100μLTE[1mM EDTA,10mM Tris(pH 8.0)]缓冲液，吸打混匀。

(2)PCR扩增：PCR反应体系：12.5μL 2×PrimeSTAR Max Premix、8.5μL无核酸酶水、浓度为10uM的引物对的正、反向引物各1μL、2μL步骤(1)制备的PCR扩增模板，共25μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、35次循环；最后72℃延伸10min。

通过人工查找，在柑橘木虱基因组数据库中找到柑橘木虱电压门控钠离子通道基因DcVGSC1(GenBank KP284178)。野生型柑橘木虱电压门控钠离子通道基因DcVGSC1的基因序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.2)：

MSIASDSVSSEERSLFRPFTRESLAAIDARIAEEQEKQKEFERKRAEGEQEYGRKRKKKEIRYDDEDEDEGPQPDATLEQGVPLPVRLQGSFPAELASTPLEDIDPYYENQKTFVVVSKGKDIFRFSATDALWVLDPFNPIRRVAIYILVHPLFSLFIITTILTNCILMIMPGTPTIESTEVIFTGIYTFESAVKVMARGFILESFTYLRDAWNWLDFIVIALAYVTMGIDLGNLAALRTFRVLRALKTVAIVPGLKTIVGAVIESVKNLRDVIILTMFSLSVFALMGLQIYMGVLTQKCIRRYPIHENGTLIEPEGVLYGNLTDESWNRWNKNASNWFGEENKYPLCGNSSGAGQCEPGYVCLQGFGPNPDYGYTNFDTFAWAFLAAFRLMTQDYWENLYQLVLRAVGPWHIVFFIVIIFLGSFYLVNLILAIVAMSYDELQKKAEEEDAAEEEAIRVAEQNAADRIARKEARQERRDGRAAERAARDEALAHPELHPPPAPEPKSPDFSVHSYELFVGEEKQGEDNREKMSMRSEISQSKHSVNSCSKGRKVSQASLSLPGSPFNLRRSSHQFALRNGRPRFSSGTDRKPLVLSTYLDAQQHLPFADDSNAVTPLSEENGAILVPHYGYHATLGSRQHSYTSHTSRASYTSHADLLPHLGQTKEARLRSRSRNSSDKQCCTRSSRDYVSDTLQDTSYEVDEYKTSKHQDSSYLDNSSQHNTVVDMKDVMVLNEIIEQAAGRQSVTGDHAGMGVSTVYYFPTDPIDDDEDGPTAGEKILAACLQGIDIFCVWDCCVPWLKLQEWISFVVFDPFVELFITLCTVANTLFMALDHHEMDKNMEKFLKSGNLFFSATFAVEAFLKLMAMSPKYYFQVGWNIFDFIIVALSVLELSLEGVQGLSVLRSFRLLRVFKLAKSWPTLNLLISIMGRTIGALGNLTFVLCIIIFIFAVMGMQLFGKNYTDKVSEFPGGEMPRWNFTDFMHSFMIVFRVLCGEWIESMWDCLHVGDVSCIPFFLATVVIGNLVVLNLFLALLLSNFGSSSLSAPTADSDTNKIAEAFNRISRFIDWIKRCVRSFFGAIRNMLRNQIAAQAPINRDMDATRDEILADGIDYDKKDAFEVAIGDGMEFTIHGDMKSNKFRKSKNNCIGNSIGLDHTQDMILDQEYMFRKLDPDCISNKSYGSHKHHPFRQDTHSHKGSVETVIKEKTEDLVAEPEVPEEQNVVEEDVVLIGPDDGEEDAYPSDCCPDKCYVRFPFLAGDDDTPFWQGWANLRLKTFQLIENKYFETAVITMILLSSLALALEDVHLQNRPILQDILYYMDRIFTVIFFIEMLIKFLALGFAKYFTNAWCWLDFVIVMVSLINFIASLLGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRVVVNALVQAIPSIFNVLLVCLIFWLIFAIMGVQLFAGKYFKCVDGNGTTLSHEIIPDKNVCKAENYTWENSPMNFDHVGKAYLCLFQVATFKGWIPIMNDAIDSRELNKQPIRETNIYMYLYFVFFIIFGSFFTLNLFIGVIIDNFNEQKKKAGGSLEMFMTEDQKKYYNAMKKMGSKKPLKAIPRPRWRPQAIVFEVVTDKKFDMVIMLFIGLNMLTMTMDHYQQTELFSSVLDNLNAIFIIIFSSECLLKIFALRYHYFVEPWNLFDFVVVILSILGLVLSDIIEKYFVSPTLLRVVRVAKVGRVLRLVKGAKGIRTLLFALAMSLPALFNICLLLFLVMFIFAIFGMSFFMNVKEKSGIDDVYNFKTFFQSFILLFQMSTSAGWDGVLDGIINEEDCDAPVPEMGNPGNCGNSTVGITFLLSYLVISFLIVINMYIAVILENYSQATEDVQEGLTDDDYDMYYEIWQQFDPEGTQYIRYDQLCDFLDVLEPPLQIHKPNKYKIVSMDIPICKGDMMFCVDILDALTKDFFARKGNPIEETGDLVAEVNTRPDEAGYDPVSSTLWRQREEYCARLIQHAWRKHKQCRAGGTEPGSPGSPDGRDTAVLVESDGFSIKNGHRVVIHSRSPSQTSRSAEV。

反应体系中所用引物对是基于柑橘木虱电压门控钠离子通道基因组DcVGSC1(Gene ID:103513338)设计的，用于检测不同位点变异，共设计了3对引物用于检测不同位点变异，上游引物位于5’UTR区，下游引物位于3’UTR区；以Dc_VGSC3_F/Dc_VGSC3_R为例，其引物位点如图1中所示。3对引物序列如下：

Dc_VGSC410_F：5’-CTTTAGGTGTTGAGAGCGGTG-3’(SEQ ID NO.3)，

Dc_VGSC410_R：5’-ATTGGTTCAGCCAAGTTGACA-3’(SEQ ID NO.4)；

Dc_VGSC3_F：5’-GGCCTTGTTGCTTAGAGT-3’(SEQ ID NO.5)，

Dc_VGSC3_R：5’-GACGTCCTCTTTCACTCAAC-3’(SEQ ID NO.6)；

Dc_VGSC1534_F：5’-CCTAAACTAATTCCATTCTGTT-3’(SEQ ID NO.7)，

Dc_VGSC1534_R：5’-CAAGTCTCCACAAACTTTGCAA-3’(SEQ ID NO.8)。

利用每对引物分别进行扩增，对得到的扩增片段分别进行分析。

3)凝胶电泳：吸取少量PCR反应产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

引物对Dc_VGSC3_F/Dc_VGSC3_R扩增出276bp(DcVGSC1_M918,L925,T929)的条带(图2)，泳道1-18从左至右依次为：崇左♂、崇左♀、文山♂、文山♀、罗甸♂、宁德♂、台州♂、赣州♂、宜宾♂、桂林♂、海口♂、罗甸♀、宁德♀、台州♀、赣州♀、宜宾♀、桂林♀、海口♀。引物对Dc_VGSC410_F/Dc_VGSC410_R扩增出257bp的条带，Dc_VGSC1534_F/Dc_VGSC1534_R扩增出288bp的条带。

4)PCR产物测序及突变分析：将获得的PCR产物用NanoDrop One微量核酸浓度检测仪(ThermoFisher)测浓度，随后将不同种群柑橘木虱的PCR扩增产物等量混合，送至上海凌恩生物公司进行扩增子测序，根据其反馈结果文件分析该位点突变及计算相应突变频率。

本实施例中，通过PCR扩增，可以将目的DNA片段进行富集。扩增之前，将特异Barcode(每个地区对应一个标签Barcode，如表4中所示)插入到每条引物的5’端，则各地区样本的PCR产物可获得特异性的测序接头，可直接将不同种群柑橘木虱目的片段PCR扩增产物进行混池测序并构建混合文库。通过特异性标签筛选区分不同地区的扩增片段，比对基因组序列，统计分析特定位置的突变及突变比例。

采用TruSeq

表3

表4

表5

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