一种基于PCR反应的白羽鸽选育方法及所用引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，具体涉及一种基于PCR反应的白羽鸽选育方法及所用引物和试剂盒。

背景技术

鸽属鸟纲、鸽形目、鸠鸽科、鸽属，存在肉鸽、信鸽、赛鸽等多个品种。肉鸽由野生原鸽长期选育而成，以吃肉为目的，也是饲养最广泛的一种鸽。肉鸽含有十几种氨基酸，多种微量元素和维生素，营养丰富，肉质细嫩味美，是高级滋补营养品。肉鸽羽色类型丰富，存在多个颜色突变表型，如灰色、红色、雨点、白色等。《本草纲目》中记载：“鸽羽色众多，唯白色入药”，入药后能调心、养血、补气，具有防止疾病，消除疲劳，增进食欲的功效，所以白羽鸽相对其他有色羽鸽具有更高的经济价值，是育种的首选。

白羽是鸽育种时考虑保留的重要性状，但人们还期望在保留白羽性状的同时来改善和提升鸽的其他性状。比如，有一种白羽鸽胸肌较为发达，而有一种棕羽鸽体型较大，有可能通过将这两种鸽杂交来得到胸肌发达同时体型较大的鸽，但是在杂交时后代会出现白羽和有色羽共存的现象。如果能知道控制白羽性状的因果基因，就可能实现对亲本鸽基因型的有目的的选择，从而使杂交的后代更高概率地产生白羽性状(因为根据杂交后期望得到的白羽鸽因果基因可以在选择亲本鸽时摒除确定不能产生白羽性状的基因型)，并同时保留父本鸽和母本鸽的其他有益性状，从而会极大提升白羽鸽育种的质量和效率。但目前人们并不清楚控制鸽白羽性状的因果基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR反应的白羽鸽选育方法，该方法基于发现控制白羽性状的因果变异而做出，对可能繁殖出白羽表型的亲本鸽的基因型进行选择而排除确定不能产生白羽的亲本鸽基因型，从而在更快速高效地产生白羽性状的同时有可能同时保留期望的父本鸽和母本鸽的有益性状，提升白羽鸽选育的质量和效率。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种基于PCR反应的白羽鸽选育方法，包括如下步骤：

步骤S1：检测亲本鸽的基因型，选取EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点为AA或GA的亲本鸽作为适合杂交的亲本鸽；

步骤S2：将所述适合杂交的亲本鸽进行杂交，得到EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点为AA的鸽，即为白羽鸽。

优选的，所述步骤S1中检测亲本鸽的基因型包括如下步骤：

步骤S11：提取亲本鸽的基因组DNA；

步骤S12：对所述基因组DNA进行PCR扩增，扩增出含有EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点的片段；

步骤S13：对扩增出的所述片段进行测序，根据测序结果确定基因型。

进一步的，所述步骤S12中，利用如下引物扩增出含有EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点的片段：

上游引物:5’-GGGCCTTTGGGATCAATTCT-3’；

下游引物:5’-GATGTTGCTCTCCCTGTGTT-3’。

进一步的，所述步骤S12中：

PCR扩增体系为：PCR Mix 5μL；鸽基因组DNA 1μL，浓度为10-100ng/ul；上游引物0.2μL，浓度为10pM；下游引物0.2μL，浓度为10pM；双蒸水3.6μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸10min。

本发明的另一个目的是提供一种扩增引物，用于扩增含有EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点的核苷酸序列，包括：

上游引物:5’-GGGCCTTTGGGATCAATTCT-3’；

下游引物:5’-GATGTTGCTCTCCCTGTGTT-3’。

本发明的第三个目的是提供一种试剂盒，用于扩增含有EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点的核苷酸序列，包括PCR Mix 5μL；上游引物0.2μL，浓度为10pM；下游引物0.2μL，浓度为10pM；双蒸水3.6μL；所述上游引物为5’-GGGCCTTTGGGATCAATTCT-3’，所述下游引物为5’-GATGTTGCTCTCCCTGTGTT-3’。

本发明的有益效果在于，首先发现了控制鸽白羽性状的因果变异，即鸽EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点为AA的基因为白羽基因，若该位点的基因型为GA或GG则为有色羽(即非单纯白羽，如棕羽、花羽等)。因此，育种时要得到白羽鸽则需产生上述AA基因型，相应地选取亲本鸽时应选取该位点为AA或GA的基因与GA基因杂交，而不能选取该位点为GG的基因进行杂交，这样就可以提升育种速度和效率，在相同的工作量下可以得到更多的白羽鸽并保留其他亲本鸽的有益性状，从而提升育种质量和效率。本发明所提供的引物能够扩增出含有上述基因位点的扩增产物，以便检测亲本鸽的基因型而进行快速育种。所提供的试剂盒进一步提升了检测工作的便捷性。

附图说明

图1是白羽鸽和棕羽鸽Fst分析曼哈顿图；

图2和图3是变异位点扩增片段电泳图；

图4是AA基因型测序图；

图5是GG基因型测序图；

图6是GA基因型测序图。

具体实施方式

下同通过具体实施方式，对本发明做进一步说明：

一、鸽白羽性状因果变异的筛选与鉴定

1.鸽基因组DNA的重测序

用于重测序的鸽样本来源于阜平硒鸽实业有限公司，对受试个体翼部翅静脉采集全血约0.5mL并放于含EDTA抗凝剂的真空采血管中，转运到实验室后保存于-20℃冰箱。共采集20只白羽鸽和10只棕羽鸽血液样品进行全基因组重测序。采用DNA试剂盒提取鸽血液基因组DNA，并对DNA样品进行质量控制、浓度检测和标准化。

将提取的质量合格的白羽鸽和棕羽鸽血液基因组DNA，使用GenoBaits DNALibrary Prep Kit试剂盒用于构建测序文库，文库在华大测序平台MGISEQ-2000/MGI-T7进行测序，产生150bp的双末端序列。

2.数据过滤和SNP分型与质控

过滤掉接头序列和低质量reads后获得干净reads，利用BWA mem与参考基因组Cliv_2.1进行比对，使用SAMtools软件将校准文件转换为BAM文件，使用SAMtools命令“rmdup”去除PCR扩增产生的重复序列。单核苷酸多态性(SNPs)和插入/缺失(Indels)(<50bp)通过基因组变异检测软件GATK v4.0进行检测，获得鸽的SNP变异信息，再利用Plinkv1.9软件过滤次等位基因(MAF)小于0.01和群体基因型检出率小于90％的SNPs，最终得到全基因组SNP变异信息数据集，用于后续白羽性状相关变异位点分析。

3.白羽因果变异的筛选与鉴定

利用群体基因组学方法如等位基因频率分析、主成分分析、基因频率差异分析、选择信号分析和受选择基因的注释分析等进行分析，然后根据等位基因频率差异和F

二、鸽羽色因果变异的验证

取40只白羽鸽、30只棕羽鸽和12只花羽鸽，使用DNA提取试剂盒提取鸽基因组DNA，将含有上述因果基因变异位点的序列作为扩增目标序列，利用primer-BLAST设计三对引物，如表1所示。

分别利用上述引物和如下扩增体系及扩增程序对所提取的基因组DNA进行扩增，退火温度考察了56℃、58℃、60℃、和62℃，试验结果如图2所示。

由图2可见，PEDNRB 3具有引物二聚体，而PEDNRB1和PEDNRB2引物在退火温度达60℃或62℃时，条带单一，特异性较好。因此，选用PEDNRB2或PEDNRB1引物且退火为60℃进行PCR扩增和测序。利用PEDNRB2对白羽、棕羽和花羽基因组DNA进行扩增，均能获得单一的目的条带，如图3所示(图3中Marker为100bp DNA marker；1-3为白羽鸽DNA的PCR产物；4-6为棕羽鸽DNA的PCR产物；7-9为花羽鸽DNA的PCR产物)。

PCR扩增体系为：PCR Mix 5μL；鸽基因组DNA 1μL，浓度为10-100ng/ul；上游引物0.2μL，浓度为10pM；下游引物0.2μL，浓度为10pM；双蒸水3.6μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸10min。

表1扩增引物

将PCR产物经电泳检测后送测序公司测序，测序结果见图4、图5和图6所示，基因频率表见表2。

由图4、图5、图6和表2可知，控制鸽白羽性状的因果变异为EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点为AA的基因，而该位点的基因型为GG或GA则不是白羽。

表2基因频率表

三、白羽鸽的选育方法

预备工作：选取多只体型较大的棕羽鸽亲本(基因型为GG)和多只胸肌发达的白羽鸽亲本(基因型为AA)进行杂交，得到的F1代中会产生体型大的花羽鸽(基因型为GA)，F1代鸽横交固定产生F2代(白羽鸽为AA型，花羽鸽为GA或GG)。

实施例1选育体型较大且胸肌发达的白羽鸽实例1

选取100只F2代中体型较大的花羽鸽，利用前述PCR反应检测基因型，其中91只基因型为GA(即EDNRB2基因第4外显子上766bp核苷酸位点的基因型为GA，下同)，9只基因型为GG，选取所述91只基因型为GA的花羽鸽作为适合杂交的亲本鸽。其余9只基因型为GG的花羽鸽为不适合杂交的亲本鸽(实际育种时不进行杂交从而节约工作量和成本，但本实施例作为验证仍进行杂交试验)。由适合杂交的亲本鸽与白羽鸽杂交得到的F3代中有43只白羽鸽(经检测基因型均为AA)，其中有22只同时具有发达的胸肌和较大的体型，此22只白羽鸽作为选育品种保留或进一步作为选育的亲本。而不适合杂交的9只花羽鸽与白羽鸽杂交后均未得到白羽鸽。

实施例2选育体型较大且胸肌发达的白羽鸽实例2

选取200只F2代中体型较大的花羽鸽并且按雌雄组成100对，利用前述PCR反应检测基因型，其中79对的基因型均为GA，21对中有一方的基因型为GG，另一方的基因型为GA。将所述79对基因型均为GA的亲本鸽作为适合杂交的亲本鸽，而所述21对含有GG基因型的亲本鸽为不适合杂交的亲本鸽(实际育种工作中摒除而不进行杂交从而节约工作量和成本，本实施例为了验证继续杂交)。由适合杂交的亲本鸽得到的F3代中有20只白羽鸽，其中有12只具有发达的胸肌且体型较大，此12只白羽鸽可以作为品种保留或进一步进行选育使用。而不适合杂交的21对亲本鸽杂交后均未得到白羽鸽。

上述实施例只是对本发明构思和实现的说明，并非对其进行限制，在本发明构思下，未经实质变换的技术方案仍然在保护范围内。