低聚糖在保护软骨中的应用

技术领域

本发明是关于一种低聚糖在制备用于保护软骨和/或促进软骨健康的组合物中的应用，所述低聚糖包括中的一种或多种。

背景技术

软骨组织广泛存在于脊椎动物体内，是生物体维持正常活动不可缺的组织类型，软骨作为脊椎动物重要的组织类型，参与骨骼系统的发生、发展过程。软骨细胞的发育过程受复杂的信号分子网络调控，关键基因的异常使得软骨细胞形成障碍，并与许多先天性及后天性软骨钙化骨疾病的发生相关，比如颅面骨发育畸形，骨性关节炎等，影响全球约10-12％的人口健康。

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)是一种被认为具有软骨保护作用的功效成分，可作为营养补充剂。然而，研究报道硫酸软骨素会带来一些副作用，常见的包括恶心和胃痛，有些情况下还有可能导致皮疹，反胃和脱发。

因此，研发无毒副作用的具有软骨保护功效的防治产品是非常重要的。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有软骨保护功效的防治产品。

本案发明人在研究中通过斑马鱼模型实验发现，一些低聚糖具有保护软骨的功效，具体可表现在促进软骨细胞的增殖、促进软骨细胞代谢平衡和/或抑制软骨细胞的调亡，从而可促进软骨发育、增加软骨密度和/或改善软骨损伤。

斑马鱼在骨骼发育方面与人类极其相似，其骨发育与人类骨生物矿化作用基本一致，存在软骨内骨化过程，发育完整的斑马鱼骨拥有与人类长骨一致的分层结构。此外，斑马鱼与人类在骨骼生长发育的分子机理方面也极为相似。采用转基因软骨绿色荧光斑马鱼，可以在显微镜下直接观察、拍照并定量分析软骨荧光强度。

从而，本发明提供了一种低聚糖在制备用于保护软骨的组合物中的应用，其中，所述低聚糖包括低聚果糖(Fructooligosaccharide，FOS)、低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)、异构化乳糖(Lactulose，LOS)中的一种或多种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述保护软骨包括促进软骨发育、增加软骨密度、保护软骨免受损伤、促进软骨修复和/或改善软骨损伤。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述保护软骨包括促进软骨细胞的增殖、促进软骨细胞代谢平衡和/或抑制软骨细胞的调亡。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述组合物包括食品组合物、饲料组合物或药品组合物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述益生元的应用量为0.3g/天-90g/天。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述低聚糖是与益生菌联合制备用于保护软骨的组合物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述益生菌包括乳双歧杆菌，例如BL-99、BB-12、HN019中的一种或多种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述乳双歧杆菌的应用量为1.0×10

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述组合物为药品组合物。所述药品组合物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括赋型剂、稀释剂、填充剂和/或吸收促进剂。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的低聚糖的应用中，所述组合物为食品组合物。其中，所述食品可以为发酵乳制品、乳酪、含乳饮料、固体饮料或乳粉。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述组合物还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药品组合物，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂和/或吸收促进剂等。对于食品组合物，本发明的乳双歧杆菌可以按照现有技术中含乳双歧杆菌的食品进行生产。所述组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊和/或液体制剂等。

另一方面，本发明还提供了一种具有保护软骨功效的组合物，该组合物包括以下组合中的一种或多种：

益生元异构化乳糖与益生菌，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的一种或多种；

益生元低聚果糖与益生菌，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的一种或多种；

益生元低聚半乳糖与益生菌，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的一种或多种；

益生元异构化乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的两种与益生菌的组合，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的一种或两种；

益生元异构化乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的两种(异构化乳糖+低聚果糖，异构化乳糖+低聚半乳糖，或低聚果糖+低聚半乳糖)与益生菌的组合，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的三种；

益生元异构化乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的三种与益生菌的组合，其中所述益生菌包括乳双歧杆菌BL-99、BB-12、HN019中的一种或两种(BL-99+BB-12，BL-99+HN019，或BB-12+HN019)或三种。

根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中：

所述组合物中包括多种益生元时，多种益生元以任意比例组合，例如，每两种益生元之间以(0.01～100)：1的比例组合。

根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中：

所述组合物中包括益生菌与益生元时，所述组合物中包括益生菌与益生元时，所述益生元与益生菌的用量比为(0.3g-30g)：(1.0×10

根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物中：

所述组合物中包括多种益生菌时，多种菌以任意比例组合，例如，每两种益生菌之间以(0.01～100)：1的比例组合。

综上所述，本发明提供了低聚糖在制备用于保护软骨的组合物中的新应用。本发明通过实验证明低聚糖可促进软骨细胞的增殖、促进软骨细胞代谢平衡和/或抑制软骨细胞的调亡，从而可促进软骨发育、增加软骨密度和/或改善软骨损伤。

附图说明

图1为低聚糖处理后斑马鱼软骨荧光强度典型图。注：图中绿色荧光为斑马鱼软骨。

图2显示低聚糖处理后斑马鱼软骨荧光强度检测结果。与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

1.实验样品与材料

1.1.样品

低聚果糖粉，异构化乳糖粉和低聚半乳糖粉，均用标准稀释水配制成50.0mg/mL母液，现配现用。

乳双歧杆菌，用标准稀释水配制成2.00mg/mL母液，现配现用。

乳双歧杆菌BL-99，由内蒙古伊利实业集团股份有限公司提供。

乳双歧杆菌BB-12、HN019为商业菌株。

阳性对照：硫酸软骨素A钠盐，白色粉末，批号I2003201，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4℃避光储存。用超纯水配制成100mg/mL母液，现配现用。

1.2.实验动物

斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。

转基因软骨绿色荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天(2dpf)的斑马鱼用于受试物软骨保护功效最大检测浓度(MTC)测定及其功效评价。

1.3.斑马鱼剂量与人体剂量换算

根据已公开发表(SCI收录)的化药、天然药物和部分中成药、保健食品数据，通过数学模型处理和拟合，确定斑马鱼与哺乳动物等效剂量换算公式后，目前本公司斑马鱼与人体等效剂量换算公式为：斑马鱼(mg/L)＝[人(g/天)×1000]/6。如斑马鱼一次给药浓度为1000μg/mL，根据上述公式换算为人用剂量，即每日服用量6g。关于保健食品套用斑马鱼与人体等效剂量换算公式(斑马鱼(mg/L)＝[人(g/天)×1000]/6)使用依据及范围说明：利用WHO在《食品中化学物风险评估原则和方法》中提到的健康指导值计算公式(HBGV＝NOAEL/UFs)和不确定系数(UFs)的定义，通过相关文献及环特内部实验数据验证，一般人群不确定系数为10，敏感人群不确定系数为100。

1.4.仪器、耗材与试剂

解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)。

乙酸地塞米松(批号B1828095，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)，二甲基亚砜(DMSO，批号BCCD7238，Sigma，Swizerland)；甲基纤维素(批号079K0054V，Sigma，USA)。

2.检测方法

2.1.实验原理

地塞米松是一种人工合成的糖皮质激素，地塞米松诱导斑马鱼，可破坏斑马鱼软骨细胞的代谢平衡，抑制细胞增殖，引起软骨细胞的死亡或调亡，从而引起软骨损伤。早期采用地塞米松可以缓解关节疼痛及炎症，但是，长期应用地塞米松可破坏软骨细胞的代谢平衡，并可以引起软骨细胞的死亡或凋亡，从而减少软骨细胞数量和导致膝关节软骨组织退变程度进一步加重。

2.2.MTC测定

随机选取2dpf转基因软骨绿色荧光斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)30尾。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予地塞米松建立斑马鱼软骨损伤模型。28℃处理24h后，移除地塞米松，分别水溶给予低聚糖和乳双歧杆菌HN019(浓度见表1)，同时设置模型对照组和正常对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均再次水溶给予地塞米松，各实验组同地塞米松继续处理48h，期间每天换液。处理结束后，测定受试物对模型斑马鱼的MTC。

2.3.软骨保护功效评价

随机选取2dpf转基因软骨绿色荧光斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)30尾。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予地塞米松建立斑马鱼软骨损伤模型。28℃处理24h后，移除地塞米松，分别水溶给予受试物(浓度见表2)，同时设置模型对照组和正常对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均再次水溶给予地塞米松，各实验组同地塞米松继续处理48h，期间每天换液。处理结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析软骨荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价受试物软骨保护功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

3.检测结果

3.1.MTC

在本实验条件下，FOS、LOS和GOS对模型斑马鱼的MTC均为5000μg/mL。详见表1。

表1.益生菌软骨保护功效浓度实验结果(n＝30)

3.2.软骨保护功效评价

在本实验条件下，低聚果糖粉、异构化乳糖和GOS均有软骨保护功效。详见表2、图1和图2。

表2.益生菌软骨保护功效评价实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

低聚果糖(干预浓度为0.75g-30g/天,对应人体剂量)、异构化乳糖(干预浓度为0.75g/天-3g/天，对应人体剂量)和低聚半乳糖(干预浓度为0.75g-30g/天,对应人体剂量)具有促进软骨发育、增加软骨密度、保护软骨的功效。

实施例2、低聚糖与益生菌组合物的软骨保护功效

本实施例中，将低聚糖与不同种类益生菌组合，考察组合物的软骨保护功效。软骨保护功效的评价实验方法同实施例1。

本实施例中的低聚糖与不同种类的益生菌组合的组合物的软骨评价结果见表3。

表3.低聚糖与益生菌组合物的软骨保护功效评价实验结果(n＝10)

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与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

可以看出，低聚糖与不同益生菌组合的组合物，均具有良好的促进软骨发育、增加软骨密度、保护软骨的功效。