一种敲除烟草NtLNP1基因获得叶形改变且低烟碱含量烟草的方法及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种敲除烟草NtLNP1基因获得叶形改变且低烟碱含量烟草的方法及应用。

背景技术

近年来，有关烟碱合成、转运及转化的一些重要基因已被陆续克隆，对烟碱合成代谢机理研究和烟草遗传育种工作产生了重要推动作用。从20世纪30年代开始，在1969年发现烟碱水平是受两个不连锁基因位点控制，在1994后这两个基因位点被称为Nic1和Nic2，随后大量研究证明了这两个位点控制烟碱生物合成的相关基因表达。有关烟碱吡咯烷环部分和吡啶环部分缩合反应的研究表明，NADPH依赖性还原酶的PIP家族成员类异黄酮还原酶基因A622及其同源基因参与了这一过程，小檗碱桥接酶家族成员BBL基因也参与了这一反应。烟碱合成受到多种因子调控，已知参与烟碱代谢调控的植物激素主要有茉莉酸、生长素及乙烯，其中生长素和乙烯是烟碱合成的负调控因子，目前研究主要集中在茉莉酸信号途径调控。烟草的茉莉酸途径调控因子COI1和JAZ蛋白都已被证明是烟碱合成调控因子，目前还鉴定了一些调控烟碱合成的转录因子，如ERF转录因子家族成员JAP1、ERF32及ORC1的同源基因等，bHLH转录因子家族成员bHLH1/2和MYC等，同时这些转录因子还可以通过彼此间的相互调控影响烟碱代谢过程。

尽管烟草的烟碱代谢途径已基本清楚，且大部分代谢步骤都有一些功能基因得到分离鉴定，但是这些功能基因在烟草中的同源基因远未得到完全发掘，特别是普通烟草为多倍体植物，每个基因都有大约5个同源基因，因此，烟碱代谢功能基因的研究还有大量工作需要开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种敲除烟草NtLNP1基因获得叶形改变且低烟碱含量烟草的方法及应用，其为研究烟草烟碱代谢基因功能及栽培烟草品种定向改良提供了种质资源。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草烟碱合成代谢及叶形调控相关的基因，所述烟草烟碱代谢及叶形调控相关的基因为NtLNP1基因，其序列为SEQ ID No.1。

优选地，对NtLNP1基因的序列进行翻译后，其所编码蛋白序列为SEQ ID No.2。

一种敲除烟草NtLNP1基因获得叶形改变且低烟碱含量烟草的方法，所述敲除是通过CRISPR/Cas9系统敲除烟草NtLNP1基因，所述方法包括以下步骤：

(1)sgRNA引导序列的设计，sgRNA表达载体的构建；

(2)经遗传转化获得T0代编辑素材；

(3)T0代植株经自交纯合获得纯合编辑素材；

(4)对纯合无标签素材进行种植，观察其性状。

优选地，步骤(1)中，CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA序列为ATATCCATCCATTCAAGCGATGG，所述sgRNA序列采用的引物序列为：

上游引物sgRNA-F：GATTGATATCCATCCATTCAAGCGA；

下游引物sgRNA-R：AAACCTCGCTTGAATGGATGGATAT。

优选地，步骤(1)具体为：

设计sgRNA引导序列，上游引物sgRNA-F和下游引物sgRNA-R退火形成双链，限制性内切酶BsaI-HF酶切CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9；将退火形成的双链产物与经酶切好的载体骨架用T4连接酶进行连接；连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，检测获得阳性克隆并提取重组质粒，获得CRISPR-Cas9表达载体。

优选地，步骤(2)具体为：

将携带CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体的农杆菌LBA4404菌液浸泡侵染烟草叶盘，并获得T0代植株，经靶点编辑检测，获得NtLNP1基因发生编辑的植株，收种得到T0代种子。

优选地，步骤(3)具体为：

将T0代种子进行自交纯合扩繁种植，经靶点编辑检测，获得NtLNP1基因发生纯合编辑的植株，收种得到T1代种子。

一种烟草烟碱合成代谢及叶形调控相关的基因在创制叶形改变且低烟碱含量烟草新品种中的应用。

一种敲除烟草NtLNP1基因获得叶形改变且低烟碱含量烟草的方法在创制叶形改变且低烟碱含量烟草新品种中的应用。

优选地，敲除烟草NtLNP1基因创制的烟草新品种植株的腰叶长显著短于对照植株，而腰叶宽宽于对照植株，叶形由长椭圆形变成椭圆形，叶形短而宽，腰叶长宽比小于对照植株；同时，NtLNP1基因敲除的新品种植株打顶后7天的叶片烟碱含量低于对照植株。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtLNP1基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经编辑素材创制和分子检测鉴定后获得了NtLNP1基因敲除的红花大金元编辑植株。

本发明提供的烟草烟碱代谢相关基因NtLNP1，NtLNP1基因敲除编辑植株叶形为椭圆形，与对照叶形(长椭圆形)相比发生了明显改变。

本发明提供的烟草烟碱代谢相关基因NtLNP1，通过气相色谱-质谱联用检测发现，NtLNP1基因敲除编辑植株现蕾期的叶片烟碱含量显著低于对照植株。

综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtLNP1基因获得了烟碱含量降低且叶形发生改变的编辑素材，这为烟草烟碱代谢基因功能研究及烟碱含量可调控的烟草新品种定向改良提供遗传材料和理论依据。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1为本发明的编辑植株与对照(未编辑)主要农艺性状比较。

图2为本发明的编辑植株与对照(未编辑)叶形比较。

图3为本发明编辑植株与对照(未编辑)上调差异基因KEGG注释。

图4为本发明编辑植株与对照(未编辑)下调差异基因KEGG注释。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1NtLNP1基因的获得

以栽培种烟草红花大金元整株为实验材料，利用RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA，反转录为cDNA备用：

按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。

1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：

Total RNA 1μg；

Oligo(dT)(10μM) 1.5μL；

ddH

将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：

上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。

通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

F：5’-ATGACACTAAGCAAGTACTTTTAC-3’(SEQ ID No.3)；

R：5’-TCAAAGACTTTGATAGAGTTCC-3’(SEQ ID No.4)。

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：

扩增体系(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2min，共30个循环；72℃10min；25℃Hold。

对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草烟碱代谢相关的基因NtLNP1序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括1263个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括420个氨基酸残基，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。

实施例2表达载体的构建

利用实施例1中所获得烟碱代谢相关的基因NtLNP1，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体。

(1)NtLNP1基因的sgRNA序列的设计和合成：

利用在线软件CRISPR-P 2.0(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计sgRNA引导序列，选择分值较高且位于NtLNP1基因序列合适位置的引导序列。本申请选择的sgRNA序列为：ATATCCATCCATTCAAGCGATGG(SEQ ID No.5)。

(2)设计sgRNA序列的正反引物并交由设计公司合成：上游引物sgRNA-F：GATTGATATCCATCCATTCAAGCGA(SEQ ID No.6)和下游引物sgRNA-R：AAACCTCGCTTGAATGGATGGATAT(SEQ ID No.7)；

(3)引物退火：将合成的靶序列引物(上游引物和下游引物)用灭菌ddH

PCR仪退火程序为：95℃2min，-0.1℃/8s，退火至25℃，退火产物加入90μL无菌水稀释成10ng/μL。

(4)酶切与连接

a.用限制性内切酶BsaI-HF酶切CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9(由西南大学提供)。

酶切体系(50μL)：

37℃过夜酶切，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切割目的片段条带，用胶回收试剂盒回收骨架片段。

b.连接

将退火形成的双链产物与经酶切好的载体骨架进行连接。

连接体系(10μL)：

连接条件为：16℃连接2小时。

(5)转化大肠杆菌：

a.从-80℃取出Trans-T1感受态细胞置于冰上冻融，分成50μL/份；

b.待感受态细胞融化后，将10μL连接产物加入感受态中，轻轻混匀，冰浴10min；

c.冰浴后，置于42℃水浴锅中热激90s，迅速将感受态放回冰上静置2min。

d.将60μL转化产物均匀涂布于含有16mg/L卡那霉素LB固体培养基中，于37℃细菌培养箱中培养12小时。

(6)阳性克隆筛选：

a.待平板长出单克隆，挑取大肠杆菌单克隆到含有50mg/L的卡那霉素LB液体培养基中，于37℃摇床过夜摇混；

b.取部分菌液进行菌液PCR，经核酸电泳检测是否为阳性克隆；

c.将初步检测为阳性克隆的菌液余下部分提取大肠杆菌质粒。送质粒至诺禾致源公司进行测序，确认阳性克隆的正确性。

实施例3T0代植株的获得及检测

(1)转化农杆菌

利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，获得烟草烟碱代谢相关的基因NtLNP1发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。

将烟草种子表面消毒后点种至MS培养基上，待长到4片子叶(15-20d)，移入含MS固体培养基的培养瓶中，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d条件继续培养35-40d，备用。

将正确序列的质粒转化农杆菌，具体步骤如下：

①取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。

②待感受态刚刚解冻时，加入CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体质粒的2μL，混匀，置于冰上。

③将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。

④培养基在8,000rpm离心，弃上清，再用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。

(2)侵染愈伤组织

①在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(OD

②利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。

③将叶盘置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA的MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。

④进行继代培养，放置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+250mg/LCb+50mg/L Kan的MS固体培养基上。

培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养培养基，更换3-4次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养20-30d，再生移栽至花盆后进行培养，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，检测引物为：上游引物NtLNP1-F：TGGCATCACGATCGTATCCAG(SEQ ID No.8)和下游引物NtLNP1-R：GCGTTGTTTCTTGGTGGAACTT(SEQ ID No.9)。

实施例4纯合编辑素材的获得

T0代种子按23倍进行自交纯合扩繁，待植株长到5-6片叶时，单株的叶片取样，送华大基因进行分子检测，检测引物为：上游引物NtLNP1-F：TGGCATCACGATCGTATCCAG(SEQ IDNo.8)和下游引物NtLNP1-R：GCGTTGTTTCTTGGTGGAACTT(SEQ ID No.9)，确定获得NtLNP1基因发生纯合编辑的植株，之后进行收种获得NtLNP1基因纯合编辑的T1代种子。

实施例5素材种植及性状调查

利用实施例4中分子检测确定为NtLNP1基因纯合敲除的植株种子以盆栽方式进行扩繁种植，种植60株，盛花期打顶，打顶后7天参考《YCT 142-2010烟草农艺性状调查测量方法》，测定分析株高、腰叶长、腰叶宽、茎围、节距等性状指标。

现在打顶后7天的烟株，采集10株烟株的株高、腰叶长、腰叶宽、茎围、有效叶数、节距等指标数据，并进行统计分析。

结果表明，NtLNP1基因纯合敲除的植株的株高、叶数、茎围、节距等与对照红花大金元有明显差异，腰叶长显著短于对照，而腰叶宽极显著宽于对照，还有一个明显特征是叶形改变，由长椭圆形变成椭圆形，具有短而宽的特征，腰叶长宽比为2.07(对照2.40)。对照和NtLNP1基因纯合编辑烟草植株的主要性状对比如图1所示，叶形对比如图2所示。

实施例6GC-MS检测

利用实施例5中种植的编辑植株，随后以GC-MS进行NtLNP1基因纯合敲除素材的打顶后7天叶片的烟碱含量的检测试验。

选择打顶后7天的烟株，采集5株对照(未编辑)烟草植株样本，采集同一叶位的叶片；选择打顶后7天的烟株，采集5株NtLNP1基因纯合编辑的烟草植株样本；叶片去主筋，锡箔纸包裹液氮保存运输，实验室超低温(-70℃)保存，冻干磨粉过筛。

称取0.2g样品于15mL离心管，精确至0.1mg，加入2.0mL5％氢氧化钠溶液，再分别加入0.05mL内标溶液A(二甲基喹啉溶液，甲醇配制，二氯甲烷稀释到1.0mg/mL)和内标溶液B(2,2’-联吡啶-d2溶液，甲醇配制，二氯甲烷稀释到0.5mg/mL)，振荡混匀后，静置20min，然后加入10.0mL萃取溶液(二氯甲烷和甲醇按照体积比4:1混匀)，加盖密封后至于涡旋振荡器中，以2000r/min的速度振荡提取40min，静置1h后，离心8min，取下层有机相转移到色谱瓶中，上GC-MS进行分析。

气相色谱参考条件为：色谱柱：DB-35MS或等同柱效毛细管色谱柱，规格为：30mm(长度)×0.25mm(内径)×0.25m(膜厚)；进样口温度：250℃；柱流量：1.0mL/min；烟碱进样体积：1.0L，分流进样，分流比为40:1；其它生物碱进样体积：2.0L，分流进样，分流比为10:1；升温程序：初始温度100℃，保持3min；以8℃/min的速率上升至260℃，保持10min。

质谱参考条件：传输线温度：280℃；电离方式：电子轰击源(EI)；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；溶剂延迟：8min；测定方式：选择离子监测方式(SIM)扫描。

对照(未编辑)及NtLNP1基因纯合编辑烟草植株打顶后7天叶片烟碱含量比较(结果如表1所示)。

结果表明：通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测发现，NtLNP1基因敲除编辑植株打顶后7天的叶片烟碱含量显著低于对照植株。这为烟草烟碱代谢及叶形调控基因功能研究及烟草新品种培育研究提供遗传材料和理论依据。

表1为本发明的编辑植株与对照(未编辑)打顶后7天新鲜烟叶生物碱含量(μg/g)

实施例7转录组分析

采集打顶后7天的10-13叶位新鲜烟叶，液氮速冻，送测序公司进行RNA提取、cDNA建库和测序。测序完成后，需要对数据进行过滤，主要是去除含有接头、重复及测序质量较低的Reads后，获得clean reads。高质量的Clean Reads是进行下游分析的基础。利用TopHat2将Clean Reads与栽培烟草参考基因组(https://solgenomics.net/)进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。TopHat2是以比对软件Bowtie2为基础，将转录组测序Reads比对到基因上，通过分析比对结果识别外显子之间的剪接点。

采用clusterProfile软件对差异基因集进行GO功能富集分析。GO(GeneOntology)是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程(biological process)和细胞组成(cellular component)分子功能(Molecular Function)三个部分。GO功能富集以padj小于0.05作为为显著性富集的阈值。从GO富集分析结果中，选取最显著的30个Term绘制柱状图进行展示，若不足30个，则绘制所有Term。

打顶后7天的中部叶转录组测序结果表明，NtLNP1基因纯合编辑烟草植株与对照相比，共筛选获得3319个差异表达基因(DEGs)，其中上调基因2516个，下调基因803个。分别对上调和下调的DEGs进行GO和KEGG功能富集分析。GO富集分析中，差异基因显著富集在52个GO Term上，其中“cell periphery”、“cell wall”和“external encapsulatingstructure”在上调DEGs中富集程度最高，而“nucleosome”、“protein-DNA complex”和“DNApackaging complex”在下调DEGs中富集程度最高。KEGG分析中，“Plant-pathogeninteraction”在上调基因中显著被富集，“Cutin,suberine and wax biosynthesis”、“MAPK signaling pathway-plant”、“Nitrogen metabolism”在下调基因中显著被富集。DEGs的富集分析表明，NtLNP1可能通过降低角质、木栓素和腊的生物合成、减弱MAPK级联反应和降低氮素代谢的方式来减少烟碱合成量(如图3、图4所示)。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。