一种荧光成像方法和系统

技术领域

本发明涉及荧光分析领域，具体涉及一种荧光成像方法和系统。

背景技术

免疫印迹WesternBlot分析一般都是基于荧光成像，荧光物质(如荧光染料)激发和检测波长都位于可见光谱内，在此波长范围内，化学高分子物质，膜，胶，微孔塑料板等也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，即使使用高OD值(截止深度)的滤镜，仍有少部分背景荧光透过滤镜，从而探测膜上蛋白或者核酸的灵敏度受到了极大的限制。

发明内容

本发明主要提供一种荧光成像方法和系统，旨在提高检测的灵敏度。

根据第一方面，一种实施例中提供一种荧光成像系统，包括：

载物台，用于承载样品；所述样品具有多种荧光物质，所述荧光物质用于标记样品中的目标成分；

光源，用于激发所述样品中的各个荧光物质发出发射光；

成像装置，用于检测样品的荧光物质发出的所述发射光的强度；

滤光装置，用于对不同波长的所述发射光进行滤光；

控制装置，用于：

确定当前的工作模式，所述工作模式至少包括两种：时间分辨模式和常规模式；

在当前工作模式为时间分辨模式时，控制所述光源多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制所述成像装置按不同的曝光参数对所述发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，所述曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度；

在当前工作模式为常规模式时，控制所述光源激发样品中的各个荧光物质发出发射光，通过所述滤光装置对所述发射光进行滤光，控制所述成像装置对滤光后的发射光进行检测得到单种荧光物质对应的荧光强度。

一实施例提供的所述系统中，所述成像装置包括相机和斩波器；所述相机用于对所述发射光进行成像，从而得到所述发射光的光强；所述斩波器用于控制发射光光路的通断，通过发射光光路的通断控制来设置曝光参数；所述系统还包括限位装置，所述限位装置用于在当前工作模式为常规模式时，对所述斩波器进行限位，使所述发射光不受斩波器的遮挡从而进入到相机。

一实施例提供的所述系统中，所述控制装置确定当前的工作模式，包括：

所述系统还包括人机交互装置；通过所述人机交互装置接收的工作模式指令来确定当前的工作模式。

一实施例提供的所述系统中，所述工作模式还包括混合模式；所述控制装置还用于：

在当前工作模式为混合模式时，控制所述光源持续激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述滤光装置对所述发射光进行滤光，控制所述成像装置对滤光后的发射光进行检测得到样品中各个非时间分辨荧光物质对应的荧光强度；

控制所述光源多次激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光时，控制所述成像装置按不同的曝光参数对所述发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，所述曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品图像中每种时间分辨荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。

根据第二方面，一种实施例中提供一种荧光成像系统，包括：

载物台，用于承载样品；所述样品具有多种荧光物质，所述荧光物质用于标记样品中的目标成分；

光源，用于激发所述样品中的各个荧光物质发出发射光；

成像装置，用于检测样品的荧光物质发出的所述发射光的强度；

控制装置，用于：

控制所述光源多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制所述成像装置按不同的曝光参数对所述发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，所述曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。

一实施例提供的所述系统中，所述控制装置对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度，包括：

根据所述样品具有的荧光物质的荧光强度衰减公式、不同曝光参数以及所述不同曝光参数对应的实际总荧光强度，确定所述样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。

一实施例提供的所述系统中，所述控制装置还用于将荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度代入到预设的荧光强度与浓度的曲线中，得到该荧光物质标记的目标成分的浓度。

一实施例提供的所述系统中，所述成像装置包括相机和斩波器；所述斩波器用于控制发射光光路的通断，通过发射光光路的通断控制来设置曝光参数；所述控制装置控制所述光源多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制所述成像装置按不同的曝光参数对所述发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度，包括：

依次获取不同的曝光参数对应的实际总荧光强度，其中，获取当前的曝光参数对应的实际总荧光强度包括：控制所述相机持续处于曝光状态，控制所述光源多次开启和关闭，所述光源开启期间激发样品中的各个荧光物质发出发射光，在所述光源关闭期间通过斩波器来设置当前的曝光参数；在所述光源开启和关闭的周期数达到预设阈值时，控制所述相机停止曝光从而得到当前曝光参数对应的实际总荧光强度。

一实施例提供的所述系统中，所述成像装置包括相机和斩波器；所述系统还包括光锥和扩束透镜组；所述光源位于所述载物台的下方，所述光锥、斩波器、扩束透镜组和相机依次设置在所述发射光的光路上；所述光锥用于聚合各个发射光，所述扩束透镜组用于发散各个发射光。

根据第三方面，一种实施例中提供一种荧光成像方法，包括：

确定当前的工作模式，所述工作模式至少包括两种：时间分辨模式和常规模式；

在当前工作模式为时间分辨模式时，多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，按不同的曝光参数对所述发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，所述曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度；

在当前工作模式为常规模式时，激发样品中的各个荧光物质发出发射光，对所述发射光进行滤光，对滤光后的发射光进行检测得到单种荧光物质对应的荧光强度。

依据上述实施例的荧光成像方法和系统，通过控制光源多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制成像装置按不同的曝光参数对发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。可见，由于不采用滤光盘滤光的方式，检测的灵敏度高。

附图说明

图1为本发明提供的荧光成像系统一实施例的结构框图；

图2为本发明提供的荧光成像系统一实施例的光路图；

图3为本发明提供的荧光成像系统另一实施例的光路图；

图4为时间分辨荧光物质的荧光成像方法一实施例的流程图；

图5为常规模式下的荧光成像方法一实施例的流程图；

图6为图4中步骤2一实施例的流程图；

图7为光源与斩波器联动的进行开关控制的控制时序示意图；

图8为图6中步骤21一实施例的流程图；

图9为图8中步骤211一实施例的流程图；

图10为两种荧光物质的荧光强度衰减曲线示意图；

图11为四种不同曝光参数在荧光强度衰减曲线中的位置的示意图；

图12为斩波器上固定位的示意图；

图13为本发明提供的荧光成像方法一实施例的流程图；

图14为混合模式下的荧光成像方法一实施例的流程图；

图15为图8中步骤211另一实施例的流程图；

图16为两种荧光物质在曝光期间积分得到的荧光强度随时间的变化曲线；

图17为图16中两条曲线叠加并加上噪声系数c后的曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

如图1和图2所示，实施例一中，本发明提供的荧光成像系统包括光源10、成像装置20、控制装置30和载物台40。

载物台40用于承载样品F。样品F具有多种荧光物质(荧光探针)，荧光物质用于标记样品中的目标成分。例如不同的荧光物质用来标记不同的目标成分，因此可以通过识别荧光物质的种类及其相关的参数(如发射光的光强等)来确定其标记的目标成分的含量等。荧光物质可以是荧光染料、荧光基团等。本实施例中，荧光物质具体可以是时间分辨荧光物质。优选的，时间分辨荧光物质包括镧系稀土离子螯合物，利用其发光半衰期长，不会产生背景干扰的特性，配合后续的步骤，能实现高灵敏度时间分辨荧光成像。

光源10用于激发样品中的各个荧光物质发出发射光(如荧光、磷光)。光源10可以位于载物台40的下方，光源10发出激发光来照射载物台40上的样品F，从而激发样品F中的各个荧光物质发出发射光。

成像装置20用于检测样品的荧光物质发出的发射光的强度，例如在光源多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，按不同的曝光参数对发射光进行检测(例如成像)得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度。在时间分辨模式下，可按曝光参数对发射光进行检测，可以采用按曝光参数对发射光进行成像的方式来得到该曝光参数对应的荧光强度。

控制装置30用于控制荧光成像系统从而实现本发明提供的荧光成像方法，如图4所示。具体的，控制装置用于控制光源10多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制成像装置20按不同的曝光参数对发射光进行检测得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度，即，每次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制成像装置20按对应的曝光参数对发射光进行检测得到曝光参数对应的实际总荧光强度；其中，曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻；对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。如此实现了多种荧光物质的检测(分辨)，便于后续处理得到目标成分的含量，而且整个过程不采用滤光的方式，提高了检测的灵敏度，也就提高了检测的准确性。

在实施例二中，荧光成像系统还可以兼容常规滤光的方式。如图3所示，本实施例除了包括图1和图2中的各种装置，还包括滤光装置50。具体的，本实施例的荧光成像系统包括如上所述的载物台40、如上所述的光源10、如上所述的成像装置20、滤光装置50和控制装置30。

滤光装置50用于对不同波长的发射光进行滤光。滤光装置50可以包括滤镜轮，滤镜轮上设置有多个滤镜510或者滤光片，各个滤镜510或者滤光片圆周阵列，每个滤镜510或者滤光片过滤的波长不同。滤镜轮设置在成像装置20与载物台40之间，具体是其中一个滤镜510或者滤光片位于发射光的光路上。过滤的波长与对应荧光物质发射光的波长相同，这样一种荧光物质的发射光穿过对应的滤镜510或者滤光片后进入到成像装置20中检测(如成像)，成像装置20检测到的光强就是这种荧光物质发出的发射光的荧光强度，对其成像得到的样品图像就只有这种荧光物质的信息，然后转动滤镜轮即可对另外一种荧光物质的发射光进行检测。各个滤镜510或者滤光片过滤的波长可以介于400-1000nm之间，例如，一个滤镜510或者滤光片的中心波长为450nm，带宽50nm；另一个滤镜510或者滤光片的中心波长为543nm，带宽20nm；还一个滤镜510或者滤光片的中心波长为620nm，带宽50nm。

控制装置30至少具有两种工作模式：时间分辨模式和常规模式。控制装置30用于确定当前的工作模式，在当前工作模式为时间分辨模式时，执行如图4所示的步骤；在当前工作模式为常规模式时，执行如图5所示的步骤。当前的工作模式具体可以根据用户的指令来确定，例如荧光成像系统还包括人机交互装置40。人机交互装置40用于进行人机交互，包括显示器和输入装置。输入装置用于接收用户的输入，其可以包括一个或多个按键，触摸屏等。控制装置30可以通过人机交互装置40接收的工作模式指令来确定当前的工作模式。例如，控制装置30通过显示器显示各种工作模式的显示控件，用户只需通过输入装置选取想要的工作模式的显示控件即可，控制装置30通过输入装置接收工作模式的选定指令即可确定用户选择的工作模式，从而激活(进入)该工作模式。当然，也可以设置与工作模式对应的实体按键，用户按下哪个实体按键，这个实体案件对应的工作模式就被激活。

下面就两种工作模式的具体过程进行说明。

在当前工作模式为时间分辨模式时，控制装置30执行如图4所示的各个步骤，具体包括：

步骤1、控制装置30控制光源10多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光时，控制成像装置20按不同的曝光参数对发射光进行成像得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度以及样品图像。也就是激发一次样品，就对应按一个曝光参数进行成像，再激发一次样品，就按不同的曝光参数进行成像。不同的样品图像其曝光参数也就不同。实际总荧光强度表征曝光参数对应的曝光期间各个荧光物质发出的发射光的总光强。样品图像中光斑的灰度与实际总荧光强度成正比。样品图像中的光斑可以让用户直观的感受到实际总荧光强度，当然也可以不生成样品图像。光源10是受控的光源，例如可以采用波长400nm以下的紫外面光源，具体的，可以采用中心波长为365nm、395nm等的紫外面光源。控制装置30控制光源10开启，从而光源10发出激发光来激发样品中的各个荧光物质发出发射光(受激光)，控制装置30控制光源10关闭，则停止激发。光源10激发荧光物质后就关闭了，这样能确保相机对发射光进行成像时没有激发光的干扰，提高了检测的灵敏度。

在当前工作模式为时间分辨模式时，样品中的荧光物质为时间分辨荧光物质，即，采用时间分辨荧光物质标记目标成分时，检测样品需要采用时间分辨模式。对发射光成像就是对发光的样品成像。其中，曝光参数包括曝光起始时刻和曝光终止时刻，曝光起始时刻到曝光终止时刻之间的时长就是曝光时长，实际上也可以说曝光参数包括曝光时长。多次激发样品中的荧光物质发出发射光，不同次激发时采用不同的曝光参数来检测总发射光的荧光强度(实际总荧光强度)，这样能得到多个不同曝光参数对应的实际总荧光强度，后续可以利用这些实际总荧光强度来反推出每种荧光物质的荧光强度衰减曲线，与已知的荧光强度衰减公式匹配就可以知道样品包含了哪几种时间分辨荧光物质。曝光参数不同，例如可以是曝光起始时刻、曝光终止时刻以及曝光时长中的至少一个不同。

如图2和3所示，成像装置20可以包括镜头(如物镜)210和相机220，各个时间分辨荧光物质发出的发射光经过镜头210后汇聚到相机220中成像，即，相机220用于对发射光进行成像。有的实施例中，镜头210的焦距可调，焦距可调范围可在5mm-60mm之间。

成像装置20控制曝光参数并成像可以有多种方式来实现，下面例举两种进行说明。

一种方式中，成像装置20还可以包括斩光装置，斩光装置位于镜头210和相机220之间的发射光光路上，用于控制镜头210和相机220之间发射光光路的通断，可以通过发射光光路的通断控制来设置曝光参数，例如，通过发射光光路的通断控制实现了对曝光起始时刻和/或曝光终止时刻的控制，发射光光路导通(畅通)时间长，对应的曝光时长就长。也就是说斩光装置可以在光源10每次激发样品中的时间分辨荧光物质时，按对应的曝光参数控制镜头210和相机220之间发射光光路的通断，而相机220则对发射光进行成像，得到当前曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。

斩光装置可以包括斩波器230，斩波器230可以包括多个遮光扇叶231，用于遮挡发射光，两个遮光扇叶231之间的透过区域是空白的或透明的，便于发射光通过。这样，斩波器230旋转时就可以交替的遮挡发射光以及让发射光通过，透过区域扫过发射光光路的时长就是相机220拍摄样品图像的曝光时长。即，斩波器230调整其转动速度或转动频率就可以调整曝光参数。

如图7所示，控制装置30控制光源10多次开启(发出激发光)和关闭(停止发出激发光)以多次激发样品中的各个荧光物质发出发射光，每次光源关闭期间通过控制斩光装置使样品和相机之间的发射光光路畅通，从图7可知，发射光光路畅通的时长就是曝光时长。控制装置30可以通过控制光源10的开关和/或控制斩光装置的开关来设置曝光参数，进而由相机220对发射光进行成像得到曝光参数对应的实际总荧光强度以及样品图像。

控制装置30可以通过控制光源的开关和/或控制斩光装置的开关来设置曝光参数，例如，控制装置30可以控制光源开始关闭的时刻T1与发射光光路开始畅通的时刻T2之间的第一时间差来设置对应的曝光参数，该第一时间差不同对应的是曝光起始时刻不同，即，曝光起始时刻是以荧光物质开始发出发射光的时刻为零点而开始计时的时刻。控制装置30可以让斩波器230的频率或者转速不变，通过控制光源每次关闭的时刻T1来调节该第一时间差，从而得到对应的曝光起始时刻。控制装置30也可以让光源的开关频率不变，每次开启的时长相同，每次关闭的时长相同，然后调节斩波器230的频率或者转速来调节该第一时间差，从而得到对应的曝光起始时刻。控制装置30也可以即控制斩波器230的频率或者转速、又控制光源每次关闭的时刻来调节该第一时间差，从而得到对应的曝光起始时刻。

控制装置30还可以控制光源开始关闭的时刻T1与发射光光路开始关断的时刻T3之间的第二时间差来设置对应的曝光参数，该第二时间差不同对应的是曝光终止时刻不同，即，曝光终止时刻是以荧光物质开始发出发射光的时刻为零点而开始计时的时刻，可以将光源关闭的时刻作为荧光物质开始发出发射光的时刻。控制装置30可以让斩波器230的频率或者转速不变，通过控制光源每次关闭的时刻T1来调节该第二时间差，从而得到对应的曝光终止时刻T3。控制装置30也可以让光源的开关频率不变，每次开启的时长相同，每次关闭的时长相同，然后调节斩波器230的频率或者转速来调节该第二时间差，从而得到对应的曝光终止时刻T3。控制装置30还可以即控制斩波器230的频率或者转速、又控制光源每次关闭的时刻T1来调节该第二时间差，从而得到对应的曝光终止时刻T3。

从上述内容可知，保持斩波器的开关频率(转速)不变，控制装置控制光源10的开启和关闭的时刻可改变曝光参数。当然，控制斩波器的开关频率(转速)也可改变曝光参数，光源10的开关频率可以跟随斩波器开关频率的变化而变化。当然，光源10的开关频率也可以不变，斩波器两个遮光扇叶之间的透过区域可以不同，一个透过区域可对应一种曝光参数。总之，能实现曝光参数的改变即可。

另一种方式中，相机220本身就能对曝光起始时刻和曝光终止时刻进行控制，如控制相机的快门，从而调整曝光参数，无需斩波器230。即，每次激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光时，控制装置30按对应的曝光参数控制相机220对发射光进行成像得到曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。

由于发射光的光强总体上比较弱，对于同一曝光参数而言，可以对样品中的时间分辨荧光物质激发N次，然后进行累计曝光成像或者重复曝光成像。下面分别予以介绍：

累计曝光成像是在同一曝光参数下进行多次曝光，多次曝光得到累计的实际总荧光强度并最终生成一个样品图像。本步骤中，控制装置30具体控制成像装置20依次获取不同的曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。其中，获取当前的曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像可以采用：控制相机220持续处于曝光状态，如图7所示，对光源10和斩波器230进行联动控制从而实现累计曝光成像，光源开时，斩波器遮挡相机，光源关时，斩波器不遮挡相机。具体的，控制装置30控制光源10多次开启和关闭，在光源开启期间激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光，还可以在光源开启期间控制斩波器230遮挡(关闭)发射光光路，避免激发光和发射光进入到相机中，也就是斩波器230遮挡(关闭)发射光光路的时间覆盖光源开启期间；可以通过控制光源10关闭的时刻来设置当前的曝光参数，和/或，在光源10关闭期间通过斩波器230来设置当前的曝光参数。具体的，光源关闭期间，若没有斩波器扇叶的遮挡，发射光将持续进入到相机220中，因此斩波器扇叶离开发射光光路的时刻就是曝光起始时刻(改变图7中的相位差即可改变曝光起始时刻)，下一个扇叶遮挡发射光光路的时刻就是曝光终止时刻，两个扇叶之间的透过区域经过发射光光路的时长就是曝光时长；控制光源开启和关闭的时刻，和/或，控制斩波器的开启(不遮挡发射光光路)和关闭(遮挡发射光光路)的时刻就可以设置对应的曝光参数，每个光源10关闭期间斩波器都可以开启和关闭一次。在光源10开启和关闭的周期数达到预设阈值N时，控制相机220停止曝光从而得到当前曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。预设阈值N可以根据需要设置，预设阈值N为大于1的整数。可见，用同一曝光参数对样品进行检测(成像)的过程中，光源和斩波器开关了N次，相机持续曝光，相当于N次激发的发射光累计曝光成像最后累积成一个实际总荧光强度，也累积到了一个样品图像中，让实际总荧光强度的数值更大、样品图像中的光斑更为明亮，这样能提高时间分辨荧光物质检测的准确性。由于发射光存在的时间都比较短，因此N的数量级可以是千级、万级等，如N是大于等于1000的数、或N是大于等于10000的数等，也就是同一曝光参数下，对发射光累计成千上万次，这样即便偶尔几次激发存在干扰，在成千上万次激发中也可以忽略不计，数据稳定、准确、可靠。

重复曝光成像是在同一曝光参数下进行多次曝光，得到多个实际总荧光强度并生成多个样品图像。本步骤中，控制装置30具体控制成像装置20依次获取不同的曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。其中，获取当前的曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像可以采用：在当前的曝光参数下进行N次曝光成像，得到N个实际总荧光强度和N个样品图像，后续可以将N个实际总荧光强度进行累加，得到当前曝光参数对应的实际总荧光强度，可以将N个样品图像叠加成一个样品图像，将叠加后的样品图像作为当前曝光参数对应的样品图像。N为大于1的整数。这样也能提高荧光物质检测的准确性。

按上述方法获取了当前的曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像之后，就可以按同样的方法获取预设的下一个曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像，依此循环，直到得到所有曝光参数对应的实际总荧光强度和样品图像。

不同曝光参数的数量至少比时间分辨荧光物质种类的数量多两个。样品包含的时间分辨荧光物质种类是已知的，因此不同的曝光参数的数量也是已知或者预先可以设置的、不同的曝光参数也可以预先设置。不同的曝光参数，具体也可以有多种形式，例如，一实施例中，不同曝光参数之间，曝光起始时刻不同(控制装置通过光源和/或斩波器设置不同曝光起始时刻的方法见前述内容)，曝光终止时刻超过各种时间分辨荧光物质中最长的理论寿命参数，曝光终止时刻可以相同。各种时间分辨荧光物质的理论寿命参数是已知的。曝光起始时刻不同，是相对于发射光被激发的时刻而言的。每次成像时，可以将发射光刚被激发的时刻作为时间零点开始计时，不同的曝光起始时刻相当于曝光起始时刻与时间零点之间的时长不同。曝光终止时刻超过各种时间分辨荧光物质中最长的理论寿命参数，意味着开始曝光之后，各种时间分辨荧光物质的发射光全部被相机采集。理论寿命参数用于表征时间分辨荧光物质发出发射光的寿命长短，理论寿命参数可以是荧光寿命，例如，当去掉激发光后，时间分辨荧光物质的荧光强度(发射光的强度)降到激发时的荧光(磷光)最大强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命。e是自然常数。理论寿命参数也可以是半衰期，当去掉激发光后，时间分辨荧光物质的荧光强度降到激发时的荧光(磷光)最大强度的1/2所需要的时间，称为半衰期。

又例如，另一实施例中，不同曝光参数之间，曝光起始时刻相同，曝光终止时刻不同且不超过各种时间分辨荧光物质中最长的理论寿命参数，控制装置通过光源和/或斩波器设置不同曝光终止时刻的方法见前述内容。优选的，各个曝光终止时刻不超过各种时间分辨荧光物质中最短的理论寿命参数，也就是在任一时间分辨荧光物质的寿命结束之前，结束曝光。曝光起始时刻可以是发射光刚被激发的时刻。

还例如，还一实施例中，不同曝光参数之间，曝光起始时刻和曝光终止时刻均不同，但曝光时长相同。以t为曝光起始时刻，x为曝光时长为例，曝光参数即为(t，t+x)，x固定且已知，只需要改变t就能得到不同的曝光参数。曝光时长相同意味着斩波器的结构和控制都相对简单，便于操作。

通过曝光成像得到了样品中所有荧光物质发出的发射光的荧光强度，但每种荧光物质发出的发射光的荧光强度未知，需要将每种荧光物质的发射光的光强从实际总荧光强度中提取出来。通过下面的步骤2可以实现。

光源10位于载物台的下方，例如位于样品底部。光源开启时，斩波器扇叶遮挡住相机，保证此时没有光能够传输至相机，光源关闭时，发射光透过斩波器的透过区域传输至相机，由于关闭光源后，样品的发射光强度会呈指数下降，故尽可能提高斩波器的转动频率比较好，使得光源关闭后，样品的发射光能够尽快被相机捕获，在斩波器转动频率一定的情况下，可缩小透过斩波器的图像尺寸，即缩小透过斩波器的发射光光束的宽度，此时，可使用具有更小扇叶间隙(更小的透过区域)的斩波器进行高频次的累积曝光成像，既能提高信号强度又能提高成像效率。因此，有的实施例中，如图2所示，荧光成像系统还包括光锥60和扩束透镜组70。光锥60、斩波器230、扩束透镜组70和相机220依次设置在发射光的光路上。光锥60用于聚合各个发射光，从而将发射光聚拢，也就缩小了发射光光束的宽度。扩束透镜组70用于发散各个发射光，便于相机成像。扩束透镜组70可以只有一个扩束透镜，也可以有多个。光锥60具有分辨率高，成像畸变小等优点，发射光经镜头210成像于光锥60的大端面，光锥60的小端面出射后缩小，其通过斩波器后由扩束透镜组70进行放大，最后被相机捕获，从而成像。

步骤2、控制装置30对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。具体的，如图6所示，可以包括如下步骤：

步骤21、控制装置30根据样品具有的荧光物质的荧光强度衰减公式(曲线)、不同曝光参数以及不同曝光参数对应的实际总荧光强度，确定样品中每种荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。

免疫印迹WesternBlot分析一般都是基于荧光成像，荧光染料激发和检测波长都位于可见光谱内，在此波长范围内，化学高分子物质，膜，胶，微孔塑料板等也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，即使使用高0D值(截止深度)的滤镜，仍有少部分背景荧光透过滤镜，从而探测膜上蛋白或者核酸的灵敏度受到了极大的限制。虽然利用红外激光荧光有所改善这一状态，但还是无法满足某些特殊蛋白需要极高灵敏度的要求。多色荧光物质的荧光，其涵盖的波长范围比较广，一种荧光物质荧光的波长范围通常会与另一种荧光物质荧光的波长范围存在重叠，虽然重叠区域的荧光光强通常很弱，但依然会相互影响，这也影响了检测的灵敏度。而通过上述内容可知，本发明的时间分辨模式通过对应的方法搭配时间分辨荧光物质，无需滤光，无背景干扰，检测灵敏度高。

如图8所示，本步骤21可以包括：

步骤211、控制装置30根据样品具有的时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式、不同曝光参数以及不同曝光参数对应的实际总荧光强度，解析出各个时间分辨荧光物质的寿命参数值以及最大荧光强度值。其中，不同种时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式不同，理论寿命参数也就不同。解析出来的寿命参数值可以看成是实际的寿命，可以与各个已知的理论寿命参数匹配，通过匹配即可确定时间分辨荧光物质的种类。样品包含的时间分辨荧光物质种类是已知的，因此每种时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式、理论寿命参数等可以预先获取，也是已知的。

本步骤211的具体实现方式可以有多种，本实施例提供两种进行举例说明。第一种方式是解方程组，如图9所示，具体可以包括：

步骤2111、控制装置30利用时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式分别在不同曝光参数对应的曝光期间进行积分，得到该时间分辨荧光物质在不同曝光参数对应的曝光期间的多个理论荧光强度表达式。理论荧光强度表达式包括寿命参数τ和最大荧光强度k这两个参数，后续需要求解出来。虽然时间分辨荧光物质的寿命参数τ和最大荧光强度k这两个参数可以在做测试之前测量出来，但测量出来的两个值不够准确，因此本发明在检测样本时求解出这两个参数，更为准确可靠。

曝光期间为曝光参数的曝光起始时刻和曝光终止时刻之间的时间段。

时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式如下：

y＝k×e

其中y为荧光强度，k为最大荧光强度，即k为t＝0时的荧光强度；τ为荧光物质的寿命参数，t为时间。不同的荧光物质，其k和τ通常不同。e为自然常数。

本实施例用(t，t+x)表示曝光参数，其中t为曝光起始时刻，t+x为曝光终止时刻，x为曝光时长。对时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式进行积分，得到时间分辨荧光物质的曝光参数对应的理论荧光强度表达式：

y＝k×τ×e

为便于说明、理解，本实施例以样品中包含两种时间分辨荧光物质X和Y为例进行说明。假设X的实际寿命参数为Tx，Y的实际寿命参数为Ty，如图10所示，时间分辨荧光物质X的荧光强度衰减公式(曲线)为y1，时间分辨荧光物质Y的荧光强度衰减曲线为y2。本实施例以4个不同曝光参数为例进行说明，具体是每次曝光时，曝光起始时刻不同，本实施例的四次不同曝光参数的曝光中，如图11所示，四个不同的曝光起始时刻分别为t1、t2、t3和t4。

本实施例的样品具有两种时间分辨荧光物质，对于曝光起始时刻为t1的曝光参数，时间分辨荧光物质X的理论荧光强度表达式为k1×τ1×e

步骤2112、荧光强度是发射光的光强，控制装置30将各个时间分辨荧光物质同一曝光参数的理论荧光强度表达式进行求和，得到样品的理论总荧光强度表达式，即，一个曝光参数就对应了样品的一个理论总荧光强度表达式。

样品的理论总荧光强度表达式由各个荧光物质的理论荧光强度表达式相加得到。以样品包含两种荧光物质为例，样品的理论总荧光强度表达式为：

考虑到相机采集荧光强度时存在背景噪声干扰，也有随机干扰噪声，可以将各种干扰归类成一个未知的常数c。可以认为相机成像时的噪声系数为c。即样品的理论总荧光强度表达式还可以包括c，具体是：

步骤2113、控制装置30将同一曝光参数的理论总荧光强度表达式等于实际总荧光强度，从而建立该曝光参数下，包含有各个时间分辨荧光物质的寿命参数和最大荧光强度的方程；其中，一个曝光参数对应一个方程，多个曝光参数对应的方程形成方程组。即，分别将不同的曝光参数代入到公式(3)或(4)中，并让其等于同一曝光参数对应的实际总荧光强度，从而建立了方程组。

本实施例中，以代入公式(3)为例，对于曝光起始时刻为t1的曝光参数，理论总荧光强度表达式为：k1×τ1×e

同样的，对于曝光起始时刻为t2的曝光参数，理论总荧光强度表达式为：k1×τ1×e

同样的，对于曝光起始时刻为t3的曝光参数，理论总荧光强度表达式为：k1×τ1×e

同样的，对于曝光起始时刻为t4的曝光参数，理论总荧光强度表达式为：k1×τ1×e

不同曝光参数的数量不少于方程组求解所需的最低数量，从而确保能求解出方程组中的未知数，如求解出寿命参数、最大荧光强度和相机成像时的噪声系数c等。例如，如果忽略噪声系数c，则具体实施例的方程组中只有荧光物质X和Y的寿命参数和最大荧光强度，共四个未知数，需要至少4个不同的曝光参数。如果考虑噪声系数c，则具体实施例的方程组中有荧光物质X和Y的寿命参数和最大荧光强度以及噪声系数c，共五个未知数，需要至少5个不同的曝光参数。

步骤2114、控制装置30对方程组求解，解出多组寿命参数值以及最大荧光强度值，如果采用公式(4)建立方程，则还能解出噪声系数c。本实施例中，根据方程(1)-(4)解出了k1和k2、τ1和τ2。其中，k1和τ1是一种时间分辨荧光物质的，k2和τ2是另一种时间分辨荧光物质的，但k1和τ1属于时间分辨荧光物质X还是Y还不确定，可以通过步骤2115来确定。

步骤2115、控制装置30根据各组寿命参数值和/或最大荧光强度值确定各组寿命参数值和最大荧光强度值所属的时间分辨荧光物质。时间分辨荧光物质的寿命参数和最大荧光强度通常是已知的，而且通常是一个区间，不太精确。因此可以将求解出来的寿命参数值与已知的荧光物质的寿命参数(区间)去一一匹配，从而能匹配到每组寿命参数值和最大荧光强度值属于哪种荧光物质；和/或，将求解出来的最大荧光强度值与已知的荧光物质的最大荧光强度(区间)去一一匹配，从而能匹配到每组寿命参数值和最大荧光强度值属于哪种荧光物质。例如，τ1的值更接近荧光物质X的荧光寿命，故τ1和k1属于荧光物质X。

如果寿命参数值和/或最大荧光强度值为0，则说明没有对应的荧光物质。

第二种方式是用非线性拟合，如图15所示，步骤211可以具体包括如下步骤：

步骤2111’、控制装置30根据不同曝光参数及其对应的实际总荧光强度，得到实际总荧光强度随时间的变化曲线。曝光参数的曝光起始时刻和曝光终止时刻是已知的，其对应检测到的样品的荧光强度(实际总荧光强度)也是已知的。本方式中，为了便于后续计算处理，不同的曝光参数为：曝光起始时刻不同，曝光终止时刻不同，但曝光时长相同。可以以时间t作为横坐标，实际总荧光强度作为纵坐标，从而得到实际总荧光强度随时间的变化曲线。

本实施例用模拟数据来模拟样品的实际总荧光强度。具体的，假设荧光物质X为含有Tb这种稀土元素的时间分辨荧光物质，荧光物质Y为含有Eu

步骤2112’、控制装置30根据样品具有的时间分辨荧光物质的荧光强度衰减公式以及不同曝光参数，得到样品的理论总荧光强度随时间的变化曲线。对于本实施例而言，就是得到了公式(4)。

步骤2113’、控制装置30根据样品的理论总荧光强度随时间的变化曲线对实际总荧光强度随时间的变化曲线进行非线性拟合，得到多组寿命参数值和最大荧光强度值。上一步骤得到的样品的理论总荧光强度随时间的变化曲线，其中各个荧光物质的寿命参数τ、最大荧光强度k以及噪声系数c是未知的，而实际总荧光强度随时间的变化曲线可以通过多次曝光测量得到，两者本质上是一条曲线，因此，通过理论的曲线公式对实际曲线进行非线性拟合就可以得到各个未知数。以上表中的数据为例，非线性拟合得出的五个未知数分别为k1＝34.87，k2＝15.48，τ1＝2050，τ2＝504.7，c＝222，可见与原先设置的参数基本一致(y＝35×e^(-t/2000)和y＝15×e^(-t/500))，本方式通过非线性拟合，解析出的c以及各个荧光物质的寿命参数值和最大荧光强度值非常准确。

步骤214’、控制装置30根据各组寿命参数值和/或最大荧光强度值确定各组寿命参数值和最大荧光强度值所属的荧光物质。本步骤同上述步骤2115，在此不做赘述。

步骤212、控制装置30根据时间分辨荧光物质的寿命参数值、最大荧光强度值、荧光强度衰减公式以及目标曝光参数，计算出该种荧光物质的目标曝光参数对应的荧光强度。采用同样的方法，就可以得到各个荧光物质的目标曝光参数对应的荧光强度。

控制装置30可以将解出的时间分辨荧光物质的最大荧光强度值、寿命参数值以及目标曝光参数代入其理论荧光强度表达式中，得到样品中该种时间分辨荧光物质的目标曝光参数对应的荧光强度，还可以考虑噪声系数c，将目标曝光参数对应的荧光强度加上求解出来的噪声系数c，得到目标曝光参数最终对应的荧光强度。这样就相当于把各个荧光物质的荧光强度从实际总荧光强度中给分离出来了，整个过程无需滤光片滤光。目标曝光参数可以根据需要进行设置，通常曝光初始时刻越小，对应的荧光强度就越强，因此可以取t＝0等。样品中的各种荧光物质被光源激发后，在目标曝光参数下的荧光强度计算出来了，可以根据荧光物质在目标曝光参数下的荧光强度生成单荧光图像，也就实现了从一个总的样品图像中分离出了各个时间分辨荧光物质的单荧光图像。本实施例是从一个样品图像中分离出两个单荧光图像，其中一个单荧光图像只由荧光物质X的发射光成像生成，另一个单荧光图像只由荧光物质Y的发射光成像生成。

预先可以通过检测得到每种时间分辨荧光物质的荧光强度与浓度的曲线，例如，对于时间分辨荧光物质X，配置不同浓度的时间分辨荧光物质，通过激发时间分辨荧光物质发光并在目标曝光参数下检测荧光强度，得到目标曝光参数下不同浓度对应的荧光强度，从而就得到了时间分辨荧光物质X的荧光强度与浓度的曲线。而时间分辨荧光物质的浓度与其标记的目标成分的浓度是成比例的，如1:1，因此，控制装置30将时间分辨荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度代入到预设的(已知的)荧光强度与浓度的曲线中，就得到了该时间分辨荧光物质标记的目标成分的浓度，从而完成了样品中目标成分含量的检测。

综上所述，本发明提供的方法和系统，能准确的对多种时间分辨荧光物质进行分辨，并能从一个总的荧光强度中分离出各个时间分辨荧光物质发出的发射光的荧光强度，从而能够根据时间分辨荧光物质发出的发射光的荧光强度计算出该荧光物质标记的目标成分的含量，整个过程不需要滤光所以无背景干扰，灵敏度高，非常适合免疫印迹WesternBlot分析以及其他分子的检测。

在当前工作模式为常规模式时，控制装置30执行如图5所示的各个步骤，具体包括：

步骤3、控制装置30控制光源10激发样品中的各个荧光物质发出发射光，控制滤光装置50对发射光进行滤光，控制成像装置20对滤光后的发射光进行检测(如成像)得到单种荧光物质对应的荧光强度，还可以得到滤光图像。荧光物质为非时间分辨荧光物质时，可以选择使用常规模式，当然，时间分辨荧光物质也可以选择常规模式。常规模式由于光源持续发光，故需要滤光，灵敏度较时间分辨模式低一些。非时间分辨荧光物质有激发光存在时(光源开启)会发出发射光，而没有激发光存在时(光源关闭)则不会发出发射光，因此常规模式在对样品成像时，光源需要持续开启，因而成像时需要滤光。本步骤一具体过程可以是：控制装置30控制光源10持续激发样品中的各个荧光物质发出发射光，控制滤光装置50对发射光进行滤光，例如，控制滤镜轮转动，滤镜轮的一个滤镜510或者滤光片转到激发光的光路上就停止，进而控制成像装置20对当前滤镜510或者滤光片滤光后的发射光进行成像得到当前滤镜510或者滤光片对应的荧光物质的荧光强度和滤光图像；之后再控制滤镜轮转动使下一个滤镜510或者滤光片转到激发光的光路上，再控制成像装置20成像从而得到所述下一个滤镜510或者滤光片对应的荧光物质的荧光强度和滤光图像，以此循环，从而得到样品中各个荧光物质的荧光强度和滤光图像。常规模式下样品中荧光物质的种类是已知的，其中心波长也是已知的，因此可以事先设置好匹配的滤光装置50，例如根据各个荧光物质已知的中心波长选择匹配的滤镜轮，该滤镜轮上的各个滤镜510或者滤光片过滤的波长与各个荧光物质的中心波长基本一一对应(一致)。

后续控制装置30可以对样品中各个荧光物质的荧光强度进行处理。例如，将荧光物质的荧光强度代入到预设的荧光强度与浓度的曲线中，得到该荧光物质标记的目标成分的浓度。

荧光成像系统还可以包括限位装置，限位装置用于在当前工作模式为常规模式时，对斩波器230进行限位，使发射光不受斩波器230的遮挡从而进入到相机220，换而言之，在常规模式时不需要使用斩波器230，限位装置将斩波器230的透过区域固定在发射光的光路上。例如，如图12所示，斩波器上具有固定位232，固定位232用于容纳和固定磁性材料(如铁、钢等)，在斩波器上方或下方的预设位置对应设置有电磁铁。在当前工作模式为常规模式时，控制装置30让电磁铁通电，从而吸附磁性材料，使得斩波器固定不动，且其遮光扇叶没有处于发射光的光路上。电磁铁和磁性材料的位置可以互换，能实现同样的功能。

基于实施例二提供的荧光成像系统，本发明还提供对应的荧光成像方法，如图13所示，包括如下步骤：

步骤0、确定当前的工作模式，工作模式至少包括两种：时间分辨模式和常规模式。具体过程见上述实施例，在此不做赘述。在当前工作模式为时间分辨模式时，执行如图4所示的方法流程。在当前工作模式为常规模式时，执行如图5所示的方法流程。由于图4和5的具体过程在上述实施例中已详细阐述，在此不做赘述。

在实施例三中，控制装置30具有的工作模式还包括混合模式，样品中既包含时间分辨荧光物质又包含非时间分辨荧光物质时，可以选择混合模式。具体如图14所示，混合模式下控制装置30执行如图14所示的步骤，具体包括：

步骤3、控制装置30控制光源持续激发样品中的各个荧光物质发出发射光，滤光装置对发射光进行滤光，控制成像装置对滤光后的发射光进行检测(例如成像)得到样品中各个非时间分辨荧光物质对应的荧光强度。样品中的时间分辨荧光物质和非时间分辨荧光物质发射光的波长不同，因此即便都被光源激发了，通过滤光装置也能依次过滤，使得成像得到的任一滤光图像只包含一种非时间分辨荧光物质的发射光的光强信息(体现在图像上就是光斑的灰度)。本步骤可以在步骤1之前，也可以在步骤2之后。本步骤的具体过程同上述实施例二的步骤3，在此不做赘述。

步骤1、控制装置30控制光源多次激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光，所述多次激发样品中的各个时间分辨荧光物质发出发射光时，控制成像装置按不同的曝光参数对发射光进行检测(如成像)得到不同曝光参数对应的实际总荧光强度。虽然样品中包含有非时间分辨荧光物质，但本步骤是关闭光源之后才对样品进行检测成像，而关闭光源之后，非时间分辨荧光物质就不会发出发射光了，因此不会对时间分辨荧光物质的检测造成干扰。本步骤的具体过程同上述实施例中的步骤1，在此不做赘述。

步骤2、控制装置30对不同曝光参数对应的实际总荧光强度进行处理，得到样品中每种时间分辨荧光物质的预设目标曝光参数对应的荧光强度。本步骤的具体过程同上述实施例中的步骤2，在此不做赘述。

本文参照了各种示范实施例进行说明。然而，本领域的技术人员将认识到，在不脱离本文范围的情况下，可以对示范性实施例做出改变和修正。例如，各种操作步骤以及用于执行操作步骤的组件，可以根据特定的应用或考虑与系统的操作相关联的任何数量的成本函数以不同的方式实现(例如一个或多个步骤可以被删除、修改或结合到其他步骤中)。

另外，如本领域技术人员所理解的，本文的原理可以反映在计算机可读存储介质上的计算机程序产品中，该可读存储介质预装有计算机可读程序代码。任何有形的、非暂时性的计算机可读存储介质皆可被使用，包括磁存储设备(硬盘、软盘等)、光学存储设备(CD-ROM、DVD、Blu Ray盘等)、闪存和/或诸如此类。这些计算机程序指令可被加载到通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理设备上以形成机器，使得这些在计算机上或其他可编程数据处理装置上执行的指令可以生成实现指定的功能的装置。这些计算机程序指令也可以存储在计算机可读存储器中，该计算机可读存储器可以指示计算机或其他可编程数据处理设备以特定的方式运行，这样存储在计算机可读存储器中的指令就可以形成一件制造品，包括实现指定功能的实现装置。计算机程序指令也可以加载到计算机或其他可编程数据处理设备上，从而在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生一个计算机实现的进程，使得在计算机或其他可编程设备上执行的指令可以提供用于实现指定功能的步骤。

虽然在各种实施例中已经示出了本文的原理，但是许多特别适用于特定环境和操作要求的结构、布置、比例、元件、材料和部件的修改可以在不脱离本披露的原则和范围内使用。以上修改和其他改变或修正将被包含在本文的范围之内。

前述具体说明已参照各种实施例进行了描述。然而，本领域技术人员将认识到，可以在不脱离本披露的范围的情况下进行各种修正和改变。因此，对于本披露的考虑将是说明性的而非限制性的意义上的，并且所有这些修改都将被包含在其范围内。同样，有关于各种实施例的优点、其他优点和问题的解决方案已如上所述。然而，益处、优点、问题的解决方案以及任何能产生这些的要素，或使其变得更明确的解决方案都不应被解释为关键的、必需的或必要的。本文中所用的术语“包括”和其任何其他变体，皆属于非排他性包含，这样包括要素列表的过程、方法、文章或设备不仅包括这些要素，还包括未明确列出的或不属于该过程、方法、系统、文章或设备的其他要素。此外，本文中所使用的术语“耦合”和其任何其他变体都是指物理连接、电连接、磁连接、光连接、通信连接、功能连接和/或任何其他连接。

具有本领域技术的人将认识到，在不脱离本发明的基本原理的情况下，可以对上述实施例的细节进行许多改变。因此，本发明的范围应根据以下权利要求确定。