SARS-COV-2疫苗

发明领域

本发明涉及经优化以用于由SARS-CoV-2导致的感染的预防性或治疗性治疗的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物由出于其能够在多种不同的人类白细胞抗原(HLA)群体中刺激广泛且有效的适应性免疫应答而选择的一个或多个表位组成。

背景

冠状病毒疾病2019(COVID-19)的爆发及其在全球的快速传播导致世界卫生组织(World Health Organisation，WHO)宣布其为大流行和全球卫生紧急情况。COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的，所述冠状病毒是一种正义RNA冠状病毒，有一个包膜封装其大的RNA基因组并且进一步特征是从其病毒表面突出的暴露刺突糖蛋白(S-蛋白)(Gorbalenya等人,2020,Nat Microbiol5(4):536-544)。

虽然大多数COVID-19病例仅导致包括发烧、咳嗽或气促在内的轻微症状，但有相当一部分病例进展为病毒性肺炎和多器官衰竭(Hui等人,2020,Int J Infect Dis 91:264-66)。全球感染和死亡人数的迅速上升突出了迫切需要更好的治疗性和预防性干预来对抗该疾病，并且有效的疫苗被许多人誉为我们潜在对抗SARS-CoV-2病毒的关键基石。

疫苗接种已被确定为一种流行病学控制的有效形式，并且疫苗在帮助降低与诸如天花和脊髓灰质炎的病毒性感染有关的感染和死亡率方面取得了重大成功。然而，其他感染被证明更难针对其进行疫苗接种。迄今为止，全球开发冠状病毒科疫苗的大部分工作主要集中在刺激针对作为病毒上暴露最多的结构蛋白的S-蛋白的抗体响应。

然而，尽管对密切相关的SARS-CoV的S-蛋白的响应已显示出在小鼠中提供短期保护(Yang等人,2004,Nature 428(6982):561-4)，但在恢复期患者中对相同结构的中和抗体响应通常是低滴度和短暂的(Channappanavar等人,2014,Immunol Res 88(19):11034-44)(Yang等人,2006,Clin Immunol 120(2)171-8)。此外，在一些动物模型中，对SARS-CoV中的S-蛋白的抗体响应的诱导与有害影响有关，从而引发了关于使用S-蛋白作为疫苗靶标的可能安全性担忧。例如，在猕猴模型中，观察到抗S-蛋白抗体与严重急性肺损伤相关(Liu等人,2019JCI Insight4(4))，而来自SARS-CoV患者的血清也显示，在那些死于该疾病的患者中，观察到抗S-蛋白抗体升高。

当考虑抗体依赖性增强(ADE)的可能性时，产生了对以S蛋白为中心的方法的进一步担忧，ADE是一种生物现象，其中抗体促进病毒进入宿主细胞并增强病毒的感染性(Tirado&Yoon 2003,Viral Immunol16(1)69-86)。已经表明，中和抗体可结合冠状病毒的S-蛋白，引发促进病毒进入的构象变化(Wan等人,J Virol 2020,94(5))。因此，越来越多的证据表明，经设计以经由体液免疫应答生成抗S-蛋白抗体的疫苗实际上可能无法提供一种有效且安全的提供针对SARS-CoV-2感染的保护的方法。

作为也专门用于解决感染和防止病原体的再感染的适应性免疫系统的另一个分支，细胞免疫通常与体液免疫(基于抗体的免疫)在自然暴露于异物后协同工作。细胞免疫应答涉及T细胞的相互作用，每个T细胞提供多种免疫相关的功能以帮助减少或消除病原体感染的宿主细胞(Amanna&Slifka 2011,Virology 411(2):206-215)。此外，作为细胞免疫应答的一部分的记忆T细胞的生成导致能够在再次暴露于先前遇到的病原体时更快且更强的免疫应答(Restifo&Tattinoni 2013,Current Opinion in Immunology 25(5):556-63)。由于SARS-CoV-2疫苗的开发一直专注于激活基于中和抗体的体液免疫应答，最常见的是通过生成基于S-蛋白的亚基疫苗(Amanat&Krammer 2020,Cell Press Immunity 52:583–589)，然而此类亚基疫苗不太可能在广泛群体中产生稳健的细胞免疫应答(Testa&Philip 2012,Future Virol 7(11):1077-1088)。

然而，当设计经工程化以激发广泛T细胞响应的疫苗时，在个体和更广泛的群体中存在对人类白细胞抗原(HLA)限制的进一步挑战。HLA系统是人类中的编码主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合体，负责调控个体的免疫系统，以及特异性呈现在感染细胞表面，并引发针对以疫苗的形式递送至所述个体的表位的免疫应答的能力(Marsh等人,2010Tissue Antigens 75(4):291-455)。

HLA等位基因的高多态性和随后的个体间免疫系统变异性导致了群体中多种不同的“HLA类型”。作为基于肽的疫苗开发的一个附加的复杂化因素，此类HLA类型可能对不同个体之间潜在的预防性病毒疫苗组合物的效力具有显著影响。因此，与HLA类型的特定亚组相容的基于表位的疫苗组合物的生成可能证明对包括具有不同HLA类型的个体的很大比例的全球人口无效。有鉴于此，靶向有限数量的HLA类型的T细胞和B细胞表位疫苗的生成可能仅证明对少数选定群体有利。

目前缺乏一种经批准的对广泛的HLA群体有效的疫苗组合物，这对处于危险的群体造成了重大危险，所述群体包括处于院内或社区传播感染的急性危险中的健康护理工作者和患者。

因此，迫切需要一种用于COVID-19的治疗性或预防性治疗的安全且有效的疫苗，其经优化以掺入涵盖多种不同的HLA类型的表位，以及具有在全球人群中刺激针对SARS-CoV-2的广泛适应性免疫应答的潜力。

发明内容

本发明基于以下令人惊讶的发现，即通过使用广泛的人工智能(AI)平台来鉴定结合广泛HLA类型的HLA分子的预测SARS-CoV-2抗原表位，可以配制出包含一个或多个所述表位的安全且有效的疫苗。因此，此类疫苗具有刺激在本质上既为细胞的又为体液的针对SARS-CoV-2的广泛适应性免疫应答的潜力，以用于全球群体的人类中COVID-19的治疗性或预防性治疗。

在本发明的第一方面，提供了冠状病毒疫苗组合物，其包含图1-10中鉴定的任何一个或多个热点区内发现的一个或多个表位，或者编码所述表位的多核苷酸，其中每个表位的长度是至少8个氨基酸，并且其中每个表位具有根据下表的平均抗原呈递(AP)截止值：

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或至少0.5的平均免疫呈递(IP)评分，并且其中抗原呈递(AP)值或免疫呈递值是分配给如图1-10中针对每个热点区所示的每个氨基酸的预测评分，并且其中平均AP截止值是表位内所有氨基酸取平均的值，对于所述值，所述表位被认为能够针对MHC I类和/或MHCII类免疫原性刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

在本发明的第二方面，提供了冠状病毒疫苗组合物，其包含冠状病毒的免疫原性部分，所述免疫原性部分由图1-10中鉴定的任何一个或多个热点区内发现的一个或多个表位或者编码所述表位的多核苷酸组成，其中所述表位中的每一个的长度为至少8个氨基酸，并且其中所述表位中的每一个被认为能够针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

在本发明的第三方面，提供了冠状病毒疫苗组合物，其包含表1内发现的一个或多个表位，或者编码所述表位的多核苷酸，其中每个表位的长度为至少8个氨基酸、优选9个氨基酸，并且其中所述表位被认为能够针对任一MHC I类免疫原性刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答，任选地其中所述组合物还进一步包含根据本发明的第一或第二方面的一个或多个表位中的任一个。

在本发明的第四方面，提供了根据本发明的第一、第二或第三方面的冠状病毒疫苗组合物，其用于对受试者中的冠状病毒感染进行治疗性或预防性治疗的用途中。

在本发明的第五方面，提供了根据本发明的第一、第二或第三方面的冠状病毒疫苗组合物在制备用于治疗性或预防性治疗冠状病毒感染的药物中的用途。

在本发明的第六方面，提供了诊断测定法以确定患者是否感染了或之前已经感染了SARS-CoV-2，其中所述诊断测定法是对从受试者获得的生物样品进行的，并且其中所述诊断测定法包括在生物样品内利用或鉴定所附权利要求中任一项所述的一个或多个表位。

附图简述

图1显示了SARS-CoV-2ORF1ab的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了两个抗原呈递(AP)评分和一个免疫呈递(IP)评分。“AA”和“SEQ”的前两列分别与氨基酸编号和氨基酸类型有关。第一个AP评分(标记为MHC I)是所选氨基酸的抗原呈递值，对66个对应于MHC I类的HLA等位基因取平均值，而第二个AP评分(标记为MHC II)是相同选定氨基酸的抗原呈递值，对34个对应于MHC II类的HLA等位基因取平均值。在ORF1ab中发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中以灰色突出显示。

图2显示了SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在S蛋白内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图3显示了SARS-CoV-2ORF3a的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在ORF3a内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图4显示了SARS-CoV-2包膜(E)蛋白的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在E蛋白内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图5显示了SARS-CoV-2膜(M)蛋白的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在M蛋白内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图6显示了SARS-CoV-2ORF6的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在ORF6内发现的含有满足期望IPAP评分的表位的区域也在该图中标出。

图7显示了SARS-CoV-2ORF7a的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在ORF7a内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图8显示了SARS-CoV-2ORF8的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在ORF8内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图9显示了SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在N蛋白内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中标出。

图10显示了SARS-CoV-2ORF10的完整氨基酸序列，其中每个氨基酸都被给予了类似于图1的两个抗原呈递(AP)评分和一个IP评分。在ORF10内发现的含有满足期望IP评分的表位的区域也在该图中突出显示。

图11显示了根据本发明用于分析的前100个HLA-A和HLA-B I类等位基因和HLA-DRII类等位基因。

图12显示了根据实施例5的加权二部图匹配问题设置的示意图。

图13显示了来自图1-10中任一个的定义的未过滤热点的表，所述热点中的每一个都满足所需的AP评分。

图14显示了来自图1-10中任一个的定义的未过滤热点的表，所述热点中的每一个都满足所需的IP评分。

图15显示了来自图1-10中任一个的过滤热点的表，所述热点中的每一个都满足所需的AP评分。

图16显示了来自图1-10中任一个的过滤热点的表，所述热点中的每一个都满足所需的IP评分。

图17显示了数字孪生分析后选择的热点的表，每个热点都满足所需的AP评分，代表优选选择的热点。

图18显示了数字孪生分析后选择的热点的表，每个热点都满足所需的IP评分，代表另外优选选择的热点。

图19显示了优选表位的选择，其中所述表位可与一个以上热点重叠。

图20显示了实施例6中选择用于患者研究的肽。

图21显示了用等位基因特异性肽池测试的7名患者中的IFNγγ响应的ELISpot测定结果。

图22显示了用泛等位基因肽池测试的10名患者的热图。

图23-34显示了(a)在用预测的肽再刺激后(i)IFNγ分泌响应和(ii)T细胞增殖响应的患者结果的每个热点区的小提琴图，以及(b)在用预测的肽再刺激后(i)IFNγ分泌响应和(ii)T细胞增殖响应的患者结果的每个热点区的热图。

图35显示了如通过(a)IFNγ-分泌和(b)T细胞增殖(3H-胸苷CPM计数)测量的热点免疫原性。

图36显示了如通过(a)IFNγ-分泌和(b)T细胞增殖(3H-胸苷CPM计数)测量的每名供体识别的热点数。

图37显示了在实施例7中验证的67条多肽和热点区。

发明详述

本发明基于人工智能(AI)平台的开发，该平台可以预测SARS-CoV-2表位，所述表位将安全且最有效地刺激本质上既为细胞的又为体液的针对SARS-CoV-2的广泛适应性免疫应答，并且将此类表位掺入疫苗组合物将允许对冠状病毒疾病19(COVID-19)进行治疗性或预防性治疗。设想本发明的疫苗组合物可以通过其设计不同于其他COVID-19疫苗接种方法，通过特异性激活CD8+和CD4+ T细胞来刺激广泛的适应性免疫应答，旨在生成更显著水平的免疫。此外，一种令人惊讶的稳健的统计模型允许鉴定那些预测的SARS-CoV-2表位，所述表位能够在多种人类白细胞抗原(HLA)类型中触发免疫原性，因此疫苗组合物可具有在全球人群中引发针对冠状病毒的保护的潜力。

因此，在本发明的第一方面，提供了冠状病毒疫苗组合物，其包含图1-10中鉴定的任何一个或多个热点区内发现的一个或多个表位，或者编码所述表位的多核苷酸，其中每个表位的长度是至少8个氨基酸，其中每个表位具有根据下表的平均抗原呈递(AP)截止值：

或至少0.5的平均免疫呈递(IP)评分，并且其中抗原呈递(AP)值是分配给如图1-10中热点区所示的每个氨基酸的预测评分，并且其中所述平均AP截止值是表位内所有氨基酸取平均的值，对于此，所述表位被认为能够针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

在本发明的上下文中，术语“多个”用于指代“至少两个”或者“两个或更多个”。

设想本发明的冠状病毒疫苗组合物可用于对抗任何冠状病毒感染。冠状病毒，来自冠状病毒科，是一组有包膜的正义单链RNA((+ssRNA)病毒，可导致人类宿主的呼吸道感染。轻度冠状病毒感染包括一些普通感冒病例，而更致命的冠状病毒物种，如严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(SARS-CoV-2)，可分别导致更严重的疾病SARS、MERS和COVID-19。有人提出，SARS-CoV-2与SARS-CoV共有人畜共患的起源和密切的基因相似性，并且因此我们对COVID-19的大部分了解以及对潜在预防性和治疗性治疗的研究和开发都来自于对此类其他冠状病毒的分析。

SARS-CoV-2是导致2019-2020年COVID-19大流行的致病病毒因子，COVID-19是一种特征是高热、乏力、寒颤、头痛、干咳、淋巴细胞减少和进展至肺间质性浸润的呼吸综合征，在许多国家最终死亡率超过10％。SARS相关的肺部病理学包括随后阶段的病毒复制、免疫系统过度激活及肺部破坏(Weis&Navas-Martin 2005,Microbiol Mol Biol Rev.69(4):635-64)和肺部炎性渗出物。

冠状病毒，如SARS-CoV-2，经由呼吸道内衬的病毒刺突蛋白入侵细胞而附着到特定的细胞受体。SARS-CoV-2病毒(即阳性单链RNA((+)ssRNA)冠状病毒)的受体被鉴定为血管紧张素转换酶2(ACE2)：一种锌金属蛋白酶(Li等人,2003,Nature 426:450-454)。患病肺表现为弥漫性肺泡损伤、上皮细胞增殖和巨噬细胞数量增加。此外，已描述了具有合胞体样细胞形成的巨噬细胞或上皮细胞的多核巨细胞浸润。除了肺中的噬血细胞症(hemophagocytosis)外，在SARS患者中还观察到淋巴细胞减少和脾脏的白髓萎缩。目前，大多数COVID-19患者接受传统的支持性护理，如呼吸辅助和/或类固醇疗法。

设想本发明的疫苗组合物可有助于在人类受试者中治疗性或预防性治疗SARS-CoV-2感染或COVID-19，其中所述组合物包含能够刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答的本发明的一个或多个表位。

本文所用的术语“预防性治疗”是指目的是预防而不是治疗或治愈病毒感染的医疗程序。在本发明中，这特别适用于疫苗组合物。本文所用的术语“预防”并非意在是绝对的，并且也可包括对病毒感染和/或所述病毒感染的一种或多种症状的部分预防。相比之下，术语“治疗性治疗”是指目的是治疗或治愈病毒感染或其相关症状的医疗程序，如在本领域中所理解的。

在本文中可作为“组合物”可互换提及的术语疫苗组合物或疫苗涉及提供对特定传染病(在这种情况下为冠状病毒感染)的主动获得性免疫的生物制剂。通常，疫苗含有类似于引起感染的病毒的因子或“外来”因子，其在现有技术中通常是所述病毒的减弱或灭活形式，或者一种或多种其表面蛋白，如刺突(S)蛋白或其他相关蛋白(Williamson等人,1995,FEMS Immunology and Medical Microbiology 12(3-4):223-230)。此类外来因子会被疫苗接受者的免疫系统识别，进而摧毁所述因子并出现对病毒的“记忆”，从而诱导针对未来来自相同或类似亚种的病毒感染的一定程度的持久保护。通过疫苗接种的途径，包括本发明的那些疫苗组合物，设想一旦接种疫苗的受试者再次遇到针对所述受试者接种疫苗的相同病毒或病毒分离物，个人的免疫系统可因此识别所述病毒或病毒分离物并引发针对感染的更有效防御。对本领域内疫苗类型的更深入的描述可见于在此作为参考并入的US6541003 B1。

经诱导的主动获得性免疫可以是体液的和/或细胞的。体液免疫是指涉及B细胞的应答，所述B细胞产生特异性结合抗原或任何未来抗原(与所施用的疫苗组合物内的那些相对应)的抗体。各自表达独特B细胞受体(BCR)的B细胞识别天然形式的抗原，如SARS-CoV-2刺突蛋白的三级结构。在这种识别和与免疫系统的其他细胞进一步相互作用后，激活的B细胞可以分化为专门分泌针对遇到的抗原的抗体的浆细胞。术语“抗体”是指免疫系统用来特异性鉴定和中和外来抗原的免疫球蛋白(Ig)。这些B细胞来源的浆细胞的亚群变成了长久的抗原特异性记忆B细胞，如技术人员会很好理解的。

同时，细胞免疫可以分为两个不同的部分。第一部分涉及辅助T细胞或CD4+ T细胞，其产生细胞因子并在免疫应答中协调其他免疫细胞的活动。第二部分涉及杀伤T细胞，也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，或CD8+ T细胞，即能够识别HLA呈递的抗原/表位并根除病毒或细菌感染的宿主细胞的细胞。与B细胞相比，T细胞只识别被加工成肽并被装载到组织相容性复合物(MHC)分子上并呈递在细胞表面处的抗原。CD4+ T细胞与MHC II类分子(MHC II类)相互作用，并负责协调免疫应答、识别外来抗原、激活免疫系统的各个部分并激活B细胞和CD8+ T细胞。CD8+ T细胞与MHC I类受体相互作用，并在建立针对胞内病原体的免疫应答中发挥作用。如技术人员会理解的，在感染消退时，CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的亚群可保持为记忆T细胞，从而有助于获得性适应性免疫并允许对来自同一异物的任何继发感染作出更快和更强的响应(Bonilla&Oettgen 2010,Journal of Allergy and ClinicalImmunology 125:33-40)。

设想本发明的疫苗组合物可以是基于表位的疫苗，或者换句话说，由一个或多个表位组成。基于表位的疫苗(EV)利用与免疫表位相对应的短抗原来源肽，所述肽经施用以触发保护性体液和/或细胞免疫应答。EV通过聚焦于最相关的免疫原性和保守的抗原区来潜在地允许精确控制免疫应答激活。对大量多肽组的实验筛选既费时又昂贵；因此，促进蛋白质抗原的T细胞表位作图的计算机方法对EV开发至关重要。T细胞表位的预测集中于由主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白质在受感染细胞表面处对肽的呈递。

本发明的表位可与MHC I类和/或MHC II类分子相互作用，以分别诱导CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞响应。在本发明的优选实施方案中，可能有至少一个表位与MHC I类相互作用，并且有至少一个表位与MHC II类相互作用。

本文所用的术语“表位”是指抗原的被任何抗体、B细胞或T细胞识别的任何部分。“抗原”是指能够被抗体、B细胞或T细胞结合的分子，并且可由一个或多个表位组成。因此，术语表位和抗原可在本文中互换使用。表位也可以由它们所结合的分子来指代，如“T细胞表位”，或更具体地说，“MHC I类表位”或“MHC II类表位”。由MHC I类分子呈递的T细胞表位通常是长度为8至11个氨基酸的肽，而MHC II类分子呈递更长的多肽，因此由MHC II类呈递的这种表位的长度通常是13至17个氨基酸(Alberts 2002,Molecular Biology of theCell P.1401)。

本发明的一个或多个表位的长度为至少8个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，一个或多个表位的长度是8至11个氨基酸。在本发明的其他实施方案中，一个或多个表位的长度是8至17个氨基酸，并且可以是8至24个氨基酸。在本发明的另外实施方案中，一个或多个表位的长度可以是8至30个氨基酸。

设想表位彼此之间的长度可不同，并且可彼此重叠。例如，本发明的疫苗组合物可包含除了另一个长度为25个氨基酸的表位之外的一个长度为8个氨基酸的最小表位，其中所述长度为25个氨基酸的表位可以与长度为8个氨基酸的第一表位的部分重叠或完全包含长度为8个氨基酸的第一表位。

因此，在本发明的一些实施方案中，一个或多个表位可具有相同的长度，或相同数量的氨基酸。在其他实施方案中，一个或多个表位可以在长度或氨基酸数量方面不同。在一些实施方案中，一个或多个表位可至少部分地彼此重叠。在其他实施方案中，一个或多个表位可在一个以上热点重叠。可以与一个以上热点重叠的特别优选的表位列表可见于图19中。

在其他实施方案中，表位中的一个可完全包含同一组合物中另一个表位的全部。本文鉴定了含有一个或多个表位的各个“热点”区，并且如下文更详细解释的，含有一个或多个表位的各个“热点”区可在疫苗组合物中用于呈递表位。因此，本发明涵盖了由一个或多个热点区组成的疫苗组合物，每个热点含有如本文定义的一个或多个表位。

设想本发明的一个或多个表位能够刺激多种人类白细胞抗原(HLA)类型中的广泛适应性免疫应答。人类白细胞抗原(HLA)系统是编码人类MHC蛋白的基因复合体。由于HLA基因的高度多态性性质，由不同HLA基因编码的每个人类个体的精确MHC蛋白可能不同，以微调适应性免疫系统，其中术语“多态性”是指不同等位基因的高度变异性。已经识别了HLA分子的成千上万种不同的等位基因。因此，每个个体可具有独特的“HLA类型”或HLA表型，其在全球人群中是不同的且在免疫系统的功能上有轻微的变化。术语“HLA类型”、“HLA等位基因”或“HLA表型”在本文中可互换使用。当考虑由与MHC I类或II类分子相互作用的表位组成的疫苗时，HLA类型具有特别的意义，因为许多表位受限于它们的仅与由特定HLA等位基因编码的特定HLA分子结合的能力，或者换句话说，仅局限于某些HLA类型。因此，技术人员将理解，能够结合受试者的MHC I类或MHC II类分子(并呈递在感染细胞表面处)，与所述受试者的HLA类型相容的T细胞表位将因此作为稳健的疫苗呈现。由相同T细胞表位组成的疫苗组合物，如果被给予具有不同HLA类型的受试者，如果所述HLA类型编码的MHC分子不能与所述T细胞表位相互作用，则可能证明无效。此类表位不能在该特定的受试者中针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性，刺激广泛适应性免疫应答。

相比之下，本发明的表位已被鉴定能够刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答，包括诸如HLA-A*24:02和HLA-DRB1*01:01的等位基因。如本文提及的HLA等位基因是以本领域标准的当代HLA命名法给出的，其中HLA-A例如是指6号染色体中的基因座，而HLA-A*24:02是指等位基因所编码的蛋白质。对HLA命名的复杂性的深入解释可以见于Marsh等人2010,Tissue Antigens 75(4):291-455。本发明的人工智能(AI)驱动的方法分析了人类群体中所有100个最常见的HLA-A和HLA-B I类和HLA-DR II类等位基因，如图11所示。

用于鉴定和预测本发明的一个或多个表位的AI驱动的平台是惊人地稳健，其综合统计分析也是如此。首先，使用来自“NEC免疫分析器(NEC Immune Profiler)”工具套件的细胞表面抗原呈递和免疫原性预测因子对SARS-CoV-2病毒蛋白质组进行I类表位的表位作图。抗原呈递(AP)是从机器学习模型预测的，该模型将来自几个HLA结合预测因子(使用经验测量的结合亲和力数据训练的)和13个不同的抗原处理预测因子的机器学习层信息集成在一个集合中。

这种AI驱动的方法有利地使用统计模型来定量分析氨基酸子序列内的一个或多个表位在一组不同的HLA类型中的预测免疫原性潜力—换句话说，预测的一个或多个表位激发免疫原性响应的能力。通过定量统计分析鉴定的氨基酸序列的候选区(或“热点”)可代表最有可能成为可行的疫苗靶标并可用于疫苗设计和产生的一个或多个源蛋白的区(或区域)。这些源蛋白包括SARS-CoV-2的四种结构蛋白中的每一种：刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白，分别如图2、4、5和9所示。与所述源蛋白一样，定量统计分析还利用SARS-CoV-2基因组的各种开放阅读框(ORF)进行其表位作图，如图1、3和6-10所示。

设想本文鉴定的每个热点可包含能够通过MHC I类和/或MHC II类刺激适应性免疫应答的一个或多个表位。候选区可包含经预测以在多种HLA类型中激发免疫原性响应的单一表位。此类表位可以被称为与多种HLA类型“重叠”。然而，更典型的是，候选区包括多个表位，这些表位共同地与大部分分析的HLA类型重叠。例如，候选区内的一个表位可与n种HLA类型重叠，并且候选区内的不同表位可与m种HLA类型重叠，使得预测候选区会在(m+n)种HLA类型中激发免疫原性响应。

AI驱动的方法包括为每一组HLA类型指定每个氨基酸的抗原呈递(AP)评分的步骤，其中所述评分指示对于该HLA类型，包含该氨基酸的表位的免疫原性潜力。对于给定的HLA等位基因，分配给氨基酸的评分对应于通过与该氨基酸重叠的表位预测获得的最佳评分。对于I类HLA等位基因，1代表最佳评分，其中氨基酸的自然呈递在细胞表面上的可能性较高，而接近0的评分代表较低的可能性。相比之下，对于II类HLA等位基因，预测的是百分等级结合亲和力评分，其中较低的评分是最佳的。在II类HLA等位基因的可能输出评分范围为0至100的情况下，评分为0代表最佳评分，具有最高的结合亲和力。

I类和II类HLA类型的预测使用抗原呈递和结合亲和力预测算法以及实验数据进行。可用于此类预测的可公开获得的数据库和工具的实例包括免疫表位数据库(IEDB)(https://www.iedb.org/)、NetMHC预测工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)、TepiTool预测工具(http://tools.iedb.org/tepitool/)、NetChop预测工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/)和MHC-NP预测工具(http://tools.immuneepitope.org/mhcnp/.)。其他技术公开于WO2020/070307和WO2017/186959中。

从机器学习模型预测抗原呈递，该模型将来自几个HLA结合预测因子(通过ic50nm结合亲和力数据训练的)和多个不同的抗原处理预测因子(通过质谱数据训练的)的机器学习层信息集成在一个集合中。

然后，根据使用上述技术预测的免疫原性潜力，优选地为每个鉴定的表位分配评分。有利地，该方法不仅鉴定了包括可结合HLA分子的表位的候选区，而且鉴定了由细胞抗原处理机制自然处理并呈现在宿主感染细胞表面上的那些CD8表位。

AP评分按以下方案指定。首先，在固定长度的氨基酸的“移动窗口”中，在氨基酸序列中鉴定多个表位。这是针对每种HLA类型进行的。对于每一个鉴定的第一表位，针对各自的HLA类型，生成指示该表位的免疫原性潜力的评分。随后，针对每种HLA类型，在氨基酸序列中鉴定多个另外的表位。同样，这是使用“移动窗口方法”进行的。针对各自的HLA类型，另外的表位中的每一个也被指定了评分，所述评分指示该表位的免疫原性潜力。然后，针对每种HLA类型，对每个氨基酸指定表位的评分，预测该表位在所有包括该氨基酸的表位中具有最佳的免疫原性潜力。因此，对于特定的HLA类型，如果表位“A”和表位“B”都包含特定的氨基酸“X”，则氨基酸“X”会被指定以预测是表位“A”还是“B”具有最佳的免疫原性潜力为准的评分。换句话说，对于给定的HLA类型，分配给氨基酸的评分对应于通过与该氨基酸重叠的表位获得的最佳评分。

在给定的源蛋白或开放阅读框中的每个氨基酸的AP评分在HLA类型中取平均值，如图1-10所示。每个氨基酸都给予两个AP评分，其中第一个是该氨基酸在66个最常见的对应于MHC I类的HLA-A和HLA-B等位基因中的平均AP评分，而第二个是相同氨基酸在34个最常见的对应于MHC II类的HLA-DR等位基因中的平均AP评分。总之，对全球100个最常见的人类HLA-A、HLA-B和HLA-DR等位基因进行了分析。

所分析的HLA类型可以进一步表征为相同或不同人群组的HLA类型。群组可以是民族群组(如高加索人、非洲人、亚洲人)或地理群组(如伦巴第、武汉)。

AI驱动的方法还涉及蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation)的应用，即一种用于鉴定统计显著性区域的统计模型。将源蛋白或ORF中MHC I类和MHC II类的各氨基酸的输入AP数据转换为二进制数据集，使得对于I类值，>0.7的评分指定为值1，而≤0.7的评分指定为0。对于II类结合亲和力，<10的值被指定为值1，而≥10的那些值被指定为值0。对于给定的HLA类型选择，蒙特卡洛分析鉴定了统计上显著的“bin”、“热点”或蛋白质区域。在本发明的情况下，这种HLA类型的选择是人群中前100个最常见的HLA-A、HLA-B和HLA-DR等位基因，包括对应于MHC I类的66个和对应于MHC II类的34个。提供前100个HLA等位基因不应被解释为对本发明表位的限制。本发明的一个或多个表位还可能够与前100个HLA-A、HLA-B或HLA-DR等位基因相互作用，也能够刺激多种HLA类型(包括HLA-C、HLA-DQ和/或HLA-DP等位基因)中的广泛适应性免疫应答。

统计上显著的热点是通过涉及指定区域度量的定量统计分析鉴定的。氨基酸子序列热点的区域度量指示了热点内的一个或多个表位在测试的HLA类型的集合中的预测免疫原性潜力。因此，“相对较好”的区域度量指示了该氨基酸子序列中的一个或多个表位被共同预测为在大部分的HLA类型中激发免疫原性响应。“相对较差”的区域度量指示了该氨基酸子序列中的一个或多个表位未被共同预测为在分析中的大部分的HLA类型中激发免疫原性响应(例如，该氨基酸子序列内的一个或多个表位根本未被预测为激发免疫原性响应，或仅在极少数HLA类型中激发免疫原性响应)。所述区域度量是基于各热点氨基酸序列内的每个氨基酸在所选HLA类型的集合中的AP评分生成的。

因此，通过基于各氨基酸子序列内氨基酸的评分生成区域度量(这继而指示了相应表位的免疫原性潜力)，每个区域度量都指示了各氨基酸子序列内的一个或多个表位在HLA类型的集合中预测的免疫原性潜力。

在本发明的上下文中，区域度量是在100种HLA类型的集合中各氨基酸子区域内氨基酸评分的平均值。

蒙特卡洛统计模型还鉴定了具有统计上显著的区域度量的那些热点。特别地，应用统计模型以鉴定偶然比预期更好的任何区域度量。如技术人员所理解的，可以例如基于一个或多个表位的预测免疫原性潜力的感知准确性相应地选择此类统计建模的显著性阈值。在本发明的情况下，在5％的错误发现率(FDR)下选择显著性阈值，其中低于5％FDR的那些热点代表最有可能含有基于人类群体中最常见的HLA等位基因的呈递表位的区域。在本发明中使用的FDR程序是Benjamin-Hochberg程序。

蒙特卡洛模拟的应用允许对每个生成的区域度量的p-值进行估计。然后，这些估计的p-值用于鉴定统计上显著的氨基酸子序列热点，并且随后鉴定候选区(热点)。该统计建模的零模型通常被定义为针对每种HLA类型的氨基酸评分集合的生成模型，如果它们是偶然生成的话。特定HLA类型的氨基酸评分集合可被称为“HLA轨迹”。蒙特卡洛模拟用于迭代生成一组100个HLA轨迹和多个相关的模拟区域度量，由此估计了每个区域度量的p-值-从而估计了统计显著性。

将每种HLA类型的氨基酸评分(每个HLA轨迹的排列)排列到多个表位区段和表位空位(epitope gap)中反映了该氨基酸是否是基于其指定的评分预测具有良好免疫原性潜力的表位的一部分。因此，表位区段是分配给经预测具有良好免疫原性潜力的表位内的氨基酸(通常至少8)的评分的连续序列，并且表位空位是分配给不是此类表位的一部分的氨基酸的一个或多个连续评分。通过迭代随机化表位区段和表位空位，而不是单个氨基酸评分，零模型更忠实地反映了区域度量背后的方法，从而提供了更可靠的结果。

作为鉴定本发明的合适表位的另外步骤，输出的平均AP评分用作输入，以计算表位图中的“免疫呈递”(IP)。IP评分代表HLA呈递的肽，所述肽可能被外周中的循环T细胞，即未被缺失或失能的(anergised)T细胞识别，因此最有可能具有免疫原性。在本发明的上下文中，免疫原性的程度将证明是有益的，如技术人员所理解的。

IP评分还惩罚那些与人类蛋白质组具有一定程度“与自身相似”的肽，并奖励具有“与自身有距离”的肽。因此，所得的IP评分鉴定了那些不耐受并因此最有可能诱导不需要的自身免疫应答的T细胞表位。耐受或中心耐受的概念是指消除对自身有反应的任何发育中的T细胞或B细胞，从而确保免疫系统不攻击自身肽的负选择过程。T细胞必须具有识别具有结合的非自身肽的自身MHC分子的能力。在负选择期间，测试T细胞对自身的亲和力，其中，如果它们结合了自身肽，则它们发出信号进行细胞凋亡。

与自身具有高度相似性的T细胞表位可以在一种被称为“分子模拟”的过程中诱导自身免疫病理。这种自身免疫病理涉及针对自身组织和细胞的免疫应答的产生，其可包括B或T细胞的快速多克隆激活和/或细胞因子的有害释放和巨噬细胞功能的改变(Karlsen&Dyrberg1998,Seminars in Immunology 10(1):25-34)。

在本发明中，至少0.5的IP评分被认为是有免疫原性的，并且可以代表包含在疫苗组合物中的阈值。该阈值代表相当大的置信度的安全边际，其中高于所述阈值的IP值被认为适当代表“离自身较远”，而低于其的值被认为适当代表“与自身相似”。进一步设想，作为IP评分的替代利用，可以在表位基础上进行排除，其中可以从疫苗组合物中所包含的表位的选择中丢弃那些平均IP评分低于0.5的表位。

图1-10中列出了所分析的蛋白质和开放阅读框内各氨基酸的IP评分。

设想本发明的冠状病毒疫苗组合物包含任何一个或多个热点内发现的一个或多个表位，包括表1中的SEQ ID NO:1-30，以及图13-18中所含的一个或多个表位，其中所述表位的长度是至少8个氨基酸，并且其中所述表位满足平均抗原呈递(AP)截止值的特定阈值和至少0.5的IP评分。所述平均AP截止值是对表位内所有氨基酸取平均的值，对于所述值，所述表位被认为能够针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性，刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

为了避免混淆，术语“抗原呈递(AP)值”可以用来意指结合亲和力或百分等级，并且所述术语应可以互换使用。因此，在MHC II类的背景中提及平均“AP截止值”应被解释为相关表位的平均结合亲和力或平均百分等级。

在本发明的一些实施方案中，平均AP截止值对于MHC I类可为≥0.4，和/或对于MHC II类可为≤13。在一个优选的实施方案中，平均AP截止值对于MHC I类可为≥0.5，和/或对于MHC II类可为≤10。

设想本发明的冠状病毒疫苗组合物可包含如适合在疫苗组合物内使用的任何数量的表位。在一些实施方案中，组合物包含至少5个表位。在一个优选的实施方案中，组合物包含5至10个表位。在又一个优选的实施方案中，组合物包含5至20个表位，最优选10-12个表位。如本文所公开的，疫苗组合物可以通过选择如本文所定义的各表位来制备，或者表位可被包含在作为疫苗组合物一部分制备的热点区中。

在图13和图14中已经列出了定义的热点的选择，分别代表“未过滤的”表位及其相应的AP评分和IP评分。这种定义的热点的选择可以被进一步过滤以根据AP和IP评分分类的优选实施方案，分别如图15和图16所列出的。过滤是指如前所述的鉴定与自身相似的过程，以及优先选择那些可在病毒蛋白质组的特别保守区内发现的热点。因此，该步骤将有利地包括过滤一个或多个候选区域，以便在一个或多个蛋白质的保守区(即不太可能出现突变的区域)中选择一个或多个候选区。保守区可以使用本领域已知的技术来鉴定。在细化热点选择的又一个方法中，进行了如实施例5中所解释的数字孪生分析：一种用于选择一小组候选肽或热点区以包含在疫苗中的方法和系统，使得群体中的每个成员对疫苗具有阳性响应的可能性最大化。对最优选热点的这种细化选择在AP值的背景下显示在图17中，并在IP值的背景下显示在图18中。

因此，在本发明的一些实施方案中，组合物可包含图13或14内发现的一个或多个表位。在一个优选的实施方案中，一个或多个表位可以在图15或16中找到。在又一个优选的实施方案中，一个或多个表位可以在图17或18中找到。

如各图的描述所述，为了方便技术人员阅读，图1-10中鉴定的各种热点区已通过灰色缩放突出显示，其中所述热点区是未过滤的并且长度可能在100个氨基酸左右。此类突出显示的热点不是本发明的全部鉴定的热点的穷举，而仅仅是几个任选实施方案的指示。

在一些实施方案中，组合物可包含在图13-18和/或表1中的任何一个或多个内发现的一个或多个表位。

在一个优选的实施方案中，一个或多个表位可以是表1和/或图17中所列的表位中的任何一个或多个。在另一个优选的实施方案中，一个或多个表位可以是表1和/或图18中所列的表位中的任何一个或多个。

设想本发明的组合物可包含冠状病毒的免疫原性部分，其中术语“免疫原性部分”是指图1-10中的任何一个或多个中发现的一个或多个表位，或者编码所述表位的多核苷酸。所述免疫原性部分内的每个表位的长度必须是至少8个氨基酸，并且每个表位被认为能够针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性，刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

在一些实施方案中，所述免疫原性部分的大小可具有或表达长度为450个氨基酸的上限，优选长度为300个氨基酸的上限。在其他实施方案中，上限的长度可以是200个氨基酸。在另一个实施方案中，上限可以是50个氨基酸。在又一个另外的实施方案中，上限的长度可以是30个氨基酸。因此，免疫原性部分可由本文中定义为热点的完整(离散)序列或其包含本文中定义的表位中的至少一个的片段组成。

设想用于本发明的组合物中的此类免疫原性部分在本质上是重组的，其中重组是指所述免疫原性部分的人工和/或修饰特性，其可以通过遗传重组手段产生。因此，设想免疫原性部分可为蛋白质的离散的非功能性重组片段，如SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或SARS-CoV-2膜(M)蛋白的离散的非功能性重组片段，其中所述非功能性重组片段包括能够刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答的一个或多个长度为至少8个氨基酸的表位，如本发明所述。

疫苗可包含多个如上所述的离散的免疫原性部分。例如，疫苗可包含来自ORF的一个或多个热点与来自不同ORF的一个或多个热点的组合，等等。每个免疫原性部分可以在疫苗组合物中单独呈现，或可以在单个构建体中连接。在一个实施方案中，疫苗中有至少两个离散的免疫原性部分，更优选疫苗中有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个单独的免疫原性部分。最优选的是疫苗将包含图16和17中鉴定的热点区的组合。

免疫原性部分可以以氨基酸部分(肽)的存在于疫苗组合物中，或者可由多核苷酸例如DNA或RNA(例如mRNA)组成。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含orf1ab内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18的任一个中鉴定的那些，优选15或16，更优选17或18)。疫苗组合物还可包含S、orf3a、E、M、orf6、orf8或N中任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含orf3a内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含S、orf1ab、orf6、orf8、E、M或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含orf6内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含S、orf1ab、orf8、orf3a、E、M或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含orf8内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含S、orf1ab、orf3a、orf6、E、M或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含S内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含在orf1ab、orf3a、orf6、orf8、E、M或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含M内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含在orf1ab、orf3a、orf6、orf8、S、E或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含E内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含在orf1ab、orf3a、orf6、orf8、S、M或N的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

在一个实施方案中，疫苗组合物包含N内本文鉴定的一个或多个表位或热点区(优选图13-18，优选15或16，更优选17或18的任一个中所鉴定的那些)。疫苗组合物还可包含在orf1ab、orf3a、orf6、orf8、S、E或M的任一个内本文鉴定的一个或多个表位或热点区。

本发明的冠状病毒疫苗组合物可包含下表内发现的一个或多个表位：

表1：SARS-CoV-2的蛋白质组内发现的另外优选表位序列的列表

以上表位序列也被认为能够针对MHC I类和/或MHC II类免疫原性刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

在本发明的一些实施方案中，疫苗组合物可包含表1内发现的一个或多个表位。在本发明的其他实施方案中，疫苗组合物可包含表1内发现的一个或多个表位，并且还可包含图1-10和/或13-18中鉴定的热点区的任一个内发现的一个或多个表位。

在一些实施方案中，疫苗组合物可包含根据本发明的一个或多个表位，其被认为能够针对MHC I类刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。在其他实施方案中，疫苗组合物可包含根据本发明的一个或多个表位，其被认为能够针对MHC II类刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。在一个优选的实施方案中，疫苗组合物可包含一个或多个表位，其被认为能够针对MHC I类和MHC II类两者刺激多种HLA类型中的广泛适应性免疫应答。

设想本发明的冠状病毒疫苗组合物还可包含SARS-CoV-2蛋白的三级蛋白结构或其结构域，如S蛋白、M蛋白、E蛋白和/或N蛋白。在一些实施方案中，本发明的组合物还可以包含完整重组SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或者其一个或多个结构域。

技术人员将理解本发明的一个或多个表位，以及任何其他蛋白质或结构域实施方案，或候选区/免疫原性部分/热点实施方案，可以包含在盒内或由盒编码。此外，疫苗组合物可包含编码根据本发明的一个或多个表位、热点或免疫原性部分的一个或多个多核苷酸，任选地还包含其中的任何其他实施方案，如编码S蛋白或者其一个或多个结构域的多核苷酸。所述多核苷酸还可包含在盒内。

本发明的疫苗组合物可根据常规技术配制，如作为亚基肽疫苗。如技术人员所理解的，该疫苗可被配制为核苷修饰的mRNA疫苗，优选地其中mRNA封装在脂质纳米颗粒中。mRNA可以被修饰，例如用1-甲基-3’假尿苷酰基取代尿苷残基。防止内切和外切核酸酶降解的其他修饰对技术人员来说是显而易见的。

也可以使用常规的载体载剂(vector carrier)技术制备疫苗。例如，在一个或多个复制缺陷型腺病毒载体、水疱性口炎病毒载体、流感病毒载体或麻疹病毒载体上呈递一个或多个表位、热点区或免疫原性部分。

在本发明的一些实施方案中，疫苗组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。

短语“药学上可接受的”是指在适当情况下，当施用至人类时不会产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，含有本发明的疫苗组合物的药物组合物的制备将是本领域的技术人员已知的。此外，对于人类施用，应理解制剂应满足无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。如本文所述的药理学上可接受的载剂的特定实例是硼酸盐缓冲液或无菌盐水溶液(0.9％ NaCl)。

如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂{如：抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、调味剂、染料，此类类似材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)。

可能是有效的佐剂的实例包括但不限于：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP I9835A，被称为MTP-PE)和RIBI，其含有从细菌中提取的三种组分，即单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，于2％鲨烯/吐温80乳液中。佐剂和其他试剂的另外实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳、油包水乳液、水油包乳液、胞壁酰基二肽、细菌内毒素、脂质X、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)(痤疮丙酸杆菌(Propionobacterium acnes))、百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)、聚核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂苷、脂质体、左旋咪唑、DEAB-葡聚糖、嵌段共聚物或其他合成佐剂。此类佐剂可以从各种来源商购获得，例如默克佐剂65(Merck Adjuvant 65，Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Freund's Incomplete Adjuvant and CompleteAdjuvant，Difco Laboratories,Detroit,Mich.)。

因此，在本发明的一些实施方案中，组合物还可包含药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。在一个优选的实施方案中，组合物还可包含佐剂。

在本发明的另一方面，提供了根据本发明的第一、第二或第三方面的冠状病毒疫苗组合物，其用于对受试者的冠状病毒感染进行治疗性或预防性治疗。

在另一方面，还有用于治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括向受试者施用如本文定义的疫苗组合物。

在一些实施方案中，冠状病毒疫苗组合物可用于受试者的任何冠状病毒感染的治疗性或预防性治疗中。在一个优选的实施方案中，冠状病毒感染可以由SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV导致。在一个最优选的实施方案中，冠状病毒感染可由SARS-CoV-2导致。

本发明的一种或多种组合物可以经由肠胃外、经口、舌下、经鼻、经鼻口或经肺途径施用至受试者。在一个优选的实施方案中，一种或多种组合物经由选自以下的肠胃外途径施用：皮下注射、皮内注射、肌肉内注射、真皮下注射、腹腔注射或静脉内注射。在一个最优选的实施方案中，通过肠胃外途径施用可包括皮内注射所述一种或多种组合物。为了方便起见，如本文所用的术语“注射”旨在涵盖任何此类肠胃外、经口、舌下、经鼻、经鼻口或经肺途径。

设想根据本发明的冠状病毒疫苗组合物的施用将按照适当的免疫方案进行。术语“适当的免疫方案”应被解释为本发明的组合物的一次或多次施用的时间表或时标，其可在考虑到正在施用组合物的受试者的免疫功效和安全性的情况下因此产生最有效的结果。例如，对于COVID-19的治疗性或预防性治疗，应选择尽可能产生针对SARS-CoV-2的有效免疫，同时仍保持对受试者的合适安全性的免疫方案。

在本发明的一些实施方案中，免疫方案可包括单次施用。在其他实施方案中，免疫方案可包括要么同时要么在适当时间段内的多次施用。在一个优选的实施方案中，免疫方案可包括在14天的时间段内多次施用。

设想可在合适的时间对每名受试者重复适当的剂量方案。在一个优选的实施方案中，免疫方案可在一个月之后重复。

在一段更长的时间段后，进一步施用加强免疫的可能性进一步存在。如果受试者的免疫球蛋白G(IgG)抗体水平或T-细胞响应低于确定的保护水平，则可选择其作为适当的测量。因此，在一些实施方案中，可以在6个月后给予适当的剂量方案作为“加强免疫”。

在本发明的一些实施方案中，可与一种或多种其他抗病毒疗法或其他适当的疗法如干细胞疗法组合施用冠状病毒疫苗组合物，以治疗或预防由病毒引起的感染。此类抗病毒疗法可包括施用磷酸奥司他韦

在本发明的另一方面，提供了根据本发明的第一方面的冠状病毒疫苗组合物在制备用于治疗性或预防性治疗冠状病毒感染的药物中的用途。

所述药物的制备可涉及通过根据本发明的前述方面中的任一项所述的方法来选择一个或多个表位序列或候选区/免疫原性部分或热点以包含在来自一组预测的免疫原性候选氨基酸序列的疫苗中，以及合成一个或多个氨基酸序列或者将一个或多个氨基酸序列编码成相应的DNA或RNA序列。所述DNA和/或RNA序列可插入到细菌或病毒递送系统的基因组中以产生疫苗，或裸露使用，或在诸如脂质纳米颗粒的一些其他制剂中以产生疫苗。

在本发明的另一方面，提供了诊断测定法，以确定患者是否感染了或之前已经感染了SARS-CoV-2(和例如已经发展了保护性免疫应答)，其中诊断测定法是对从受试者获得的生物样品进行的，并且其中诊断测定法包括在生物样品内利用或鉴定权利要求1-15中任一项所述的一个或多个表位。如本文所用的术语利用意在意指本发明的表位在测定中用于鉴定患者中的(如保护性)免疫应答。在该上下文中，表位不是测定的靶标，而是所述测定的组成部分。

技术人员将理解合适的诊断测定法，但合适的诊断测定法可包括酶联免疫吸附斑点(ELISPOT)测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、细胞因子捕获测定法、细胞内染色测定法、四聚体染色测定法或有限稀释培养测定法。

在另一个实施方案中，体外诊断测试可包括基于免疫系统组分的测定以鉴定生物样品内的识别本发明的一个或多个表位的免疫系统组分。以这种方式，诊断测定法可利用本发明的至少一个鉴定的候选区和/或至少一个预测的表位。通常，诊断测定法将包含本发明的(如合成的)至少一个鉴定的候选区和/或预测表位。在一个优选的实施方案中，免疫系统组分可以是T细胞。在另一个优选的实施方案中，免疫系统组分可以是B细胞。

作为此类诊断用途的实例，可分析从患者分离的样品，优选血液样品是否存在T细胞，所述T细胞识别并结合测定内所含的候选区或热点内的表位，所述表位已经被鉴定为本发明的一部分。预测被鉴定为本发明的一部分的表位由HLA分子呈递，并因此能够被T细胞识别。因此，根据本发明的冠状病毒疫苗组合物可用于建立快速的诊断测试或测定。可以在实验室测试中进一步分析被鉴定为疫苗组合物的一部分的表位，以便建立此类诊断测试或测定，从而与传统的实验室方法相比，大大缩短开发测试所花费的时间。

此类T细胞诊断性响应将向技术人员表明，患者是否已经暴露于SARS-CoV-2感染并已经发展了保护性免疫应答，其中所述感染导致可观察到的细胞免疫和/或免疫记忆水平。

实施例1

鉴定潜在表位的数据处理的第一部分涉及对于100种HLA类型，SARS-CoV-2蛋白质组内所有蛋白质中每个氨基酸位置的表位评分的生成。

对于MHC I类的HLA类型，分配给每个氨基酸的评分范围为0-1，其中1为最佳表位评分。对于MHC II类的HLA类型，分配给每个氨基酸的评分范围为0至100(百分等级)，其中0为最佳表位评分。指定氨基酸的评分被确定为在预测中与该氨基酸重叠的肽所携带的最佳评分。I类的大小为8-12和II类的大小为15的所有肽都已经通过抗原呈递框架处理。此时，每种蛋白质生成一个数据集。数据集中的每一行代表针对一种HLA类型预测的氨基酸表位评分。

实施例2

为了确定对于给定的一组HLA类型，给定蛋白质中最富集高表位评分的区域是否比随机能够合理预期的更富集，实施了假设检验框架。

原始输入数据集首先被转换成二进制轨迹。对于每个I类HLA数据集，将表位评分转换为二进制(0和1)值，使得预测表位评分大于0.7的氨基酸位置被赋值为1(阳性预测表位)，并且其余的被赋值为0。类似地，对于II类HLA数据集，预测表位评分为10或更小的氨基酸位置被赋值为1，否则为0。这些截止阈值是相对保守的。每条二进制轨迹都可以被有效地表示为连续一个区段的区间的列表，其间有连续的零，从而形成区段间或空位。

实施例3

对于一组k个HLA二进制轨迹，计算给定大小m的每个热点b

其中权重默认为1.0，但也可代表被分析群体中HLA轨迹的频率。

则：

是在选定的HLA类型中预测为热点b

实施例4

进行基于蒙特卡洛的模拟以估计每个观测热点的统计显著性。

如果HLA轨迹是偶然生成的，则零模型被定义为HLA轨迹的生成模型。根据零模型，通过抽样，产生检验统计量S

所有导致调整的p值低于0.05的热点被认为是在所选HLA组中统计上显著的热点。

实施例5

以下实施例描述了肽或热点选择过程的“数字孪生”方法：一种方法和系统，其用于选择一小组候选肽或热点以包含在疫苗中，使得群体中的每个成员对疫苗具有阳性响应的可能性最大化。

在“数字孪生”框架中，模拟合成群体，并针对该模拟进行肽或热点的最优选择。最终的肽选择则可以基于所有模拟中通常选择的肽。

群体被认为是“数字孪生”公民c的集合C，并且疫苗被认为是疫苗要素v的集合V。我们对每个公民对疫苗具有阳性响应的可能性建模，P(R＝+∣C,V)如下：

P(R＝+C,V)＝min

我们的目标则是选择使这种可能性最大化的疫苗V。

这种极大极小问题被看作是一类加权二部图匹配问题。图12给出了问题设置的概述。

我们进行了一组蒙特卡洛模拟以为每个疫苗要素指定评分。在每个模拟中，我们执行以下步骤。

(1)选择一组候选疫苗要素以包括在疫苗中。

疫苗要素也可以是“热点”或其他任何东西。

(2)创建群体成员的一组“数字孪生”。

在本发明的上下文中，数字孪生是一组HLA等位基因。我们已经从等位基因频率网数据库(Allele Frequency Net Database，AFND)的一组高质量样品中下载了真实公民的完整HLA基因型。因此，我们可以确保我们的数字孪生具有精确的HLA背景。

AFND根据样品的来源将每个样品分配给区域(如，“欧洲”或“撒哈拉以南非洲”)。在离线步骤中，我们基于每个样品中的观察结果和无信息(Jeffreys)先验分布创建了对基因型的后验分布。因此，创建群体由以下步骤组成：

(i)指定区域上的(狄利克雷)先验分布和群体规模；

(ii)基于狄利克雷先验对区域上的多项分布进行抽样；

(iii)基于多项分布对来自所有区域的群体计数进行抽样；

(iv)对来自每个区域的基因型上后验狄利克雷的基因型进行抽样。

数字孪生概念还可以包括对该患者中的病毒的毒株、突变等进行抽样。这些抽样分布也可以是基于先验假设和观测数据的后验分布。

(3)创建一个图，其中每个疫苗要素i与每个“数字孪生”j连接。边缘的权重是疫苗要素将在该患者中产生“阳性”响应的对数可能性。

(我们将该值称为p

(4)假设疫苗要素包含在疫苗中时将引起阳性响应的可能性与其他纳入要素无关。在这种情况下，则公民具有阳性响应的对数可能性等于每个单独疫苗要素产生响应的对数可能性之和。我们把这个对特定公民响应的总体对数可能性称为

就图而言，当选定疫苗要素时，我们将从疫苗要素到公民的边缘称为“活性的”。然后，公民的响应的对数可能性是所有活性进入边缘的和。

(5)选择一组疫苗要素(固定权重的)，使得每名患者具有阳性响应的可能性最大化。由于患者响应的可能性等于活性边缘的和，所以这个选择可以被框定为整数线性程序(ILP)，并且可证明，使用传统的ILP解算器最优地求解。我们使用二进制指标变量

实施例6

肽池创建和验证

选择了93种独特的肽用于在恢复期患者样品中进行验证。将肽分选至七个等位基因特异性肽池，以及三个泛等位基因池。一些泛等位基因池中所包括的肽与等位基因特异性池中的那些重叠，但每种肽只出现在一种等位基因特异性池中。

图20显示了肽到池的最终分配。

除非另有说明，否则在本分析中考虑了以下HLA I类等位基因：

·A0101

·A0201

·A0301

·A1101

·A2301

·A2402

·B0702

·B4001

·C0701

·C0702

除非另有说明，否则在本分析中使用了以下HLA结合预测方法：

·NetMHCPan

·NetMHC

·MHCFlurry

自定义的ResNet模型，包括在NEC实验室欧洲GmbH(NEC Laboratories EuropeGmbH，NLE)的“ResERT”包中

对于HLA呈递预测，使用由NLE训练的自定义的ResNet模型进行预测。

“AP”和“IP”评分是如本文所公开计算的“抗原呈递”和“免疫呈递”评分。

一般过滤

对于每个可能的肽和考虑的等位基因集合，我们用每个结合工具和我们的呈递模型进行预测。还计算了保守评分，其解释了其中出现该肽的sars-cov-2基因组有多少个。

所有的选择方法都使用以下过滤方法来鉴定一组高质量的候选肽进行验证。

·对于四种结合方法中的至少三种，结合预测必须大于500nM(>4.7)。

·呈递的可能性必须>70％。

·该肽必须出现在超过90个(此时收集的119个)基因组中。

等位基因特异性肽池的肽选择

选择和池创建如下。一些选择步骤导致了重复肽(例如，一种肽被预测为多种HLA等位基因的强结合物，可能在下面的步骤2中出现两次)。仅保留独特的肽。

1.我们如上所述过滤高质量候选肽。

2.我们选择了按呈递可能性分选的每种等位基因前5位的肽(通过所有四种结合工具的平均预测打破的联系)。

3.我们基于AP和IP评分选择了8种肽。(参见下文3a。)

4.我们基于图17和18中鉴定的优选热点和IP评分选择了8种肽。(参见下文3b。)

5.我们选择了4个被预测为强结合物但具有较低的呈递可能性的肽(参见下文3c)。

6.我们从常见的等位基因(A0101、A2402、A0201、A0301)中选择了剩下的前7种肽(再次按呈递然后按结合分选)。

7.通过最小化每个肽池中所有HLA等位基因的预测结合评分的差异，将93种独特的肽分选至7个池中。这种最小化是使用标准贪婪爬坡算法(standard greedy hillclimbing algorithm)来进行的。

3a AP和IP肽选择

1.我们如上所述过滤高质量候选肽。

2.我们使用AP或IP评分来计算免疫应答的可能性。

3.在整数线性规划优化例程中使用这些评分来选择肽，以在110个不同的群体(各10个全局加上群体特异性的)中最大化群体覆盖率。

4.基于优化结果，我们手工选择了8种肽。

3b热点肽选择

1.我们如上所述过滤高质量候选肽。

2.我们进一步过滤，并且仅包括与优选的AP或IP优选的热点之一重叠的肽(图17和18)。

3.我们使用整数线性规划优化例程来选择肽，以使用IP评分来计算响应可能性来最大化110个不同群体(各10个全局加上群体特异性的)的群体覆盖率。

4.基于优化结果，我们手工选择了8种肽。

3c强结合物，但呈递肽选择的可能性低

我们选择了4种肽(对于等位基因A0101、A0201、A0301和A2402各一种)，所述肽被预测为强结合物，但选择了预测呈递可能性较低的肽。

1.我们如上所述过滤高质量候选肽。

2.去除所有预测呈递可能性为50％或更大的候选肽。(因此，“弱”结合物已在步骤1中去除，并且“高可能性”的呈递已在该步骤中去除)

3.在剩下的肽中，保留了对A0101、A0201、A0301和A2402具有最高平均预测结合评分的那些肽。

4.结果

1.等位基因特异性池结果

使用从患者收集的新鲜血液样品对池0-6进行测试。测试了7名患者(出现发热但未住院；用PCR确认为COVID阳性；恢复后采集的样品)；还测试了3个对照。也包括了实验阳性和阴性实验对照。无HLA分型可用。

ELISpot测定用于测试IFNg响应。

图21显示了以每3x10

·未刺激的

·AF：自体荧光，即由人工制品如抗体沉淀产生的斑点。

·巨细胞病毒/爱泼斯坦-巴尔病毒/流感(CEF)

·巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、流感病毒、破伤风毒素和腺病毒5(CEFTA)

·植物凝集素(PHA)

·Tu39–抗HLA II类(DR、DP和大部分DQ)抗体

·w6/32–抗HLA I类抗体

2.泛等位基因池结果

使用从患者收集的新鲜血液样品对泛等位基因池进行测试。测试了10名患者(出现发热但未住院；用PCR确认为COVID阳性；恢复后采集的样品)(N001、N004等)；还测试了2个对照(结果热图中的“JBG”和“NGG”行，图22)。也包括了实验阳性和阴性实验对照。无HLA分型可用。

ELISpot测定用于测试IFNg响应。

图22显示了以每300,000个细胞的斑点计的结果。除了池之外，还包括以下对照(如图中所示)。

·空的-孔中什么也没有。

·无肽-包括样品但不包括肽。这与等位基因特异性池结果中的“未刺激的”设置相匹配。

·CEF

·PHA

5.结论

结果表明，至少一个泛等位基因池导致阳性免疫应答，高于在阴性对照中观察到的结果(图22)。此外，7名患者中有5名对至少一个等位基因特异性池有响应(图21)，而所有的等位基因特异性池在至少1名患者中导致免疫应答。在阴性对照设置中，没有一个池产生显著的响应。

因此，这些结果表明，这些肽与恢复患者的免疫应答有关，并且它们不会导致COVID测试未呈阳性的患者的响应。

实施例7

目标

该研究的目的是生成概念证明数据，其证明使用NEC免疫分析器和随后的蒙特卡洛模拟分析在计算机中鉴定的热点区具有免疫原性，即，热点中包含的最小表位被从SARS-CoV-2感染中恢复的恢复期供体的T细胞识别。

方法

1.最小表位的鉴定

对于表2(下文)中鉴定的每个热点，通过在肽序列和侧翼区平铺，在计算机中创建了每个可能的9mer和10mer排列。然后针对挪威人群中最常见的HLA-A和HLA-B等位基因生成预测细胞表面呈递评分(AP评分)和免疫原性评分(IP评分)；HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*23:01、HLA-A*29:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*15:01、HLA-B*15:02HLA-B*40:01&HLA-B*44:02。合成AP和IP评分分别高于0.7和0.5的肽，用于随后的免疫原性测试。总计成功合成并随后测试了来自12个热点的65种(互斥)肽(参见图37)。

表2：来自选定热点的测试肽

来自图16&17的优选热点以粗体文本显示，而经评价的其他热点是非粗体文本。

2.免疫原性测试

SARS-CoV-2供体

血液样品采集自疾病消退后3-12周确认为SARS-CoV-2PCR-阳性状态的供体。所有供体均患有症状轻微的自限性疾病，并且未住院。使用离心从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后将其用于随后的免疫原性测试，以确定针对选定的测试SARS-CoV-2表位的抗原特异性T细胞响应。尽管测试肽是基于挪威人群中最常见的HLA-A和HLA-B等位基因选择的，但研究中的患者不是HLA类型的(在免疫原性测试时)，并且很可能许多不是挪威族裔的，因为在收集样品时，COVID-19在非挪威族裔群体中更常见。

T细胞分析

测试所有PBMC样品对单独的65个选定的测试肽的增殖(3H-胸苷掺入)和细胞因子(IFN-γ)响应。

用预测的表位再刺激后定量T-细胞的IFN-γ分泌

简而言之，每孔添加大约5x10

测量用预测的表位再刺激后T-细胞增殖响应

再刺激的PBMC(来自上述实验)随后与3H-胸苷一起再孵育3天，然后收获，并使用闪烁β-计数器测定掺入的3H-胸苷的量，并以每分钟计数(CPM)进行测量。阴性对照的背景CPM值从在用单个测试肽再刺激的实验孔中测量的CPM值中减去。将与特定预测热点相关的每名测试患者/每种测试肽组合的净CPM结果绘制在小提琴图和相关的热图中，如下图23至34所示。

3.结果

每个热点的结果的总结概述

每个热点和每个个体患者的IFN-γ和T细胞增殖响应显示在图23至34中的小提琴图和相关热图中。

以表位为中心的概述

当使用20pg/ml的IFN-γ阈值和500CPM的增殖阈值时，100％的测试表位在来自至少一名供体的PBMC中刺激抗原特异性T细胞响应(具有免疫原性)。当分别使用100pg/ml的IFN-γ阈值和1000CPM的增殖阈值时，100％和83％的表位具有免疫原性(在至少一名供体中)(参见下表3)。

表3

以热点为中心的概述

使用在较低和较低阈值下的IFN-γ分泌和T-细胞增殖读出，100％的测试热点显示在来自至少1名供体的PBMC中具有免疫原性，如图35a&35b所示。

使用较低的IFN-γ阈值(20pg/ml)时，75％供体中9/12和热点具有免疫原性，并且使用较低的增殖阈值(500CPM)时，7/12具有免疫原性的。当应用更高的读出阈值时，这些百分比降低了，尽管响应仍然非常惊人地稳健，特别是当使用增殖读出时。

以供体为中心的概述

当使用较低的阈值(分别为20pg/ml和500CPM)处的IFN-γ分泌和T-细胞增殖读出时，100％的供体显示出针对一个热点内的至少一个表位的抗原特异性T细胞响应，如下图36a&36b所示。使用较低的IFN-γ阈值(20pg/ml)，来自70％供体的PBMC显示出针对来自至少10/12热点的肽的抗原特异性T细胞响应，并且使用较低的增殖阈值(500CPM)时为60％。当使用较高的IFN-γ阈值(100pg/ml)时，来自75％供体的PBMC显示出对一个热点内的至少一个表位的抗原特异性T细胞响应，并且使用较高的增殖阈值(1000CPM)时为85％，并且来自90％供体的PBMC在较高的阈值下具有显著的IFN-γ和/或显著的T细胞增殖响应。

4.讨论

对使用NEC免疫分析器和随后的蒙特卡洛模拟分析(如表2所示)在计算机中鉴定的SARS-CoV-2热点进行分析，以鉴定挪威人群中最常见的HLA-A和HLA-B等位基因的最小表位。然后合成65个测试肽(表位)，并将其用于再刺激来自从SARS-CoV-2感染恢复的恢复期供体的PBMC，以评估计算机预测的序列是否能成功地诱导T细胞召回响应(recallresponse)。证明恢复期供体中的召回响应将提供令人信服的证据，即预测的肽和相关热点能够在自然感染期间诱导抗原特异性T细胞响应，支持了它们用于开发疫苗和诊断。使用两个读出测量抗原特异性T细胞响应：用测试肽再刺激后的IFN-γ分泌和T细胞增殖。

当使用1000CPM的较高增殖阈值时，100％的测试肽(表位)刺激来自至少一名供体的PBMC中的抗原特异性T细胞响应，并且当使用100pg/ml的较高IFN-γ阈值时为83％。类似地，使用较高阈值下的两个读出，100％的测试热点显示为在至少1名供体中具有免疫原性。有趣的是，尽管所选多肽与供体(许多可能不是挪威族裔)之间缺乏HLA匹配，但当使用在较低阈值下的两个T细胞读出时，100％的供体显示出针对至少一个表位的抗原特异性T细胞响应，并且90％的供体在较高阈值下具有显著的IFN-γ和/或显著的T细胞增殖响应。

该数据清楚地支持使用NEC免疫分析器和随后的蒙特卡洛模拟分析鉴定的热点作为针对SARS-CoV-2的通用T细胞疫苗或诊断的组分的用途。此外，由于掺入热点的疫苗将含有可由人类群体中广泛多样性的HLA呈递的多个HLA限制性T细胞表位，它可能比经设计以刺激针对刺突蛋白的抗体响应的目前产生的疫苗更能抵抗逃逸变体的出现。

下图23-34(i)。ELISA能够检测≥10pg/ml的IFN-γ浓度，但为了保守，我们将阳性响应定义为IFN-γ浓度≥20pg/ml(较低的阈值)的测试孔。我们还应用了≥100pg/ml的严格得多的阈值来鉴定特别强烈的响应者(较高的阈值)。

下图23-34(ii)。我们将阳性响应定义为一旦从阴性对照中减去背景CPM，测试孔的CPM值高于500(较低的阈值)。此外，我们应用了≥1000CPM的更严格的阈值来鉴定特别强的响应者(较高的阈值)。