一种巴西固氮螺菌、复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物资源利用以及生态农业技术领域，涉及一种巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、复合菌剂及其制备方法和应用；尤其涉及一种促进番茄育苗阶段植株抗逆生长的巴西固氮螺菌、复合菌剂及其制备方法与应用，适用于番茄的育苗阶段。

背景技术

全球番茄随着消费量的增加，种植面积也逐渐增加，中国作为全球番茄种植面积最广的国家，特别是棚室番茄的种植面积与规模日益扩大，已成为很多地区重要农产品之一。而棚室番茄种植常常采用连作的方式，但长期连作引发严重的连作障碍，导致土传病害微生物的积累和土壤盐渍化问题产生。这些会使得番茄产量低下、限制了相关生产。而近年来，随着棚室番茄种植规模扩大，为防止病虫害频发，种植中不得不大量使用农药，严重影响了其品质，更对生态环境造成很大的压力、不符合可持续农业发展趋势。

提高植物营养供给，特别是增加钾和硅酸盐的水平，有助于植物抗旱和耐盐胁迫。而微生物可以通过一系列功能和作用促进逆境胁迫下植物的生长、产量和品质的提高：产生多种植物激素如生长素等促进植物根系发育和建成，增加营养和水分吸收；还可刺激植物合成可溶性糖、脯氨酸以及提高抗氧化酶如SOD等的活性来降低干旱等逆境胁迫；提高光合性能，增强植物生产力；产ACC脱氨酶，抑制植物早衰或过早凋亡；抑制病害的发生和发展；等等。氮、磷和钾是植物生长所需的大量营养元素，微生物可通过解磷解钾和固氮功能和作用来增加供给，特别是对于番茄育苗阶段尤其重要。干旱等逆境对植物出苗和幼苗生长影响最大，育苗阶段接种是对促进植物种子发芽和幼苗生长的重要技术。

目前，国内关于微生物菌剂的相关专利申请大多数是涉及化学物质和微生物联合的菌剂后期施用来对促生防病的，也有少量涉及利用微生物自身的特性在育苗阶段就介入的。例如，名称为“一种防治番茄枯萎病的微生物复合肥料及其制备方法”(申请号为“201810318677.8”)的专利申请阐述了将尿素等化学肥料与微生物及一些微量元素混合来防治番茄枯萎病；名称为“一种番茄育苗基质及其应用方法”(申请号为“201910798120.3”)的专利申请阐述了将酒糟和腐熟的鸡粪按一定比例混合作为育苗基质；名称为“一种优良的番茄育苗基质的制备方法”(申请号为“201810123961.X”)的专利申请阐述了将奶牛粪、蘑菇渣、腐熟微生物菌剂和蚯蚓粪以不同的比例混合，即可得到保肥保水能力强且降低病虫害的优良的番茄育苗基质；名称为“一种荧光假单胞菌菌株、菌剂及其作为防治番茄青枯病的育苗基质的应用”(申请号为“201010109162.0”)的专利申请表明了利用腐熟的食用菌栽培后的菇渣与荧光假单胞菌菌剂直接结合可有效解决番茄青枯病的发生；名称为“一种育苗基质及其制备方法和应用”(申请号为“201110420456.X”)的专利申请阐述了将分别发酵后的棉花秆、牛粪与风化煤、蛭石混合后的育苗基质，所育番茄苗在壮苗指数、根系活力、番茄叶片叶绿素含量、定植后产量及抗病性方面均优于常规育苗基质；等等。

但在促进番茄育苗阶段植株抗逆生长方面，尚无有效的单一菌株的报道。

发明内容

基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；本发明的第二目的在于提供该巴西固氮螺菌在促进番茄育苗阶段植株抗逆生长中的应用；本发明的第三目的在于提供包含有本发明巴西固氮螺菌的复合菌剂，该复合菌剂针对番茄育苗阶段植株后，能够促进番茄幼苗抗逆生长；本发明的第四目的在于提供该复合菌剂的制备方法；本发明的第五目的在于提供该复合菌剂在促进番茄育苗阶段植株抗逆生长中的应用；本发明的第六目的在于提供利用该复合菌剂对番茄育苗时期促进幼苗生长的方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，即：巴西固氮螺菌JN25(Azospirillum brasilense JN25)，该巴西固氮螺菌的菌种保藏编号为CGMCC26716；保藏日期为：2023.2.28；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为：中国北京中国科学院微生物研究所，邮编：100101；分类学命名为：巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)。

发明人通过采集田间番茄幼苗根，以涂布划线技术分离根际的固氮、解磷、解钾、产植物激素、产铁载体和产ACC脱氨酶等植物促生性状的菌株功能；通过分离纯化获得了一株能够促进马铃薯块茎种植切块抗逆生长的菌种，经过种属鉴定，其为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，并对其进行了上述的菌种保藏。

该巴西固氮螺菌JN25(Azospirillum brasilense JN25)具有产植物激素生长素、赤霉素，解磷酸钙-磷(磷矿粉-磷)，解钾(钾矿粉-钾)，自生固氮，产ACC(对2,4-二乙酰基藤黄酚)脱氨酶，产铁载体，产HCN(氢氰酸)或产DAPG(对2,4-二乙酰基藤黄酚)等功能；能够显著促进番茄幼苗根系发育和建成、根系更加发达，加粗茎干，叶片增大、叶绿素增加，增强了对土传病害的抗性，增强了对干旱、病虫害、盐胁迫的抗性，促进生长、显著提高番茄产量和质量。

另一方面，本发明还提供上述巴西固氮螺菌在促进番茄育苗阶段植株抗逆生长中的应用。

再一方面，本发明还提供一种复合菌剂，其中，所述复合菌剂包括A剂、B剂和C剂；

所述A剂包括磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉中的一种或两种以上的组合；

所述B剂包括上述的巴西固氮螺菌；

所述C剂包括海藻多糖和糖蜜。

发明人研究发现，采取本发明的复合菌剂对番茄育苗阶段植株进行接种后，能够显著促进番茄幼苗根系建成、增强对干旱和病害的抗性、促进生长、提高番茄产量和品质。

上述的复合菌剂中，优选地，A剂、B剂和C剂的重量比为(100～200)g：(5～25)g：(100～300)g；所述B剂中，巴西固氮螺菌的有效活菌数浓度为10

上述的复合菌剂中，优选地，所述A剂由磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉组成；

其中，所述磷矿粉、所述钾矿粉、所述硅酸铁矿粉和所述秸秆粉的重量比为(40～60)：(40～50)：(1～5)：(0.01～0.05)。

上述的复合菌剂中，优选地，所述钾矿粉、所述硅酸铁矿粉和所述秸秆粉的重量比为50∶40∶1∶0.03。

本发明的复合菌剂A剂中，磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉等均为市售获得，按照特定比例混合，能够起到增加营养，提高发芽期的营养供给；所述秸秆粉由玉米等作物的废弃植株粉碎而来、粒度为0.05～0.2mm，其能够与巴西固氮螺菌所产多糖及其它物料一起形成透气良好的膜，复合前应对秸秆粉以高温蒸或氨水熏蒸等方式进行灭菌处理。

上述的复合菌剂中，优选地，所述B剂包括液态菌剂或固态粉状菌剂。

上述的复合菌剂中，优选地，所述液态菌剂包括保护剂和巴西固氮螺菌；所述巴西固氮螺菌在液态菌剂中的有效活菌数浓度为10

上述的复合菌剂中，优选地，所述保护剂包括甘油和/或pH为7.2的K

上述的复合菌剂中，优选地，所述固态粉状菌剂包括巴西固氮螺菌和维持菌种存活的添加剂(为本领域常规添加剂)，所述巴西固氮螺菌在固态粉状菌剂中的有效活菌数浓度为10

上述的复合菌剂中，优选地，所述C剂中，所述海藻多糖与所述糖蜜等质量混合。

本发明的复合菌剂C剂中，海藻多糖和糖蜜可以用作黏着剂，同时糖蜜中含有大量碳源及维生素等大量营养物质。

再一方面，本发明还提供一种复合菌剂的制备方法，其包括：

以修改的R2A培养基对上述的巴西固氮螺菌进行菌种活化、摇瓶培养和发酵罐放大培养，离心收集细胞；冷冻干燥并加入添加剂制成固态粉状菌剂，或直接添加液态保护剂(例如：甘油、缓冲液等)制备成液态菌剂，即制备得到上述的B剂；

其中，所述修改的R2A培养基的配方为：葡萄糖1.3g，细菌学蛋白胨1.3g，酸水解酪素1.3g，酵母提取粉1.3g，K

所述添加剂为维持菌种存活的添加剂；

按照上述A剂和C剂的配方，分别制备获得A剂和C剂；任选地，

将A剂、B剂和C剂独立包装。

本发明的复合菌剂中，A剂、B剂、C剂能够分别独立包装，使用时按照比例加水混合调配，此种独立包装更有利于保证微生物生存、延长保存时间，保证包衣功效。此外，本发明的复合菌剂的物料组分和配比虽特别针对番茄育苗阶段出苗具有突出效果，但也可以扩展到针对其他农作物的应用中。

上述的制备方法中，在制备A剂过程中，针对秸秆粉需要进行高温蒸或氨水熏蒸灭菌，后与其他矿物粉按比例混合。

上述的制备方法中，优选地，所述复合菌剂在使用时还包括以下制备步骤：

将B剂加入到C剂中，再加入无菌水(经过过滤除菌或高温杀菌的无活菌水)搅拌均匀，获得第一混合溶液；

然后将A剂加入到第一混合溶液中混合均匀制备得到液态复合菌剂。

再一方面，本发明还提供上述复合菌剂在促进番茄育苗阶段植株抗逆生长中的应用。

再一方面，本发明还提供一种番茄育苗阶段植株菌剂接种种植方法，其包括：

将上述的B剂与C剂以无菌水搅拌均匀，获得第一混合溶液；然后将A剂加入到第一混合溶液中，获得待用的复合菌剂液态溶液；

其中，所述复合菌剂液态溶液中，所述A剂与所述无菌水的用量比为(200～400)g：(4～6)L；所述巴西固氮螺菌在所述复合菌剂液态溶液中的有效活菌数浓度为10

将复合菌剂液态溶液均匀喷洒于番茄育苗钵内，每隔10天接种一次；

任选地，每天早上使用等体积清水喷灌；

其中，番茄育苗阶段植株与所述复合菌剂液态溶液用量比为(50～100)g：(1～5)L。

上述的种植方法中，优选地，所述A剂与所述无菌水的用量比为200g：5L。

上述的种植方法中，优选地，所述番茄育苗阶段植株种子与所述复合菌剂液态溶液用量比为80g：4L。

上述的种植方法中，优选地，每次接种复合菌剂8L、保证菌量达标。

本发明的有益效果：

本发明的巴西固氮螺菌能够促进番茄育苗阶段幼苗植株生长；其制备的复合菌剂接种于番茄育苗阶段幼苗植株根系，可显著促进番茄幼苗根系发育和建成、根系更加发达，加粗茎干，叶片增大、叶绿素增加，增强了对土传病害的抗性，增强了对干旱和盐胁迫的抗性，显著提高番茄产量和质量。

附图说明

图1为本发明实施例5中采用不同处理后的番茄幼苗(图1A中的从左至右依次为接种A剂、A剂+B剂和复合菌剂20天时的幼苗；图1B和图1C中，从左至右依次为接种复合菌剂与A剂+B剂35天时的幼苗及其根系)。

图2为本发明中复合菌剂(图2中的A为A剂干粉混合；图2中的B为含有本发明巴西固氮螺菌的液态B剂；图2中的C为C剂液态混合剂)。

用于专利程序的培养物保藏：

本发明的巴西固氮螺菌JN25(Azospirillum brasilense JN25)：

保藏日期：2023.2.28

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：中国北京中国科学院微生物研究所，邮编：100101；

保藏编号：CGMCC 26716

分类命名：巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

本发明以下实施例中的配方组成为：

以下各实施例中所用到的培养基配方：

1、修改的R2A培养基：葡萄糖1.3～1.5g，细菌学蛋白胨1.3～1.5g，酸水解酪素1.3～1.5g，酵母提取粉1.3～1.5g，K

2、固氮培养基：KH

3、无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH

4、有机磷培养基：葡萄糖10g，(NH

5、解钾培养基：sucrose 5.0g，NH

6、LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.4。

7、DF培养基：KH

8、ADF培养基：将DF培养基中的(NH

实施例1：菌种筛选分离与鉴定

采集田间番茄幼苗根系，以涂布划线技术分离根际的固氮、解磷、解钾、产植物激素、产铁载体和产ACC脱氨酶等植物促生性状的菌株功能，以固氮、解磷、解钾等培养基进行植物促生能力的定性或定量测定，筛选获得了表1所示的5种菌。

表1：

根据表1的实验结果，其中菌株编号为JN25的菌具有多种促生能力、较适应北方地区的气候或地质条件(温差大和次生盐渍化等)，因此将其作为筛选获得的优良菌株。

通过分离纯化得到的菌株基因组DNA为模板，以27F和1492R为引物，PCR扩增菌株的16S rRNA基因，测序扩增产物，所得序列通过NCBI在线进行分类(16SrRNA基因序列相似度大于97％的初步确定为同种)，结果如表2所示。

表2：

由表2结果表明，筛选获得的优良菌株JN25的16S rRNA基因序列与模式种巴西固氮螺菌的相似度达100％。

实施例2：菌活化、培养和收集

吸取甘油保菌液(实施例1的巴西固氮螺菌JN25)100μL涂布于修改的R2A培养基上，置于25℃下培养，挑取具有典型菌落特征、生长迅速的单菌落置修改的R2A相应液体培养基、置于25℃下培养；培养至对数期中后期时以8000g离心力离心，以K

实施例3：非生物组分的优化

复合菌剂液态溶液的制备：

步骤一，取5g的实施例2中的B剂加入到C剂中(C剂由海藻多糖和糖蜜等质量组成，其占复合菌剂液态溶液的质量浓度如下表3所示)，再加入5L的无菌水搅拌均匀，获得第一混合溶液；然后将200g的A剂加入到第一混合溶液中，获得待用的复合菌剂液态溶液；

其中，A剂是由磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉组成；所述巴西固氮螺菌在复合菌剂液态溶液中的有效活菌数浓度为10

将配制的复合菌剂液态溶液均匀喷洒于番茄育苗钵内，每隔10天接种一次；除此之外，每天早上使用等体积清水喷灌；

其中，所述番茄种子与所述复合菌剂液态溶液用量比为80g：4L。

以pH＝7.0模拟次生盐渍化胁迫下番茄育苗，在单因素研究基础之上，以对A剂各组分含量(如下表3所示)、C剂的浓度、番茄幼苗出苗率以及35天时的幼苗状态来综合选择优化非生物包衣组分配比，结果见表3。

表3：

注：非生物组分配比：

A剂各原料质量比表示为：磷矿粉：钾矿粉：硅酸铁矿粉：秸秆粉。

C剂质量浓度表示：例如0.40％(约20g)，表示C剂中海藻多糖和糖蜜的质量浓度均为0.20％。

由表3可以看出：组合1在包衣效果、促进生长方面的综合效果表现优异。

实施例4：有效菌数比例优化确定

以pH＝7.0模拟次生盐渍化胁迫下番茄育苗，固定A剂用量：磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉的重量比为50∶40∶1∶0.03，以对本发明巴西固氮螺菌JN25的总活菌数量、番茄幼苗出苗率和30天时的壮苗指数来综合选择优化有效菌数比例配比，结果见表4。

表4：

注：

A剂：磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉的重量比为50∶40∶1∶0.03；

B剂：巴西固氮螺菌在B剂中的有效活菌数浓度为10

C剂：海藻多糖和糖蜜在复合菌剂液态溶液中的质量浓度：0.4％；

复合菌剂液态溶液中的有效活菌数浓度范围(CFU/mL)：加入B剂时菌的量维持在10

由表4可以看出：组合1在包衣效果、促进生长方面的综合效果表现优异。

实施例5：微生物菌剂对次生盐渍化胁迫下番茄育苗阶段的对比实验

复合菌剂液态溶液的制备：

取10g的实施例2中的B剂加入到100g的C剂中(C剂由海藻多糖和糖蜜等质量组成)，再加入5L的无菌水搅拌均匀，获得第一混合溶液；然后将200g的A剂加入到第一混合溶液中，获得待用的复合菌剂液态溶液；

其中，A剂是由磷矿粉、钾矿粉、硅酸铁矿粉和秸秆粉组成；所述巴西固氮螺菌在复合菌剂液态溶液中的有效活菌数浓度为10

接种、育苗：将配制的复合菌剂液态溶液均匀喷洒于番茄育苗钵内，每隔10天接种一次；除此之外，每天早上使用等体积清水喷灌；

其中，所述番茄种子与所述复合菌剂液态溶液用量比为80g：4L。

以pH＝7.0模拟次生盐渍化胁迫下番茄育苗，测定番茄幼苗生长指标，结果见表5和图1所示。

表5：

注：

JN25：本实施例复合菌剂液态溶液；

C：仅将菌株JN25替换为Azospirillum brasilense(ATCC 49958)菌株，其它操作与JN25组保持一致；

CK：不经过菌剂处理的对照组。

由表5实验数据可以看出：本发明保藏的优良菌株巴西固氮螺菌JN25制备的复合菌剂对于对马铃薯生长发育的促进能力要优于同属保藏中心保藏的巴西固氮螺菌。

由图1可以看出：经过本实施例复合菌剂喷施处理后的番茄幼苗相比未喷施处理的长势好，茎干粗壮，并且根系体积明显较大。