重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明及生物技术领域，特别涉及重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用。

背景技术

吡喃糖氧化酶(Pyranose Oxidase或简称PROD)是由担子菌纲的微生物产生的一类葡萄糖2位氧化酶，在以D-葡萄糖为底物，分子氧作为电子受体时呈现最高活性。它的分子量为70kD，是已知酶中较大的含黄素蛋白的酶，由623个氨基酸残基构成，目前在生物分子、食品或饮料行业、疾病诊断、生物过程监测和环境污染物筛选等方面都有应用(B.Perez-Lopez,A.Merkoci,Nanoparticles for the development of improved(bio)sensing systems,Anal.Bioanal.Chem.399(2011)1577–1590)，其中，PROD作为生物传感器主要是基于其有效氧化各种碳水化合物的能力(S.Timur,Y.Yigzaw,L.Gorton,Electricalwiring of pyranose oxidase with osmium redox polymers,Sens.Actuator.BChem.113(2006)684–691)。PROD是葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶超家族中的一种非黄酮氧化还原酶(L.Sützl,C.Laurent,A.T.Abrera,G.Schütz,R.Ludwig,D.Haltrich,Multiplicity of enzymatic functions in the CAZy AA3 family,Appl.Microbiol.Biotechnol.102(2018)2477–2492)，通常在木材降解真菌中发现，它在细胞外与菌丝胞质周围空间的膜结合囊泡或其他膜结构相结合(G.Daniel,J.Volc,E.Kubátová,T.Nilsson,Ultrastructural and immunocytochemical studies on the H2O2-producing enzyme pyranose oxidase inPhanerochaete chrysosporiumgrown underliquid culture conditions,Appl.Environ.Microbiol.58(1992)3667–3676)。除真菌外，吡喃糖氧化酶还存在于放线菌纲、变形菌纲和杆菌类细菌中(P.L.Herzog,L.Sützl,B.Eisenhut,D.Maresch,D.Haltrich,C.Obinger,C.K.Peterbauer,Versatile oxidaseand dehydrogenase activities of bacterial pyranose 2-oxidase facilitate redoxcycling with manganese peroxidase in vitro,Appl.Environ.Microbiol.85(2019))。系统发育研究表明，PROD是唯一一种真菌和细菌共享的GMC酶(L.Sützl,G.Foley,E.Gillam,M.Bodén,D.Haltrich,The GMC superfamily of oxidoreductases revisited:analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases,Biotechnol Biofuels 12(2019)118)。

传统方法主要是通过真菌类微生物的提取获得吡喃糖氧化酶，不仅来源受限制，而且存在产量低、纯化工艺繁杂等问题，难以得到高纯度蛋白。基因工程法构建PROD生产菌株，纯化工艺简单，来源不受限，是解决上述问题的有效办法。曾有研究者用大肠杆菌表达系统对吡喃糖氧化酶的表达进行了研究，由于淡黄褐栓菌的吡喃糖氧化酶在大肠杆菌中的表达属于异源性表达，产物中出现大量包涵体，吡喃糖氧化酶的活性也同时受到影响。

因此，开发一种生产周期短、产量高、产物活性高的吡喃糖氧化酶的制备方法十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种吡喃糖氧化酶的制备方法，使得制备吡喃糖氧化酶活性高、稳定性好、产率高、易于纯化、易于转发酵批量生产。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种编码吡喃糖氧化酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；

(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。

本发明第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3’端连接有表达His×6标签的多核苷酸序列。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明第四方面提供了一种制备吡喃糖氧化酶的方法，所述方法包括步骤：

培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

分离所述目的蛋白，即得所述吡喃糖氧化酶；

其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者

如本发明第二方面提供的表达载体；或者

如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

或者根据本发明第四方面所述的方法制备的吡喃糖氧化酶。

本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

(1)本发明提供的方法，通过密码子优化序列，利用大肠杆菌表达系统成功表达出吡喃糖氧化酶，该方法产量高，生长周期短，产物保持高免疫学活性；

(2)本发明提供的方法采用了基因工程大肠杆菌重组融合表达吡喃糖氧化酶，并实现了在大肠杆菌系统的可溶性表达蛋白的产量高，易于纯化，并具备催化活性，易于转发酵批量生产。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。

图1是根据本发明实施例中吡喃糖氧化酶SDS-PAGE鉴定结构图；

图2是根据本发明实施例中吡喃糖氧化酶Ni-NTA柱纯化所得电泳图；

图3是根据本发明实施例中吡喃糖氧化酶HisTrapTM QHP离子交换纯化所得电泳图；

图4是根据本发明实施例中吡喃糖氧化酶标准曲线图。

具体实施方式

现有技术中，制备吡喃糖氧化酶常使用微生物提取法，来源受限，产率低。本发明建立了一种基于基因工程的吡喃糖氧化酶生产方法，通过密码子优化核酸序列，使得其适应大肠杆菌表达系统，生产周期短、产量高且产物稳定性好，本发明还通过可溶性标签的配合，使得产物可溶性好，易于分离纯化。

本发明的一些实施方式中提供了一种编码吡喃糖氧化酶的分离的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；

(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明的另一些实施方式中提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达His×6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3’端连接有表达His×6标签的多核苷酸序列。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明的另一些实施方式中提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明的另一些实施方式中提供了一种制备吡喃糖氧化酶的方法，所述方法包括步骤：

培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

分离所述目的蛋白，即得所述吡喃糖氧化酶；

其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一些优选的方案中，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。

在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括使用Ni-NTA柱洗脱，收集目的蛋白洗脱液。

在一些优选的方案中，将所述目的蛋白洗脱液使用HisTrapTM QHP和AKTA Pure柱洗脱，并收集目的蛋白洗脱液。

本发明的另一些实施方式中提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者

如本发明第二方面提供的表达载体；或者

如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

或者根据本发明第四方面所述的方法制备的吡喃糖氧化酶。

在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，“”)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。

如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。

本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。

如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。

如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。

如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。举例来说，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。

如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。

如本文中所用的，术语“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。优选为原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞。

如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。

如本文中所用的，术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的多肽的片段，所述目的多肽可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。表达载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。表达载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。

如本文中所用的，术语“表达系统”包括含有宿主和目的基因的载体，并且使能够达到宿主中目的基因表达目的的系统，具体地，通过含有编码目标蛋白质的外来基因的载体，筛选成功转染的重组宿主细胞。表达系统分为真核生物表达系统和原核生物表达系统，本文的一个优选例中选择原核生物表达系统。原核生物的表达系统具有宿主细菌的快速增殖，简单的培养，方便的操作，廉价的价格，明确的遗传背景，安全的遗传基因，高蛋白质的表达水平等特征。然而，原核生物的表达系统无法控制表达时间和表达水平。另外，在原核生物的表达系统中，由于表达产物有可能作为封入体存在，因此生物活性较低，翻译后处理及修饰系统不完整(例如，不能进行糖基化修饰)。

【目的蛋白的制备】

本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。

实施例1、大肠杆菌同一密码子偏好性优化和质粒的构建

以NCBI提供的淡黄褐栓菌吡喃糖氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2所示)为参考，结合本发明的试验设计要求，经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后(优化后的碱基序列如SEQ ID NO:1(3)所示)，连接载体为ps28a，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

SEQ ID NO:1：

ATGTCTACAAGCAGTTCAGATCCCTTCTTTAACTTTGCAAAAAGCAGCTTTCGTAGCGCGGCTGCCCAAAAGGCGAGTGCCAGCAGCCTGCCGCCATTACCGGGTCCGGACAAGAAAGTGCCGGGTATGGATATCAAGTATGATGTTGTTATCGTTGGCTCTGGCCCGATTGGCTGCACCTACGCAAGAGAACTGGTCGGTGCGGGCTATAAAGTCGCAATGTTCGACATAGGTGAAATCGACAGCGGTTTGAAAATCGGCGCGCACAAAAAAAACACCGTCGAGTACCAGAAGAACATTGACAAATTTGTGAACGTTATTCAGGGTCAACTGATGTCCGTTAGCGTTCCGGTTAACACTCTCGTGGTTGATACCCTGAGTCCGACGAGCTGGCAGGCATCGACCTTCTTCGTGCGCAATGGTAGCAATCCGGAACAAGATCCGCTGCGTAACCTGAGCGGCCAGGCCGTGACCCGCGTGGTGGGCGGTATGTCCACCCATTGGACCTGTGCAACTCCGCGTTTTGACCGCGAGCAGCGTCCGTTGCTGGTTAAAGATGATGCCGATGCGGACGACGCGGAATGGGATAGACTGTATACCAAAGCGGAGAGCTACTTCCAAACCGGTACAGACCAGTTTAAGGAGTCCATCCGTCATAATTTGGTTTTGAATAAGCTGACTGAAGAGTACAAGGGTCAACGTGATTTTCAACAAATTCCGTTGGCTGCGACTCGTCGTAGCCCGACGTTCGTGGAGTGGAGCAGCGCCAATACGGTGTTCGACCTGCAGAATCGTCCGAACACCGACGCTCCGGAAGAGCGCTTCAACCTGTTTCCGGCAGTTGCGTGTGAGCGTGTGGTTCGCAACGCTCTGAACTCGGAAATTGAATCCTTGCACATCCACGATCTGATCAGCGGTGATCGTTTCGAGATCAAGGCAGACGTTTATGTACTGACCGCGGGCGCGGTTCATAACACCCAATTGTTGGTCAACTCCGGCTTCGGTCAGCTGGGTCGTCCGAATCCGGCGAATCCTCCGGAGTTGTTACCGTCCCTGGGCTCTTACATCACCGAGCAGAGCCTGGTGTTCTGCCAGACCGTGATGTCCACGGAACTTATCGACTCGGTCAAGTCCGATATGACCATTCGTGGTACCCCGGGCGAACTGACATATAGCGTGACGTACACCCCGGGCGCTAGCACGAACAAACACCCGGATTGGTGGAATGAAAAAGTGAAGAATCACATGATGCAGCATCAGGAGGATCCGCTGCCCATCCCGTTTGAGGACCCCGAGCCGCAAGTTACCACTCTTTTTCAACCGAGCCATCCGTGGCACACCCAGATTCACCGCGATGCGTTTAGCTACGGCGCGGTGCAGCAAAGCATTGACTCTCGCTTAATTGTGGACTGGCGTTTCTTTGGCCGTACGGAACCGAAAGAGGAGAACAAACTGTGGTTCTCTGATAAGATTACCGATGCGTATAATATGCCGCAACCGACCTTTGACTTCCGCTTCCCGGCTGGTCGTACCTCAAAAGAAGCGGAAGACATGATGACCGACATGTGCGTGATGTCTGCGAAAATCGGCGGTTTCCTGCCGGGCAGCCTGCCACAATTTATGGAACCGGGGCTGGTTCTGCACCTGGGTGGCACCCACCGCATGGGTTTCGACGAAAAGGAGGACAACTGCTGCGTTAACACGGATTCTCGTGTTTTTGGTTTCAAGAACCTCTTCTTGGGCGGTTGCGGTAACATCCCGACGGCGTATGGTGCGAACCCGACCCTAACGGCTATGTCTCTCGCAATTAAGAGCTGTGAATACATCAAGCAGAACTTCACCCCAAGCCCATTTACCAGCGAGGCTCAGTAA

SEQ ID NO:3：

CATATGTCTACAAGCAGTTCAGATCCCTTCTTTAACTTTGCAAAAAGCAGCTTTCGTAGCGCGGCTGCCCAAAAGGCGAGTGCCAGCAGCCTGCCGCCATTACCGGGTCCGGACAAGAAAGTGCCGGGTATGGATATCAAGTATGATGTTGTTATCGTTGGCTCTGGCCCGATTGGCTGCACCTACGCAAGAGAACTGGTCGGTGCGGGCTATAAAGTCGCAATGTTCGACATAGGTGAAATCGACAGCGGTTTGAAAATCGGCGCGCACAAAAAAAACACCGTCGAGTACCAGAAGAACATTGACAAATTTGTGAACGTTATTCAGGGTCAACTGATGTCCGTTAGCGTTCCGGTTAACACTCTCGTGGTTGATACCCTGAGTCCGACGAGCTGGCAGGCATCGACCTTCTTCGTGCGCAATGGTAGCAATCCGGAACAAGATCCGCTGCGTAACCTGAGCGGCCAGGCCGTGACCCGCGTGGTGGGCGGTATGTCCACCCATTGGACCTGTGCAACTCCGCGTTTTGACCGCGAGCAGCGTCCGTTGCTGGTTAAAGATGATGCCGATGCGGACGACGCGGAATGGGATAGACTGTATACCAAAGCGGAGAGCTACTTCCAAACCGGTACAGACCAGTTTAAGGAGTCCATCCGTCATAATTTGGTTTTGAATAAGCTGACTGAAGAGTACAAGGGTCAACGTGATTTTCAACAAATTCCGTTGGCTGCGACTCGTCGTAGCCCGACGTTCGTGGAGTGGAGCAGCGCCAATACGGTGTTCGACCTGCAGAATCGTCCGAACACCGACGCTCCGGAAGAGCGCTTCAACCTGTTTCCGGCAGTTGCGTGTGAGCGTGTGGTTCGCAACGCTCTGAACTCGGAAATTGAATCCTTGCACATCCACGATCTGATCAGCGGTGATCGTTTCGAGATCAAGGCAGACGTTTATGTACTGACCGCGGGCGCGGTTCATAACACCCAATTGTTGGTCAACTCCGGCTTCGGTCAGCTGGGTCGTCCGAATCCGGCGAATCCTCCGGAGTTGTTACCGTCCCTGGGCTCTTACATCACCGAGCAGAGCCTGGTGTTCTGCCAGACCGTGATGTCCACGGAACTTATCGACTCGGTCAAGTCCGATATGACCATTCGTGGTACCCCGGGCGAACTGACATATAGCGTGACGTACACCCCGGGCGCTAGCACGAACAAACACCCGGATTGGTGGAATGAAAAAGTGAAGAATCACATGATGCAGCATCAGGAGGATCCGCTGCCCATCCCGTTTGAGGACCCCGAGCCGCAAGTTACCACTCTTTTTCAACCGAGCCATCCGTGGCACACCCAGATTCACCGCGATGCGTTTAGCTACGGCGCGGTGCAGCAAAGCATTGACTCTCGCTTAATTGTGGACTGGCGTTTCTTTGGCCGTACGGAACCGAAAGAGGAGAACAAACTGTGGTTCTCTGATAAGATTACCGATGCGTATAATATGCCGCAACCGACCTTTGACTTCCGCTTCCCGGCTGGTCGTACCTCAAAAGAAGCGGAAGACATGATGACCGACATGTGCGTGATGTCTGCGAAAATCGGCGGTTTCCTGCCGGGCAGCCTGCCACAATTTATGGAACCGGGGCTGGTTCTGCACCTGGGTGGCACCCACCGCATGGGTTTCGACGAAAAGGAGGACAACTGCTGCGTTAACACGGATTCTCGTGTTTTTGGTTTCAAGAACCTCTTCTTGGGCGGTTGCGGTAACATCCCGACGGCGTATGGTGCGAACCCGACCCTAACGGCTATGTCTCTCGCAATTAAGAGCTGTGAATACATCAAGCAGAACTTCACCCCAAGCCCATTTACCAGCGAGGCTCAGTAACTCGAG

SEQ ID NO:2：

MSTSSSDPFFNFAKSSFRSAAAQKASASSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARELVGAGYKVAMFDIGEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLMSVSVPVNTLVVDTLSPTSWQASTFFVRNGSNPEQDPLRNLSGQAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDADADDAEWDRLYTKAESYFQTGTDQFKESIRHNLVLNKLTEEYKGQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDLQNRPNTDAPEERFNLFPAVACERVVRNALNSEIESLHIHDLISGDRFEIKADVYVLTAGAVHNTQLLVNSGFGQLGRPNPANPPELLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMTIRGTPGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLPIPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQQSIDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDAYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMSAKIGGFLPGSLPQFMEPGLVLHLGGTHRMGFDEKEDNCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANPTLTAMSLAIKSCEYIKQNFTPSPFTSEAQ

取1μL表达质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置30min，42℃水浴45s，立刻冰上放置2min，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、230rpm振荡培养45min。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。

实施例2、目的蛋白(吡喃糖氧化酶)的表达

挑取实施例1中制备的单克隆，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的TB培养基中，37℃220rpm/min振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，0.1mM IPTG进行诱导，分别放置于37℃和18℃振荡培养过夜。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，图1结果显示在18℃条件下，在LB培养基中出现大量蛋白可溶性表达。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1。

根据图1，在18℃条件下，在LB培养基中出现大量蛋白可溶性表达。

实施例3、目的蛋白Ni柱纯化

按照下表1配制缓冲液。

表1

4g菌体超声破碎后，0.22μm过膜，用1mL Ni-NTA纯化。流速为0.5mL/min，上样完成使用20mL Lysis Buffer冲洗Ni亲和柱使UV和电导至基线。洗脱程序包括：Step 1:0％B,8xCV，1mL/min；Step 2:0—60％B，20xCV，1mL/min；Step 3:100％B,8xCV，1mL/min。纯化取样后电泳图见图2。

图2中，1-7分别为粗品、穿透液、不同BufferB浓度的洗脱液。其中，较多的样品在穿透液中，少量样品挂上了柱子。将收集3号洗脱收集液附近的洗脱液共13mL，电导为8.25ms/cm。

使用1mL HisTrapTM QHP,AKTA Pure进行离子柱纯化，上样前，用buffer A平衡柱子，待柱子平衡后，进行纯化。洗脱程序包括：Step 1:0-60％B，20CV,1mL/min；Step 3:100％B,10CV,1mL/min。收样后电泳结果如下图3。

图3中，1-10分别为亲和主峰、穿透液、不同Buffer B浓度的洗脱液。从电泳结果得知样品没有穿出来，基本都挂上了柱子；19％Buffer B左右时开始洗脱，100％Buffer B洗脱出的样品可能是核酸。取离子7、8样品混匀，共收到2mL，分装至1mL/管，然后进行BCA浓度测定，得到R

实施例4、重组吡喃糖氧化酶活性测定

步骤1，溶液配制

1M D-葡萄糖溶液：称取1.8g D-葡萄糖，加去离子水定容至10mL。

100mM磷酸钾缓冲液：分别称取0.435g磷酸氢二钾粉末和0.34g磷酸二氢钾粉末溶于50mL去离子水中，3.81mL磷酸氢二钾溶液和6.19mL磷酸二氢钾混合，pH 6.6。

0.01M ATBS溶液：称取0.055g ATBS粉末，加入5mL 100mM磷酸钾缓冲液，去离子水定容至10mL。

5ml工作液按照下表2配制：

表2

步骤2，溶液配制

阳性酶的配置：将250U阳性酶溶于1mL PBS pH 7.4缓冲液(含50％甘油)中，制成0.25U/μL的酶液，按照梯度再逐步稀释，稀释液为PBS pH 7.4缓冲液。

酶标仪预热30min。

在96孔酶标板中加入100μL工作液，在420nm处测定OD值A1，随后加入各浓度酶1μL，反应1min，在420nm处测定OD值A2。

以酶浓度为X轴，对应的吸光值为Y轴绘制标准曲线，吡喃糖氧化酶标准曲线结果如图4所示。计算A2-A1。

将实施例中制备的吡喃糖氧化酶按照上述方法测吸光度，结果如下表3：

表3

原液浓度为0.687mg/mL，活性为0.0079U/uL，因此比活力为(0.0079×1000)/0.687＝11.49

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州达安基因股份有限公司

<120> 重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用

<130> P210840-1CNCNA9

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1872

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgtctacaa gcagttcaga tcccttcttt aactttgcaa aaagcagctt tcgtagcgcg 60

gctgcccaaa aggcgagtgc cagcagcctg ccgccattac cgggtccgga caagaaagtg 120

ccgggtatgg atatcaagta tgatgttgtt atcgttggct ctggcccgat tggctgcacc 180

tacgcaagag aactggtcgg tgcgggctat aaagtcgcaa tgttcgacat aggtgaaatc 240

gacagcggtt tgaaaatcgg cgcgcacaaa aaaaacaccg tcgagtacca gaagaacatt 300

gacaaatttg tgaacgttat tcagggtcaa ctgatgtccg ttagcgttcc ggttaacact 360

ctcgtggttg ataccctgag tccgacgagc tggcaggcat cgaccttctt cgtgcgcaat 420

ggtagcaatc cggaacaaga tccgctgcgt aacctgagcg gccaggccgt gacccgcgtg 480

gtgggcggta tgtccaccca ttggacctgt gcaactccgc gttttgaccg cgagcagcgt 540

ccgttgctgg ttaaagatga tgccgatgcg gacgacgcgg aatgggatag actgtatacc 600

aaagcggaga gctacttcca aaccggtaca gaccagttta aggagtccat ccgtcataat 660

ttggttttga ataagctgac tgaagagtac aagggtcaac gtgattttca acaaattccg 720

ttggctgcga ctcgtcgtag cccgacgttc gtggagtgga gcagcgccaa tacggtgttc 780

gacctgcaga atcgtccgaa caccgacgct ccggaagagc gcttcaacct gtttccggca 840

gttgcgtgtg agcgtgtggt tcgcaacgct ctgaactcgg aaattgaatc cttgcacatc 900

cacgatctga tcagcggtga tcgtttcgag atcaaggcag acgtttatgt actgaccgcg 960

ggcgcggttc ataacaccca attgttggtc aactccggct tcggtcagct gggtcgtccg 1020

aatccggcga atcctccgga gttgttaccg tccctgggct cttacatcac cgagcagagc 1080

ctggtgttct gccagaccgt gatgtccacg gaacttatcg actcggtcaa gtccgatatg 1140

accattcgtg gtaccccggg cgaactgaca tatagcgtga cgtacacccc gggcgctagc 1200

acgaacaaac acccggattg gtggaatgaa aaagtgaaga atcacatgat gcagcatcag 1260

gaggatccgc tgcccatccc gtttgaggac cccgagccgc aagttaccac tctttttcaa 1320

ccgagccatc cgtggcacac ccagattcac cgcgatgcgt ttagctacgg cgcggtgcag 1380

caaagcattg actctcgctt aattgtggac tggcgtttct ttggccgtac ggaaccgaaa 1440

gaggagaaca aactgtggtt ctctgataag attaccgatg cgtataatat gccgcaaccg 1500

acctttgact tccgcttccc ggctggtcgt acctcaaaag aagcggaaga catgatgacc 1560

gacatgtgcg tgatgtctgc gaaaatcggc ggtttcctgc cgggcagcct gccacaattt 1620

atggaaccgg ggctggttct gcacctgggt ggcacccacc gcatgggttt cgacgaaaag 1680

gaggacaact gctgcgttaa cacggattct cgtgtttttg gtttcaagaa cctcttcttg 1740

ggcggttgcg gtaacatccc gacggcgtat ggtgcgaacc cgaccctaac ggctatgtct 1800

ctcgcaatta agagctgtga atacatcaag cagaacttca ccccaagccc atttaccagc 1860

gaggctcagt aa 1872

<210> 2

<211> 623

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Phe Phe Asn Phe Ala Lys Ser Ser

1 5 1015

Phe Arg Ser Ala Ala Ala Gln Lys Ala Ser Ala Ser Ser Leu Pro Pro

202530

Leu Pro Gly Pro Asp Lys Lys Val Pro Gly Met Asp Ile Lys Tyr Asp

354045

Val Val Ile Val Gly Ser Gly Pro Ile Gly Cys Thr Tyr Ala Arg Glu

505560

Leu Val Gly Ala Gly Tyr Lys Val Ala Met Phe Asp Ile Gly Glu Ile

65707580

Asp Ser Gly Leu Lys Ile Gly Ala His Lys Lys Asn Thr Val Glu Tyr

859095

Gln Lys Asn Ile Asp Lys Phe Val Asn Val Ile Gln Gly Gln Leu Met

100 105 110

Ser Val Ser Val Pro Val Asn Thr Leu Val Val Asp Thr Leu Ser Pro

115 120 125

Thr Ser Trp Gln Ala Ser Thr Phe Phe Val Arg Asn Gly Ser Asn Pro

130 135 140

Glu Gln Asp Pro Leu Arg Asn Leu Ser Gly Gln Ala Val Thr Arg Val

145 150 155 160

Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ala Thr Pro Arg Phe Asp

165 170 175

Arg Glu Gln Arg Pro Leu Leu Val Lys Asp Asp Ala Asp Ala Asp Asp

180 185 190

Ala Glu Trp Asp Arg Leu Tyr Thr Lys Ala Glu Ser Tyr Phe Gln Thr

195 200 205

Gly Thr Asp Gln Phe Lys Glu Ser Ile Arg His Asn Leu Val Leu Asn

210 215 220

Lys Leu Thr Glu Glu Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Phe Gln Gln Ile Pro

225 230 235 240

Leu Ala Ala Thr Arg Arg Ser Pro Thr Phe Val Glu Trp Ser Ser Ala

245 250 255

Asn Thr Val Phe Asp Leu Gln Asn Arg Pro Asn Thr Asp Ala Pro Glu

260 265 270

Glu Arg Phe Asn Leu Phe Pro Ala Val Ala Cys Glu Arg Val Val Arg

275 280 285

Asn Ala Leu Asn Ser Glu Ile Glu Ser Leu His Ile His Asp Leu Ile

290 295 300

Ser Gly Asp Arg Phe Glu Ile Lys Ala Asp Val Tyr Val Leu Thr Ala

305 310 315 320

Gly Ala Val His Asn Thr Gln Leu Leu Val Asn Ser Gly Phe Gly Gln

325 330 335

Leu Gly Arg Pro Asn Pro Ala Asn Pro Pro Glu Leu Leu Pro Ser Leu

340 345 350

Gly Ser Tyr Ile Thr Glu Gln Ser Leu Val Phe Cys Gln Thr Val Met

355 360 365

Ser Thr Glu Leu Ile Asp Ser Val Lys Ser Asp Met Thr Ile Arg Gly

370 375 380

Thr Pro Gly Glu Leu Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Pro Gly Ala Ser

385 390 395 400

Thr Asn Lys His Pro Asp Trp Trp Asn Glu Lys Val Lys Asn His Met

405 410 415

Met Gln His Gln Glu Asp Pro Leu Pro Ile Pro Phe Glu Asp Pro Glu

420 425 430

Pro Gln Val Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ser His Pro Trp His Thr Gln

435 440 445

Ile His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gln Gln Ser Ile Asp

450 455 460

Ser Arg Leu Ile Val Asp Trp Arg Phe Phe Gly Arg Thr Glu Pro Lys

465 470 475 480

Glu Glu Asn Lys Leu Trp Phe Ser Asp Lys Ile Thr Asp Ala Tyr Asn

485 490 495

Met Pro Gln Pro Thr Phe Asp Phe Arg Phe Pro Ala Gly Arg Thr Ser

500 505 510

Lys Glu Ala Glu Asp Met Met Thr Asp Met Cys Val Met Ser Ala Lys

515 520 525

Ile Gly Gly Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Phe Met Glu Pro Gly

530 535 540

Leu Val Leu His Leu Gly Gly Thr His Arg Met Gly Phe Asp Glu Lys

545 550 555 560

Glu Asp Asn Cys Cys Val Asn Thr Asp Ser Arg Val Phe Gly Phe Lys

565 570 575

Asn Leu Phe Leu Gly Gly Cys Gly Asn Ile Pro Thr Ala Tyr Gly Ala

580 585 590

Asn Pro Thr Leu Thr Ala Met Ser Leu Ala Ile Lys Ser Cys Glu Tyr

595 600 605

Ile Lys Gln Asn Phe Thr Pro Ser Pro Phe Thr Ser Glu Ala Gln

610 615 620

<210> 3

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

catatgtcta caagcagttc agatcccttc tttaactttg caaaaagcag ctttcgtagc 60

gcggctgccc aaaaggcgag tgccagcagc ctgccgccat taccgggtcc ggacaagaaa 120

gtgccgggta tggatatcaa gtatgatgtt gttatcgttg gctctggccc gattggctgc 180

acctacgcaa gagaactggt cggtgcgggc tataaagtcg caatgttcga cataggtgaa 240

atcgacagcg gtttgaaaat cggcgcgcac aaaaaaaaca ccgtcgagta ccagaagaac 300

attgacaaat ttgtgaacgt tattcagggt caactgatgt ccgttagcgt tccggttaac 360

actctcgtgg ttgataccct gagtccgacg agctggcagg catcgacctt cttcgtgcgc 420

aatggtagca atccggaaca agatccgctg cgtaacctga gcggccaggc cgtgacccgc 480

gtggtgggcg gtatgtccac ccattggacc tgtgcaactc cgcgttttga ccgcgagcag 540

cgtccgttgc tggttaaaga tgatgccgat gcggacgacg cggaatggga tagactgtat 600

accaaagcgg agagctactt ccaaaccggt acagaccagt ttaaggagtc catccgtcat 660

aatttggttt tgaataagct gactgaagag tacaagggtc aacgtgattt tcaacaaatt 720

ccgttggctg cgactcgtcg tagcccgacg ttcgtggagt ggagcagcgc caatacggtg 780

ttcgacctgc agaatcgtcc gaacaccgac gctccggaag agcgcttcaa cctgtttccg 840

gcagttgcgt gtgagcgtgt ggttcgcaac gctctgaact cggaaattga atccttgcac 900

atccacgatc tgatcagcgg tgatcgtttc gagatcaagg cagacgttta tgtactgacc 960

gcgggcgcgg ttcataacac ccaattgttg gtcaactccg gcttcggtca gctgggtcgt 1020

ccgaatccgg cgaatcctcc ggagttgtta ccgtccctgg gctcttacat caccgagcag 1080

agcctggtgt tctgccagac cgtgatgtcc acggaactta tcgactcggt caagtccgat 1140

atgaccattc gtggtacccc gggcgaactg acatatagcg tgacgtacac cccgggcgct 1200

agcacgaaca aacacccgga ttggtggaat gaaaaagtga agaatcacat gatgcagcat 1260

caggaggatc cgctgcccat cccgtttgag gaccccgagc cgcaagttac cactcttttt 1320

caaccgagcc atccgtggca cacccagatt caccgcgatg cgtttagcta cggcgcggtg 1380

cagcaaagca ttgactctcg cttaattgtg gactggcgtt tctttggccg tacggaaccg 1440

aaagaggaga acaaactgtg gttctctgat aagattaccg atgcgtataa tatgccgcaa 1500

ccgacctttg acttccgctt cccggctggt cgtacctcaa aagaagcgga agacatgatg 1560

accgacatgt gcgtgatgtc tgcgaaaatc ggcggtttcc tgccgggcag cctgccacaa 1620

tttatggaac cggggctggt tctgcacctg ggtggcaccc accgcatggg tttcgacgaa 1680

aaggaggaca actgctgcgt taacacggat tctcgtgttt ttggtttcaa gaacctcttc 1740

ttgggcggtt gcggtaacat cccgacggcg tatggtgcga acccgaccct aacggctatg 1800

tctctcgcaa ttaagagctg tgaatacatc aagcagaact tcaccccaag cccatttacc 1860

agcgaggctc agtaactcga g 1881