嗜粘蛋白阿克曼菌在制备有机硒中的应用和生物制剂及药物

技术领域

本发明涉及微生物技术，具体地，涉及一种嗜粘蛋白阿克曼菌在制备有机硒中的应用和生物制剂及药物。

背景技术

嗜粘蛋白阿克曼菌是人类肠道微生物群中最丰富的菌种之一(占细菌总数的0.5％-5％)，能够以粘蛋白为唯一的碳、氮和能量来源。嗜粘蛋白阿克曼菌自从发现以来，在人类代谢健康和疾病治疗中的作用得到了广泛的研究，被称为“下一代益生菌”。近年来，人们发现嗜粘蛋白阿克曼菌具有预防和改善肥胖、糖尿病、代谢综合征、炎症、衰老、结肠癌、神经退行性疾病等多种有益作用，因此应用前景十分广阔。

硒是动物和人体必需的微量元素，广泛存在于人体各组织内。已有研究表明，人体缺硒会引起癌症、艾滋病、心血管疾病、肝脏和胰脏疾病、高血压、糖尿病、贫血、克山病、大骨节病等病症。硒的重要生理作用是增强人体免疫能力和抗氧化能力，良好的硒状态可维持人的免疫活性和正常的氧化还原调控能力，这也是硒用来治疗预防各种疾病的作用基础。然而，由于无机硒的吸收和利用不够理想，其生物有效性低、毒性较大，中毒量与需要量之间范围小，因此被严格控制使用。有机硒安全性高，不易发生中毒，易被人体吸收利用，补硒效率高，因此被广泛应用。

因此，急需研制高效、无毒副作用的有机硒制品，满足全民的需要，而嗜粘蛋白阿克曼菌是否具备生成有机硒的能力还未有探究。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供嗜粘蛋白阿克曼菌在制备有机硒中的应用和生物制剂及药物，利用嗜粘蛋白阿克曼菌有效将无机硒转化为有机硒，提升预防或辅助治疗肿瘤疾病的效果。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)在将无机硒转化为有机硒中的应用。

优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保藏编号为ATCC BAA-835。

优选地，所述无机硒为亚硒酸盐，更优选为亚硒酸钠和/或亚硒酸钾。

优选地，所述有机硒为有机硒蛋白，更优选为硒代蛋氨酸。

本发明第二方面提供一种将无机硒转化为有机硒的方法，该方法包括以下步骤：将嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)进行发酵培养，并在所述发酵培养的过程中加入所述无机硒。

优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保藏编号为ATCC BAA-835。

优选地，所述发酵培养采用的发酵培养基含有：蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠。

优选地，所述发酵培养基含有：蛋白胨8-12g/L、脱水小牛脑浸粉10-15g/L、脱水牛心浸粉3-8g/L、氯化钠3-8g/L、葡萄糖1-3g/L、磷酸氢二钠1-3.5g/L。

优选地，所述发酵培养的条件至少包括：厌氧培养，温度为30-40℃，时间为96-120h。

优选地，所述无机硒的加入时间为所述发酵培养开始后72-96h，更优选为72-84h。

优选地，所述无机硒以水溶液的形式加入，所述无机硒加入的终浓度为40-80μg/mL。

优选地，所述无机硒为亚硒酸盐，更优选为亚硒酸钠和/或亚硒酸钾。

优选地，所述有机硒为有机硒蛋白，更优选为硒代蛋氨酸。

本发明第三方面提供一种生物制剂，该制剂含有上述的方法获得的嗜粘蛋白阿克曼菌发酵液和/或嗜粘蛋白阿克曼菌菌体。

本发明第四方面提供一种用于治疗肿瘤疾病的药物，该药物含有上述的生物制剂。

优选地，所述肿瘤疾病为结肠癌。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供了嗜粘蛋白阿克曼菌在将无机硒转化为有机硒中的应用，能够利用嗜粘蛋白阿克曼菌的生长代谢过程，将无机硒有效转化为有机硒，转化率高，且工艺简单、操作简便、安全可靠，可用于制备富硒乳制品、特医食品、药品或保健品；在此基础上，基于嗜粘蛋白阿克曼菌本身具有的特性，与其转化形成的有机硒相结合，获得兼具嗜粘蛋白阿克曼菌和有机硒的双重生物学功能的制剂，能够显著杀伤结肠癌细胞CT26，对Caco-2具有优异的粘附性，使得该制剂既可作为防治结肠癌的功能性食品添加剂、临床特医食品的辅助制剂，又可作为防治地方性缺硒症的功能性调节剂，在预防或辅助治疗结肠癌等肿瘤疾病领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例7中不同亚硒酸钠终浓度下Se-AM发酵液的颜色图；

图2是实施例7中不同亚硒酸钠终浓度下Se-AM菌体中硒含量的结果图；

图3是实施例3得到的Se-AM菌体与对比例1得到的AM菌体的FTIR光谱分析图；

图4是实施例3得到的Se-AM菌体与对比例1得到的AM菌体FTIR光谱对比图；

图5是实施例3得到的Se-AM菌体与对比例1得到的AM菌体在不同pH下的存活率图；

图6是实施例7中不同亚硒酸钠培养下Se-AM菌体的抗氧化酶活性图；

图7是实施例3得到的Se-AM菌液与对比例1得到的AM菌液对Caco-2细胞的黏附率图；

图8是实施例3得到的Se-AM菌液与对比例1得到的AM菌液对应的发酵上清液及菌体裂解液对CT26的细胞毒性实验图；

图9是实施例3得到的Se-AM菌液与对比例1得到的AM菌液对应的发酵上清液及菌体裂解液处理下CT26细胞的形态图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)在将无机硒转化为有机硒中的应用。

本发明的发明人在研究过程中，意外地发现，在嗜粘蛋白阿克曼菌的培养过程中添加无机硒，能够利用嗜粘蛋白阿克曼菌的生长代谢过程将无机硒有效转化为有机硒，且转化率高，安全可靠，可用于制备富硒乳制品、特医食品、药品或保健品；同时得到的嗜粘蛋白阿克曼菌发酵液或者菌体兼具嗜粘蛋白阿克曼菌和有机硒的双重生物学功能，既可作为防治结肠癌的功能性食品添加剂、临床特医食品的辅助制剂，又可作为防治地方性缺硒症的功能性调节剂。

根据本发明，优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保藏编号为Akkermansiamuciniphila ATCC BAA-835，可直接购买自美国菌种保藏中心(ATCC)，也可以购买自德国微生物菌种保藏中心，编号为DSM 22959。

根据本发明，所述无机硒可以采用任意一种含硒元素的无机化合物，优选地，所述无机硒为亚硒酸盐，更优选为亚硒酸钠和/或亚硒酸钾。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于提高嗜粘蛋白阿克曼菌对无机硒的转化效率。

根据本发明，优选地，所述有机硒为有机硒蛋白，更优选为硒代蛋氨酸。采用反相离子对液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)检测，嗜粘蛋白阿克曼菌转化无机硒后形成的有机硒成分主要为具有高营养价值的硒代蛋氨酸(SeMet)。

本发明第二方面提供一种将无机硒转化为有机硒的方法，该方法包括以下步骤：将嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)进行发酵培养，并在所述发酵培养的过程中加入所述无机硒。

本发明提供的将无机硒转化为有机硒的方法，在嗜粘蛋白阿克曼菌的发酵培养过程中添加无机硒，以利用嗜粘蛋白阿克曼菌的生长代谢将无机硒转化为有机硒，工艺简单、操作简便，有利于该方法过程的大规模开发与应用。

根据本发明，优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保藏编号为ATCC BAA-835。

本发明中，所述发酵培养的过程可以采用嗜粘蛋白阿克曼菌常规的培养基及培养方式，以提供嗜粘蛋白阿克曼菌生长增殖所需的营养成分及温度、时间等条件，实现嗜粘蛋白阿克曼菌的生长增殖，进而将无机硒转化为有机硒。所述发酵培养优选为以嗜粘蛋白阿克曼菌经活化、种子培养获得的种子液进行接种，接种量为3-8体积％。

本发明中，所述活化、种子培养的过程可以采用常规的嗜粘蛋白阿克曼菌活化及种子培养的过程，例如，将嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌种按照0.5-2体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30-40℃的条件下进行活化培养20-30h得到活化培养液；将活化培养液按照1-3体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30-40℃的条件下进行种子培养18-30h，培养结束后得到种子液。

本发明中，活化、种子培养、发酵培养采用的培养基一般情况下含有碳源、氮源、无机盐等物质，优选地，所述发酵培养采用的发酵培养基含有：蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠。进一步优选地，所述发酵培养基含有：蛋白胨8-12g/L、脱水小牛脑浸粉10-15g/L、脱水牛心浸粉3-8g/L、氯化钠3-8g/L、葡萄糖1-3g/L、磷酸氢二钠1-3.5g/L。示例性地，所述发酵培养采用的发酵培养基为起始pH为7.4的BHI液体培养基。相应地，活化、种子培养采用的培养基可以采用与发酵培养基相同的配方。

上述物质可以通过商购获得。

根据本发明，优选地，所述发酵培养的条件至少包括：厌氧培养，温度为30-40℃，具体可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃，或者上述两个数值之间的任意值；时间为96-120h，具体可以为96h、100h、104h、108h、112h、116h、120h，或者上述两个数值之间的任意值。其中，厌氧培养指的是把微生物置于与分子态氧隔绝状态下所进行的培养，一般通过厌氧工作站、厌氧培养箱、厌氧培养袋等方式进行，可采用三元气体(5％ CO

根据本发明，所述无机硒可以在所述发酵培养的任意时间加入，优选地，所述无机硒的加入时间为所述发酵培养开始后72-96h，具体可以为72h、76h、80h、84h、88h、92h、96h，或者上述两个数值之间的任意值；更优选为72-84h。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于提高将无机硒转化为有机硒的效率。

根据本发明，所述无机硒可以直接加入所述发酵培养中，也可以先配置成水溶液的形式加入。优选地，所述无机硒以水溶液的形式加入，所述无机硒加入的终浓度为40-80μg/mL，具体可以为40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL，或者上述两个数值之间的任意值。其中，无机硒水溶液采用无菌去离子水或者无菌生理盐水与无机硒混合配制获得。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于提高无机硒转化为有机硒的转化率。

根据本发明，优选地，所述无机硒为亚硒酸盐，更优选为亚硒酸钠和/或亚硒酸钾。

根据本发明，优选地，所述有机硒为有机硒蛋白，更优选为硒代蛋氨酸。

根据本发明一种特别优选的实施方式，将无机硒转化为有机硒的方法包括以下步骤：

S1、将嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA-835的菌种按照0.5-2体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30-40℃的条件下进行活化培养20-30h得到活化培养液；将活化培养液按照1-3体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30-40℃的条件下进行种子培养18-30h，培养结束后得到种子液；

S2、将种子液按照3-8体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为30-40℃的条件下进行发酵培养72-96h，加入含无机硒(亚硒酸钠和/或亚硒酸钾)的水溶液使得无机硒的终浓度为40-80μg/mL，继续培养至96-120h得到富含有机硒的发酵液；

其中，种子培养基和发酵培养基分别含有：蛋白胨8-12g/L、脱水小牛脑浸粉10-15g/L、脱水牛心浸粉3-8g/L、氯化钠3-8g/L、葡萄糖1-3g/L、磷酸氢二钠1-3.5g/L。

基于嗜粘蛋白阿克曼菌自身具有能够防治结肠癌等益生菌特性，与其转化形成的有机硒相结合，可获得兼具嗜粘蛋白阿克曼菌和有机硒的双重生物学功能的制剂，能够显著杀伤结肠癌细胞CT26，对Caco-2具有优异的粘附性，本发明第三方面提供一种生物制剂，该制剂含有上述的方法获得的嗜粘蛋白阿克曼菌发酵液和/或嗜粘蛋白阿克曼菌菌体。

本发明中，可将嗜粘蛋白阿克曼菌进行发酵培养得到的发酵液直接作为生物制剂，也可以将得到的发酵液通过离心、过滤等分离方式富集获得富含有机硒的嗜粘蛋白阿克曼菌菌体作为生物制剂；该生物制剂不仅能够对结肠癌细胞起到更强力拮抗或杀伤作用，还能够补充人体所需硒元素，从资源节约型、环境友好型、生产成本低、实际操作等方面考虑，在功能食品、特医食品中具备较高的应用价值。

本发明第四方面提供一种用于治疗肿瘤疾病的药物，该药物含有上述的生物制剂。

本发明中，用于治疗肿瘤疾病的药物可含有上述的生物制剂以及药学上可接受的辅料；该药物可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、粉剂或液体剂。优选地，所述药物为治疗结肠癌或其相关疾病的药物。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，简称AM)ATCCBAA-835购买自美国菌种保存中心(ATCC)，亚硒酸钠(Na

以下实施例中，DMEM高糖培养基的配方为：4.5g/L D-葡萄糖，L-谷氨酰胺；

DMEM完全培养基的配方为：DMEM高糖培养基中加入20％南美胎牛血清，1％双抗(青霉素、链霉素)；

1640培养基的配方为：2g/L D-葡萄糖，L-谷氨酰胺；

1640完全培养基的配方为：1640培养基中加入10％南美胎牛血清，1％双抗(青霉素、链霉素)。

实施例1

种子培养基和发酵培养基的配方为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12g/L、脱水牛心浸粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，初始pH为7.4；

S1、将嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA-835的菌种按照1体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为37℃的条件下进行活化培养24h得到活化培养液；将活化培养液按照2体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为37℃的条件下进行种子培养22h，培养结束后得到种子液；

S2、将种子液按照5体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为37℃的条件下进行发酵培养76h，加入含亚硒酸钠的水溶液使得发酵培养液中亚硒酸钠的终浓度为60μg/mL，继续培养至100h得到Se-AM发酵液。

实施例2

种子培养基和发酵培养基的配方为：蛋白胨8g/L、脱水小牛脑浸粉15g/L、脱水牛心浸粉8g/L、氯化钠3g/L、葡萄糖1g/L、磷酸氢二钠1g/L，初始pH为7.2；

S1、将嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA-835的菌种按照2体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行活化培养30h得到活化培养液；将活化培养液按照1体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行种子培养30h，培养结束后得到种子液；

S2、将种子液按照8体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为40℃的条件下进行发酵培养72h，加入含亚硒酸钾的水溶液使得发酵培养液中亚硒酸钾的终浓度为40μg/mL，继续培养至96h得到Se-AM发酵液。

实施例3

种子培养基和发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L、脱水小牛脑浸粉10g/L、脱水牛心浸粉3g/L、氯化钠8g/L、葡萄糖3g/L、磷酸氢二钠3.5g/L，初始pH为7.6；

S1、将嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA-835的菌种按照0.5体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行活化培养20h得到活化培养液；将活化培养液按照3体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行种子培养20h，培养结束后得到种子液；

S2、将种子液按照3体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行发酵培养84h，加入含亚硒酸钠的水溶液使得发酵培养液中亚硒酸钠的终浓度为70μg/mL，继续培养至108h得到Se-AM发酵液。

实施例4

按照实施例3的方法进行嗜粘蛋白阿克曼菌的培养得到富含有机硒的发酵液，不同的是，将步骤S2替换为：

S2、将种子液按照3体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行发酵培养96h，加入含亚硒酸钠的水溶液使得发酵培养液中亚硒酸钠的终浓度为80μg/mL，继续培养至120h得到Se-AM发酵液。

实施例5

按照实施例3的方法进行嗜粘蛋白阿克曼菌的培养得到富含有机硒的发酵液，不同的是，将种子培养基和发酵培养基替换为：胰蛋白胨10g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L。

实施例6

按照实施例3的方法进行嗜粘蛋白阿克曼菌的培养得到富含有机硒的发酵液，不同的是，将步骤S2替换为：

S2、将种子液按照3体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行发酵培养84h，加入亚硒酸锌使得发酵培养液中亚硒酸锌的终浓度为70μg/mL，继续培养至108h得到Se-AM发酵液。

实施例7

按照实施例3的方法进行嗜粘蛋白阿克曼菌的培养得到富含有机硒的发酵液，不同的是，将发酵培养液中亚硒酸钠的终浓度分别设置为0、20、40、60、80、100μg/mL；观察各个亚硒酸钠终浓度下获得的发酵液的颜色，结果如图1所示；并将发酵液中的Se-AM菌体进行ICP-OES(采用PerkinElmer 8300)检测，进行菌体中硒含量的测定，结果如图2所示。

从图1可以看出，随着亚硒酸钠终浓度的上升，AM转化得到的红色有机硒逐渐增多；从图2可以看出，随着亚硒酸钠终浓度的上升，Se-AM菌体的硒含量逐渐增加。综合AM将无机硒转化为有机硒的能力，选择60μg/mL作为AM适宜的硒转化浓度，用于后续实验。

对比例1

种子培养基和发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L、脱水小牛脑浸粉10g/L、脱水牛心浸粉3g/L、氯化钠8g/L、葡萄糖3g/L、磷酸氢二钠3.5g/L，初始pH为7.6；

S1、将嗜粘蛋白阿克曼菌ATCC BAA-835的菌种按照0.5体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为37℃的条件下进行活化培养20h得到活化培养液；将活化培养液按照3体积％的接种量接种至种子培养基中，在厌氧、温度为37℃的条件下进行种子培养20h，培养结束后得到种子液；

S2、将种子液按照3体积％接种量接种至发酵培养基中，在厌氧、温度为30℃的条件下进行发酵培养108h，得到AM发酵液。

测试例1

将实施例1-实施例6得到的Se-AM发酵液和对比例1得到的AM发酵液，采用反相离子对液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)进行有机硒种类(有机硒主要为硒代蛋氨酸)和含量的测定，结果见表1。

表1

测试例2

2.1傅里叶红外光谱(FTIR)分析

将实施例3得到的Se-AM菌体与对比例1得到的AM菌体进行傅里叶红外光谱(FTIR)分析，结果见图3和图4。

由图3和图4可见，Se-AM的红外光谱相较于AM并未产生大的改变，AM与Se-AM在3500-3200cm

测试例3益生活性评估

3.1Se-AM菌体与AM菌体的耐酸性能比较

分别将实施例3得到的Se-AM发酵液与对比例1得到的AM发酵液接入新鲜的发酵培养液中(将新鲜的发酵培养液pH分别调节为1.5、2.0、2.5、3.0)，并设置空白对照，在温度为37℃条件下厌氧培养0h和3h后，每个pH下的发酵液各取1mL，采用梯度稀释法稀释至10

菌株存活率(％)＝[不同pH处理3h的活菌数(CFU/mL)/不同pH处理0h的活菌数(CFU/mL)]×100；

由图5可见，Se-AM菌体的耐酸性能略高于AM菌体。

3.2Se-AM菌体与AM菌体的抗氧化酶活性分析

将实施例7中不同亚硒酸钠终浓度下得到的Se-AM发酵液各取2mL，离心后，弃上清收集菌体；将菌体细胞用无菌PBS清洗3次后，采用冰水浴超声破碎细胞获得细胞破碎液，以4℃、10000r/min离心30min，取上清，采用硫氧还蛋白氧化还原酶活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)测定硫氧还蛋白氧化还原酶活性(TrxR)活性，结果见图6。

如图6所示，随着亚硒酸钠终浓度的增加，TrxR活性逐渐提高，在亚硒酸钠浓度为80μg/mL时达到峰值，之后活性降低。

3.3Se-AM菌液与AM菌液对Caco-2细胞的黏附作用

将人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞(购自美国ATCC)消化离心，用1mL实施例1中的发酵培养基重悬细胞，吸取20μL用于细胞计数，根据计数结果，用DMEM完全培养基进行稀释至20万/mL，每孔1mL接种到12孔板中；当Caco-2细胞生长至密度为50％时，轻轻弃掉培养基，用1mL PBS缓冲液清洗3次；每孔加入500μL OD＝0.2的实施例3得到的Se-AM菌液或者对比例1得到的AM菌液、500μL不加双抗的DMEM培养基，每组设置3个复孔；进行0h菌液涂板，作为对照组；将上述菌液在37℃厌氧状态下孵育细胞2h，之后弃上清，用1mL PBS缓慢清洗1遍，去除未黏附的细菌；加入200μL胰酶消化3-5min，再加入600μL不加双抗的DMEM培养基终止消化，吹打收集细胞和细菌；以6000rpm离心3min后弃上清，沉淀用1mL实施例1中的发酵培养基重悬，进行梯度稀释涂板计数；以黏附前的细菌(最开始1mL OD0.2的Se-AM菌液或AM菌液)作为对照，按照下列公式计算黏附率，结果见图7；

黏附率(％)＝(黏附后的菌落数/黏附前的菌落数)*100。

如图7所示，AM菌液对Caco-2的黏附率为1.23％，而Se-AM菌液对Caco-2的黏附率为7.05％，明显优于AM菌液，有利于Se-AM菌体在肠道中的定植，增强肠道黏膜屏障的完整性，防止有害物质的渗透和对肠道细胞的损伤，从而减少炎症反应，提高肠道健康水平。

3.4发酵上清液及菌体裂解液对CT26的细胞毒性实验

将小鼠结肠癌细胞CT26细胞消化离心，用1mL 1640完全培养基重悬细胞，吸取20uL用于细胞计数，根据计数结果，用1640完全培养基进行稀释至50000万/mL，每孔100μL接种到96孔板中；将实施例3得到的Se-AM发酵液和对比例1得到的AM发酵液离心弃上清，用不含双抗的1640培养基重悬菌体，培养24h后，以6000rpm、4℃离心5min，上清用0.22μm滤膜过滤备用(将Se-AM发酵液对应的上清称为SeAM-CFCS，将AM发酵液对应的上清称为AM-CFCS)；沉淀经无菌水重悬后在冰水浴条件下用超声细胞破碎仪破碎菌体细胞之后，以8000rpm、4℃离心5min并用PBS重悬备用(将Se-AM发酵液对应的重悬液称为Se-AM破碎菌体，将AM发酵液对应的重悬液称为AM破碎菌体)。

当CT26细胞生长至密度为70％时，轻轻弃掉培养基，用PBS缓冲液清洗3次，将上述得到的AM-CFCS、SeAM-CFCS、AM破碎菌体、Se-AM破碎菌体用1640完全培养基进行2倍梯度稀释后加入CT26细胞中，并设置空白对照(PC)，每个浓度设置6个平行，48h后弃上清，PBS缓冲液洗涤三次后以换液的形式加入含10％ CCK-8的培养基，孵育40min后测定450nm处的吸光度，结果见图8和图9。

如图8所示，Se-AM发酵上清液(SeAM-CFCS)对CT26的拮抗作用优于未富硒菌株发酵上清液(AM-CFCS)，Se-AM菌体裂解液对CT26的杀伤强于AM菌体裂解液。如图9所示，正常状态下(PC组)的CT26细胞呈现长条形或椭圆形，形成单层或多层的紧密堆积，细胞之间通过细胞间隙连接；而实验组的CT26细胞表现出形态不规则，细胞体积缩小，细胞膜泡沫化或碎裂等细胞受到严重损伤甚至坏死的状态。

结合Se-AM菌液对应的发酵上清液和菌体裂解液对CT26的细胞毒性试验，说明Se-AM菌体能更有效地定植于肠道中，发挥对结肠癌细胞的拮抗作用，从而减少结肠癌的发生与发展，为防止或治疗结肠癌的新途径提供了更有力的选择。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。