一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法及应用。

背景技术

自暗纹东方鲀和红鳍东方鲀有条件放开后，全国河鲀养殖规模迅速扩张。福建省养殖的主要品种为菊黄东方鲀和双斑东方鲀，年产量超10000 t。一般成熟季节，鱼类的精巢占体重的10%以上，每年福建养殖河鲀加工后产生的精巢有近千吨。而精巢作为还未放开食用的部位，且精巢组织气味独特，通常只能当作加工废弃物丢弃，造成环境污染和资源浪费。因此开展养殖河鲀精巢这部分加工副产物资源的高值化利用，对于提高养殖河鲀的附加值，保护环境具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法及应用，其能够有效提取菊黄东方鲀鱼精蛋白，并将其应用于养殖河鲀的加工保鲜，天然无公害。

为达到上述目的，本发明公开了一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，其包括以下步骤：

粗品提取：将菊黄东方鲀精巢干制品与NaCl溶液混匀，经离心后弃上清液，得到第一沉淀物；将第一沉淀物置于硫酸溶液静置提取，再经离心后取上清液，得到提取物；将提取物置于无水乙醇中沉淀，再经离心后弃上清液得第二沉淀物，第二沉淀物冻干后得鱼精蛋白粗品；

粗品提纯：对鱼精蛋白粗品依次进行葡聚糖凝胶层析、离子交换层析和脱盐层析，得到鱼精蛋白纯品。

优选地，粗品提取步骤中，NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，菊黄东方鲀精巢干制品与NaCl溶液的料液比（mg/mL）为1：10，菊黄东方鲀精巢干制品与NaCl溶液混合后磁力搅拌30min，于25℃温度下离心20min，离心转速为10000r/min；第一沉淀物置于其4倍体积的硫酸溶液中提取，硫酸溶液的浓度为0.6mol/L，提取温度为45℃，提取时间为2.4h，提取完成后，于25℃温度下离心15min，离心转速为6000r/min；提取物置于其4倍体积的无水乙醇中沉淀，沉淀温度4℃，沉淀时间12h，沉淀完成后，在8000r/min转速下离心20min；第二沉淀物吹风晾干后再冻干。

优选地，葡聚糖凝胶层析为：将Sephadex G-50和纯水按质量比1：10混合，置于20℃溶胀3h，再于90℃溶胀1h，用水洗涤2-3次后倒掉上清液，配成75%的溶液后装柱，使凝胶自然沉降；将检测波长调至215nm，流速为1mL/min，柱压小于1MPa；用pH5.4、25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积，待基线平稳后，将浓度为1mg/mL的鱼精蛋白粗品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后上样，进样量为mL/次；每管收集4mL，取各紫外检测峰进行坂口反应，合并相同组分，浓缩冻干存于-80℃备用。

优选地，离子交换层析为：以羧甲基为带电基团的琼脂糖凝胶作为填料，加适量蒸馏水洗涤3-4次，除去填料上附着的乙醇，pH8.0、50 mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤3次后装入层析柱；选择波长215nm，灵敏度0.5A，恒流泵流速为3mL/min，用50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积，基线平稳后，将葡聚糖凝胶层析后的鱼精蛋白粗品溶液上样，浓度为20mg/mL，进样量为5 mL/次，流速为5mL/min洗脱3个柱体积，然后用含有0.2-1.8 mol/L NaCl的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液梯度洗脱10个柱体积，设定2 min/管自动收集，坂口反应鉴定后合并相同组分。

优选地，脱盐层析为：将Sephadex G-25 Fine和纯水按质量比1：10混合，置于20℃溶胀3h，再于90℃溶胀1h，用水洗涤2-3次后倒掉上清液，配成75%的溶液后装柱，使凝胶自然沉降；设定检测波长215nm，流速5mL/min，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液平衡5个柱体积，基线平稳后，将离子交换层析后的鱼精蛋白粗品溶液上样，其浓度为1mg/mL，上样量10mL/次，流速为10mL/min，超纯水洗脱3个柱体积，设定3min/管自动收样，当电导率超过1mS/mc时停止收集，将收集到的脱盐液冻干，即鱼精蛋白纯品。

优选地，菊黄东方鲀精巢干制品的制备方法为将菊黄东方鲀精巢上附着的脂肪、腺体、粘膜和结缔组织剔除，用纯水清洗表面后沥干，再于-20℃冻藏备用。

本发明还公开了上述菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法得到的鱼精蛋白纯品在保鲜剂中的运用，且该保鲜剂用于河鲀加工产品。

优选地，保鲜剂中鱼精蛋白纯品的浓度不小于2.5mg/mL。

优选地，保鲜剂中还包括壳聚糖，且壳聚糖和鱼精蛋白纯品的质量比为1：8-15。

本发明具有以下有益效果：

本发明能够有效地从菊黄东方鲀的精巢中提取得到鱼精蛋白纯品，该鱼精蛋白纯品为三鱼精蛋白，具有较强的耐热性和抑菌作用，将其应用于冷藏河鲀鱼肉的保鲜剂，保鲜效果好且天然无公害。

附图说明

图1为菊黄东方鲀鱼精蛋白SDS-PAGE电泳图谱。

图2为菊黄东方鲀鱼精蛋白相对分子质量标准曲线。

图3为菊黄东方鲀鱼精蛋白红外光谱图。

图4为菊黄东方鲀鱼精蛋白DSC吸热峰图。

图5为鱼精蛋白抑菌圈图（金黄色葡萄球菌）。

图6为鱼精蛋白抑菌圈图（铜绿假单胞菌）。

图7为鱼精蛋白抑菌圈图（大肠杆菌）。

图8为菊黄东方鲀鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响图。

图9为菊黄东方鲀鱼精蛋白对大肠杆菌生长曲线的影响图。

图10为鱼精蛋白复配保鲜剂对暗纹东方鲀冷藏过程pH值的影响图。

图11为鱼精蛋白复配保鲜剂对暗纹东方鲀冷藏过程TVC值的影响图。

图12为鱼精蛋白复配保鲜剂对暗纹东方鲀冷藏过程TVB-N值的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明公开了一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，其包括以下步骤：

预处理：将菊黄东方鲀精巢上附着的脂肪、腺体、粘膜和结缔组织等剔除，用纯水清洗表面后沥干，再于-20℃冻藏，得到菊黄东方鲀精巢干制品。

粗品提取：将菊黄东方鲀精巢干制品与NaCl溶液混合，NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，菊黄东方鲀精巢干制品与NaCl溶液的料液比（mg/mL）为10：1。混合后，磁力搅拌30min，再于25℃温度下离心20min，离心转速为10000r/min，离心完成后，弃上清液，得到第一沉淀物。将第一沉淀物置于其4倍体积的硫酸溶液静置提取，硫酸溶液的浓度为0.6mol/L，提取温度为45℃，提取时间为2.4h，提取完成后，于25℃温度下离心15min，离心转速为6000r/min，离心后取上清液，得到提取物。将提取物置于其4倍的无水乙醇中沉淀，沉淀温度4℃，沉淀时间12h，沉淀完成后，在8000r/min转速下离心20min，弃上清液得第二沉淀物。第二沉淀物吹风晾干后再冻干得鱼精蛋白粗品（Crude pufferfish protamine，CPP）。鱼精蛋白粗品在-20℃下保存备用。

粗品提纯：对鱼精蛋白粗品依次进行葡聚糖凝胶层析、离子交换层析和脱盐层析，得到鱼精蛋白纯品。具体地：

葡聚糖凝胶层析为：将Sephadex G-50和纯水按质量比1：10混合，置于20℃溶胀3h，再于90℃溶胀1h，用水洗涤2-3次后倒掉上清液，配成75%的溶液后装柱，使凝胶自然沉降；将检测波长调至215nm，流速为1mL/min，柱压小于1MPa；用pH5.4、25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积，待基线平稳后，将1mg/mL的鱼精蛋白粗品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后上样，进样量为mL/次；每管收集4mL，取各紫外检测峰进行坂口反应，合并相同组分，浓缩冻干存于-80℃备用。

紫外光谱分析为：将浓度为1mg/mL的鱼精蛋白溶液离心、过0.45μm滤膜，滤液注入洁净的石英比色皿中，采用紫外可见分光光度计在190-400 nm波段内扫描分析。

坂口反应为：取1.5mL的离心管，按10：5：1：1的比例依次加入待测样品、10% NaOH溶液、0.2% α-萘酚和次氯酸钠溶液，充分混匀，观察溶液颜色变化；以0.1%精氨酸溶液作阳性对照。若样品中含有鱼精蛋白，则坂口反应会由无色变为红色。

离子交换层析为：以羧甲基为带电基团的琼脂糖凝胶作为填料，加适量蒸馏水洗涤3-4次，除去填料上附着的乙醇，pH8.0、50 mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤3次后装入层析柱；选择波长215nm，灵敏度0.5A，恒流泵流速为3mL/min，用50mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积，基线平稳后，将葡聚糖凝胶层析后的鱼精蛋白粗品溶液上样，浓度为20mg/mL，进样量为5 mL/次，流速为5mL/min洗脱3个柱体积，然后用含有0.2-1.8 mol/L NaCl的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液梯度洗脱10个柱体积，设定2 min/管自动收集，坂口反应鉴定后合并相同组分。

脱盐层析为：将Sephadex G-25 Fine和纯水按质量比1：10混合，置于20℃溶胀3h，再于90℃溶胀1h，用水洗涤2-3次后倒掉上清液，配成75%的溶液后装柱，使凝胶自然沉降；设定检测波长215nm，流速5mL/min，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液平衡5个柱体积，基线平稳后，将离子交换层析后的鱼精蛋白粗品溶液上样，鱼精蛋白粗品溶液浓度为1mg/mL，上样量10mL/次，流速为10mL/min，超纯水洗脱3个柱体积，设定3min/管自动收样，当电导率超过1mS/mc时停止收集，将收集到的脱盐液冻干，即鱼精蛋白纯品（Purified pufferfishprotamine，PPP）。

本发明还公开了上述菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法得到的鱼精蛋白纯品在保鲜剂中的运用，且该保鲜剂用于河鲀加工产品。保鲜剂中鱼精蛋白纯品的浓度不小于2.5mg/mL。更进一步地，保鲜剂中还包含壳聚糖，且壳聚糖和鱼精蛋白纯品的质量比为1：8-15，优选1:10。

为验证菊黄东方鲀鱼精蛋白的理化性质和抑菌作用，进行了如下实验：

一、理化性质分析

（一）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定鱼精蛋白的相对分子质量。分别将鱼精蛋白粗品（CPP）和鱼精蛋白纯品（PPP）配制成浓度为1mg/mL的蛋白溶液，与染色剂按3:1的体积比混合，在95℃以上金属浴加热10min，12000r/min离心5min，取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶12.5%，浓缩胶5%），其中，上样量8μL，在恒压条件（浓缩胶80 V，分离胶120V）下共电泳1.5 h，标准蛋白分子量为14.3-97.2 KDa。电泳结束用考马斯亮蓝R-250染色4h，脱色液脱色至胶片背景完全透明，用凝胶成像仪扫描分析。测量迁移距离，计算相对迁移率（R

R

结果如图1所示，从图1中可以看出，纯化前后的河鲀鱼精蛋白均出现2个明显的蛋白条带，以标准蛋白相对分子质量的对数（lg Mw）为纵坐标，相对迁移率（Rf）为横坐标，进行直线回归分析，如图2所示，回归系数为R2=0.9930，回归方程为y =－1.016 x＋2.085，由此计算得出2个蛋白条带的相对分子质量分别为28.55 KDa和25.64 KDa。对比CPP和PPP泳道，PPP泳道背景更清晰，条带无明显拖尾现象，而CPP泳道除了2条较为明显的蛋白条带外，还出现淡淡的多个条带，也有明显的拖尾现象。因此，说明CPP经纯化过程有效去除其中的杂蛋白等成分，得到的鱼精蛋白较纯。

（二）、茚三酮柱后衍生离子交换色谱法分析

参照GB 5009.124－2016，采用茚三酮柱后衍生离子交换色谱法对河鲀鱼精蛋白的氨基酸组成与含量进行分析。结果参见表1。从表1可以看出，与鱼精蛋白粗品相比，鱼精蛋白纯品中精氨酸和赖氨酸含量显著上升，苯丙氨酸、胱氨酸和组氨酸含量略微增加，其他氨基酸含量均下降。纯化后精氨酸和赖氨酸相对含量分别为36.90%和27.02%，占总氨基酸的一半以上，是菊黄东方鲀鱼精蛋白的主要氨基酸。碱性氨基酸总量占比由33.90%提升至65.45%。根据含有碱性氨基酸数量的不同，鱼精蛋白可分为单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白。除了精氨酸和赖氨酸外，还检测出了组氨酸，说明菊黄东方鲀鱼精蛋白属于三鱼精蛋白。

表1 菊黄东方鲀鱼精蛋白氨基酸组成

（三）、傅里叶红外光谱测定（FTIR）

使用OPUS软件，检查信号并保存峰位，分辨率为4 cm

图3为菊黄东方鲀鱼精蛋白粗品（CPP）和鱼精蛋白纯品（PPP）的红外光谱图，图3中强峰和中弱峰的波数位置及峰强度共同表征了鱼精蛋白的结构信息，且二者在多个波数范围内出现相同的吸收峰，具有较高的一致性。对比CPP和PPP的红外光谱图，纯化后的鱼精蛋白杂质干扰峰明显减少。

在3300~2700 cm

（四）、差式扫描量热法（DSC）

采用差示扫描量热仪对河鲀鱼精蛋白进行热分析。精确称量5.00 mg样品装入干燥洁净的铝坩埚，压紧并密封，以不加样品的铝坩锅作空白组。依次打开软件与仪器，待加样温度到达30℃时放入铝坩埚，检测温度范围设置为4段：30-100℃、100-200℃、200-300℃、300-400℃，加热速率10℃/min，吹扫气体流速70 mL/min，获取完整温度曲线，通过扫描出的峰值确定变性温度（Td，℃）和计算峰面积得到热焓值（△H，J/g）。

如图4所示，其显示了菊黄东方鲀鱼精蛋白粗品（CPP）和菊黄东方鲀鱼精蛋白纯品（PPP）在40~500℃之间进行差式扫描量热分析的图谱。由图4可见鱼精蛋白粗品在176℃和274℃处出现了2个变性峰，变性焓值分别为△H1：73.92 J/g和△H2：318.81 J/g，而鱼精蛋白纯品仅在176℃处现1个变性峰，变性焓值为△H3：192.19 J/g。说明176℃处的峰为河鲀鱼精蛋白吸热峰，274℃处的峰为杂质峰，菊黄东方鲀鱼精蛋白是变性温度高的蛋白质，其变性温度远高于一些常见耐热蛋白质的变性温度，如乳铁蛋白（70~75℃）、乳清蛋白（76~82℃）[91]，属于一种热稳定性高的蛋白质。与CPP相比，PPP相变温度未发生明显改变，而变性焓值升高，说明纯化后的鱼精蛋白中杂质较少，热稳定性提升。

（五）、圆二色谱（CD）

通过圆二色谱测定紫外区河鲀鱼精蛋白的二级结构。采用1 mm的石英皿，超纯水冲洗干净并晾干，在180-260 nm波段中，先采集背景及空白缓冲液，然后向比色皿中加入浓度为0.2 mg/mL的鱼精蛋白溶液，室温下进行远紫外（178-250 nm）扫描并采集数据。设置参数波长间距为1nm、响应时间为0.5 s，扫描速度50 nm/min，样品重复扫描3次。

圆二色谱在远紫外（190~260 nm）的扫描图谱，可以反映蛋白质肽键的排布信息，进而计算蛋白质二级结构的比例，包括α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-sheet）、β-转角（β-turn）和不规则卷曲（Random coil）等。采用圆二色谱对菊黄东方鲀鱼精蛋白进行远紫外区扫描，结果见表2。由表2可知，菊黄东方鲀鱼精蛋白中β-折叠结构占比最高，达51.40%，其次是无规则卷曲（38.20%），β-转角含量最低（10.40%），几乎未检出α-螺旋结构，可能与其碱性氨基酸含量很高有关。从圆二色谱结果来看，菊黄东方鲀鱼精蛋白的二级结构主要以β-折叠为主，无规则卷曲为辅，该结果与傅里叶红外光谱的结果相吻合。

表2 菊黄东方鲀鱼精蛋白二级结构分布比例

二、抑菌活性研究

（一）、准备

本项中涉及的菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027）。

试剂耗材：冰乙酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、三氯化铝、三氯化铁（均为分析纯），上海医药集团股份有限公司；胰蛋白胨（TRYPTONE）、酵母提取物（YEASTEXTRACT），OXOID；琼脂，德国Biofroxx；木瓜蛋白酶（40万 U/g）、中性蛋白酶（20万 U/g）、胃蛋白酶（25万 U/g）、胰蛋白酶（20万 U/g），广西庞博生物工程有限公司；自制金属打孔器（孔径7 mm）。

1、培养基的配制

LB液体培养基：胰蛋白胨10.00 g，氯化钠10.00 g，酵母提取物5.00 g，去离子水1000 mL；LB固体培养基：在液体培养基中加入琼脂37.50 g/L。加热溶解，密封。121℃高压灭菌15 min。

2、受试菌种的准备

在无菌环境下，将各菌株传代培养2~3代，取对数期的菌株与含30%甘油的保菌液等比混合，分装，置于-80℃保存备用，避免反复冻融。

3、菌悬液的制备

将各供试菌株从-80℃冰箱取出解冻，无菌环境中，在固体培养基中平板划线，37℃培养18 h，挑取单菌落转接到液体培养基中，37℃、150 rpm条件下扩大培养8~10 h，采用细菌比浊仪将各菌液浓度调至108 CFU/mL，再用无菌培养基按1:100比例稀释至10

4、鱼精蛋白溶液的制备

准确称取1.00 g鱼精蛋白纯品（PPP），溶于25 mL双蒸水中，振荡器振动混匀后水浴超声20 min，过0.22μm无菌滤膜除菌除杂，所得溶液即为40 mg/mL河鲀鱼精蛋白溶液，4℃冷藏，用时稀释至所需浓度。

（二）、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌为供试菌株。采用试管法测定鱼精蛋白的MIC。利用无菌水将鱼精蛋白储备液配制成40、20、10、5、2.5 mg/mL等不同浓度的鱼精蛋白溶液。在菌悬液（106 CFU/mL）中按1:1加入配制好的不同浓度鱼精蛋白溶液混匀，37℃、150 rpm培养24 h，其中各管的河鲀鱼精蛋白浓度分别为20、10、5、2.5、1.25 mg/mL，以加无菌水作为空白组，测定600 nm处的吸光值。采用平板法测定鱼精蛋白的MBC。随后从培养基未变浑浊的试管中吸取100μL均匀涂布在琼脂培养基上，置于37℃继续培养24 h，仍没有长菌的平板所使用的鱼精蛋白浓度定义为鱼精蛋白对该供试菌株的MBC。

最小抑菌浓度（MIC）是指在体外培养细菌18-24 h后抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，是测量待测物抗菌活性大小的一个指标，MIC越小，说明对该菌的抑制效果越好。菊黄东方鲀鱼精蛋白对革兰氏阳性菌G+（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌G-（大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌）的最小抑菌浓度如表3所示。由表3可得对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC均是5 mg/mL，对铜绿假单胞菌的MIC为2.5 mg/mL。最小杀菌浓度（MBC）是指能够杀灭培养基内细菌的最低浓度。表4为河鲀鱼精蛋白对三种细菌的MBC值，其中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MBC值均是10 mg/mL，对铜绿假单胞菌的MBC值为5 mg/mL。

表3 菊黄东方鲀鱼精蛋白对细菌的最小抑菌浓度（MIC）

表4 菊黄东方鲀鱼精蛋白对细菌的最小杀菌浓度（MBC）

（三）、抑菌圈直径（DIZ）的测定

采用琼脂打孔法测定菊黄东方鲀鱼精蛋白的抑菌圈大小。将各菌悬液浓度调至108 CFU/mL，按1：100比例将菌液加到未凝固的无菌培养基（40~50℃）中，摇匀并倒平板，此时培养基中细菌浓度为106 CFU/mL，待冷却凝固后用7 mm孔径的无菌打孔器在平板上打孔，后分别加入150 μL鱼精蛋白溶液，4℃预扩散2 h后移至37℃培养24 h，测量抑菌圈直径DIZ大小（单位：mm）。以无菌水作为空白组。

河鲀鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌（图5）、铜绿假单胞菌（图6）和大肠杆菌（图7）的抑制菌圈结果见图5-7和表5。如图5-7所示，孔1无菌水未出现抑菌圈特征，为阴性对照；孔2鱼精蛋白标品出现明显的抑菌圈特征，为阳性对照；孔3、4、5为不同浓度河鲀鱼精蛋白（2.5、5、10 mg/mL）均出现抑菌圈，且直径随着浓度的增大而扩大。本试验中，抑菌圈的大小可直观反映鱼精蛋白对供试菌体抗菌力的高低，当抑菌圈直径大于打孔器直径（7 mm）判定为有抑菌效果。

由表5可知，随着鱼精蛋白浓度的增加，对各细菌的抑菌圈直径也随着变大。但在同一浓度下，鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。当鱼精蛋白浓度为20 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌的DIZ达17.99 mm，显著高于铜绿假单胞菌和大肠杆菌（P＜0.05）。河鲀鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC和MBC值相同，但当鱼精蛋白浓度为5 mg/mL时，河鲀鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的DIZ大小不同，相差3.74 mm，对金黄色葡萄球菌的抑制圈更大，说明抑制效果越好，即金黄色葡萄球菌对鱼精蛋白更易感。

表5 不同浓度菊黄东方鲀鱼精蛋白处理后细菌的抑菌圈直径（DIZ）大小

（四）、菊黄东方鲀鱼精蛋白对微生物生长曲线的影响

采用试管比浊法测定，向4 mL稀释菌液(106 CFU/mL)中加入1 mL不同浓度的鱼精蛋白溶液，使培养基中鱼精蛋白的终浓度分别为1/2MIC、MIC、MBC，空白组加无菌水，混匀后37℃，150 rpm培养24 h。每隔2 h测量菌悬液在600 nm波长处的OD值，记录并绘制生长曲线。本试验以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌株。

结果如图8-9所示，随着培养时间的延长，细菌开始繁殖，菌液浓度增大，菌悬液变浑浊，600 nm处吸光值随之增大，以此反映细菌数量变化情况。可见，空白组均表现为典型的细菌生长特征，包括迟缓期、对数期、稳定期等。在图8中，当鱼精蛋白浓度为1/2 MIC时，金黄色葡萄球菌的生长受到抑制，与空白组对比，菌体的迟缓期延长了6 h，对数期的增速也相对放缓，24 h时稳定期的OD值低于空白组；当MIC浓度的鱼精蛋白对菌体生长的抑制作用强于1/2 MIC浓度，细菌对数期生长明显减慢；当浓度增加到MBC时，金黄色葡萄球菌的生长曲线在培养24 h内几乎没有变化，说明鱼精蛋白加进菌悬液后就杀死大部分的菌体。同样地，鱼精蛋白对大肠杆菌的生长曲线的影响见图9，空白组的大肠杆菌培养4 h时进入对数生长期；加入1/2 MIC浓度的鱼精蛋白时，培养8 h才进入对数生长期，培养24 h时OD值与空白组相比降低1/3以上；当溶度为MIC时，大肠杆菌直到16 h才有些许的生长，培养24 h的OD值仅为空白组的1/4；当浓度增大到MBC时，大肠杆菌几乎没有生长的趋势。

三、保鲜应用研究

1、样品预处理

将鲜活的暗纹东方鲀放在冰桶里低温处理，冻晕后宰杀，去除鱼头、鱼皮、内脏后，冰水清洗、沥干，沿鱼骨对半切开，分别取上、下2片鱼肉，每片鱼肉为1个平行。分别在不同处理溶液（纯水对照组、壳聚糖处理组、鱼精蛋白（PPP）处理组、壳聚糖+鱼精蛋白处理组）中浸泡20 min，取出沥干水分后，分装于无菌自封袋，置于4℃冷藏，分别在第1、4、7、10 d取样测量。其中，壳聚糖处理组为1 mg/mL壳聚糖溶液，鱼精蛋白处理组为10 mg/mL鱼精蛋白溶液，壳聚糖+鱼精蛋白处理组为1 mg/mL壳聚糖溶液与10 mg/mL鱼精蛋白溶液的混合。每组进行3个平行。

2、pH值的测定

根据GB 5009.237－2016《食品安全国家标准 食品pH的测定》，将河鲀鱼肉绞碎，称取5.00 g，加入45 mL超纯水，搅拌均匀，浸泡30 min后过滤，并测定滤液pH。

鱼肉的pH值能够反映肉质鲜度的变化趋势，且不同水产品的初始pH及变化速率存在差异，因此不能以此划分鱼肉的鲜度等级。贮藏过程中河鲀鱼肉pH值的变化如图10所示。贮藏期间不同组的鱼肉pH值均呈现先下降后上升的“V”字形趋势。贮藏前期pH值下降，推测原因可能是由于鱼肉细胞进行呼吸作用导致肌肉中糖原降解产生乳酸和磷酸等酸性物质并堆积，引起pH值降低。随着贮藏时间的延长，鱼肉中蛋白质、氨基酸等含氮化合物逐渐被内源酶和腐败微生物分解为氨和胺类等碱性物质，引致pH值逐渐增大。空白组和壳聚糖组鱼肉的pH值在贮藏第4 d时降至最低，分别为6.29和6.40，之后逐渐增加，第10 d时两组的pH值分别增加到7.26和7.03，比第1 d的pH值增加了0.97和0.63；而鱼精蛋白组和壳聚糖+鱼精蛋白组的pH值在第7 d降到最低，之后显著增加（P＜0.05），第10 d时两组的pH值分别升高到6.77和6.63，鱼精蛋白组比第1 d的pH值提高了0.09，而复配组的pH值比第1 d降低了0.20。鱼精蛋白组、壳聚糖+鱼精蛋白组pH值的增幅明显小于空白组，可能是因为鱼精蛋白组和壳聚糖+鱼精蛋白组中的腐败微生物较少，分解产生的碱性物质较少，导致了pH值增加的较慢，从另一方面说明了鱼精蛋白、壳聚糖+鱼精蛋白在贮藏过程中具有抑制腐败微生物生长的效果，有效延缓贮藏后期鱼肉pH值的升高，尤其是壳聚糖+鱼精蛋白组更为明显。

3、菌落总数（TVC）的测定

根据GB 4789.2－2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》，将河鲀鱼肉搅碎，称取25.00 g，加到225 mL无菌生理盐水中混匀，制备样品悬浊液，在超净工作台中对样品悬浊液进行梯度稀释，并涂抹在菌落总数测试片上，置于30±1℃恒温下培养72 h，进行平板菌落计数。

微生物作为肉类和水产品腐败变质的主要原因，菌落总数常作为肉类鲜度的重要评价指标，也可直观反映河鲀鱼肉的新鲜程度。一般认为鱼肉的TVC达到6.00 lg (CFU/g)时，判定为一级鲜度；达到6.00 lg (CFU/g)时，判定为二级鲜度，超过该值时鱼肉就发生腐败变质。分别采用河鲀鱼精蛋白、壳聚糖、鱼精蛋白与壳聚糖复配剂处理河鲀鱼肉后进行冷藏，其菌落总数变化如图11所示。各组河鲀鱼肉在冷藏期间菌落总数均呈上升趋势，空白组的TVC值最高，在贮藏期内始终高于其他各组，其他几组的TVC值从大到小依次是壳聚糖组>鱼精蛋白组>壳聚糖+鱼精蛋白组。TVC值越小，说明对贮藏过程中鱼肉微生物的抑制效果越好。当贮藏第7 d时，空白组的TVC值为6.10 lg (CFU/g)，超过二级鲜度标准，鱼精蛋白组的TVC值显著小于壳聚糖组（P＜0.05）；壳聚糖+鱼精蛋白组的TVC最低，为5.10 lg (CFU/g)；到第10 d时，壳聚糖组和鱼精蛋白组的TVC值分别为6.40 lg (CFU/g)和6.29 lg (CFU/g)，均超过了二级鲜度，开始腐败变质；而壳聚糖+鱼精蛋白组的TVC值为5.84 lg (CFU/g)，仍处于二级鲜度范围内。以上结果表明，壳聚糖、鱼精蛋白和壳聚糖+鱼精蛋白复配剂对河鲀鱼肉微生物均具有一定的抑制效果，且将鱼精蛋白和壳聚糖进行复配可增强保鲜作用。

4、挥发性盐基氮（TVB-N）的测定

根据GB 5009.228－2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》，采用微量扩散法，以紫红色为滴定终点，记录0.01 mol/L标准盐酸的滴定量，计算出TVB-N值。

挥发性盐基氮（TVB-N）通常作为水产品鲜度评价表征的常用手段之一，可反映鱼体腐败变质程度，且其变化高低与水产品的新鲜程度存在相关性。TVB-N值随着鲜度的降低而增加，河鲀鱼肉可食用上限为12.00 mg/100 g，采用鱼精蛋白、壳聚糖、壳聚糖+鱼精蛋白处理后河鲀鱼肉在贮藏期间TVB-N值变化情况如图12所示。从图中可以看出，各组TVB-N值从大到小依次是空白组>壳聚糖组>鱼精蛋白组>壳聚糖+鱼精蛋白组；随着贮藏时间的延长，各组鱼肉TVB-N值呈持续增加的趋势。其中，空白组第1 d的TVB-N值为4.67 mg/100 g，第7 d增加到12.13 mg/100 g，超过河鲀鱼肉可食用上限，第10 d达到14.11 mg/100 g，是第1 d的3.0倍。与空白组相比，壳聚糖组、鱼精蛋白组和壳聚糖+鱼精蛋白组的TVB-N值显著降低（P＜0.05），尤其是壳聚糖+鱼精蛋白组，贮藏到第10 d时，壳聚糖组和鱼精蛋白组的TVB-N值分别增加到12.72 mg/100 g和12.37 mg/100 g，均显著低于空白组（P＜0.05），超过可食用上限；而壳聚糖+鱼精蛋白组的TVB-N值为10.85 mg/100 g，显著低于其他3组（P＜0.05），仍处于可食用范围。在10 d时说明壳聚糖+鱼精蛋白复配保鲜剂能有效抑制鱼肉TVB-N的积累。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。