一种长链非编码RNA在PD-L1单克隆抗体治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA在PD-L1单克隆抗体治疗中的应用。

背景技术

全世界每年大约有160多万新发肺癌病例被确诊，在许多发展中国家，因肺癌导致的死亡逐年上升。肺癌分为多种类型，其中以非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)占绝大多数。NSCLC的生长和转移与免疫微环境息息相关，多种免疫细胞和免疫分子参与了NSCLC肿瘤的发生发展。程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是重要的免疫检查点分子之一，约一半以上的NSCLC细胞表面表达PD-L1。PD-L1通过抑制T细胞功能和促进肿瘤细胞免疫逃逸而导致预后不良。抑制PD-L1可协同T细胞的刺激信号，延长T细胞的激活时间和抗肿瘤免疫反应。筛选负向调控PD-L1的分子可为NSCLC的免疫治疗提供新的方法和策略。

长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)在蛋白质分子的转录、翻译和翻译后修饰中起关键作用。有研究表明某些lncRNA可正向调控PD-L1水平从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸、影响肿瘤细胞的生长和转移。然而，可负向调控PD-L1的lncRNAs的相关研究十分匮乏。探索负调控PD-L1的lncRNAs对NSCLC的临床治疗具有深远意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何负向调控PD-L1的表达和/或如何制备治疗非小细胞肺癌的产品和/或如何获得非小细胞肺癌的治疗靶点。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质的应用。所述应用可为下述任一种：

P1、长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质在开发抑制、治疗、辅助治疗和/或协同治疗肿瘤的产品中的应用；

P2、长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质在制备抑制、治疗、辅助治疗和/或协同治疗肿瘤的产品中的应用；

P3、长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质在开发抑制或辅助抑制程序性死亡受体-配体1表达的产品中的应用；

P4、长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质在制备抑制或辅助抑制程序性死亡受体-配体1表达的产品中的应用；

P5、长链非编码RNA或调控所述长链非编码RNA表达的物质或调控所述长链非编码RNA活性或含量的物质在制备增强T细胞的杀伤活性产品中的应用。

所述长链非编码RNA可为如下A1)或A2)或A3)的长链非编码RNA：

A1)序列为序列表中序列1的RNA分子，该长链非编码RNA的名称为LINC02418；

A2)序列为序列表中序列3的RNA分子，该长链非编码RNA的名称为4930573I07Rik；

A3)将序列表中序列1或序列3所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的RNA分子具有90％以上的同一性的RNA分子。

上述应用中，所述肿瘤可为非小细胞肺癌肿瘤。所述非小细胞肺癌可为肺腺癌。

与上文所述长链非编码RNA的编码基因相关的生物材料下述任一种应用：

P1、所述生物材料在开发抑制、治疗、辅助治疗和/或协同治疗肿瘤的产品中的应用；

P2、所述生物材料在制备抑制、治疗、辅助治疗和/或协同治疗肿瘤的产品中的应用；

P3、所述生物材料在开发抑制或辅助抑制程序性死亡受体-配体1表达的产品中的应用；

P4、所述生物材料在制备抑制或辅助抑制程序性死亡受体-配体1表达的产品中的应用；

P5、所述生物材料在制备增强T细胞的杀伤活性产品中的应用。

其中，所述生物材料可为B1)-B7)中的任一种：

B1)权利要求1中所述长链非编码RNA的编码基因；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)、b2)或b3)所示的编码基因：

b1)编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子，

b3)与b1)或b2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

上述应用中，所述肿瘤可为非小细胞肺癌肿瘤。所述非小细胞肺癌可为肺腺癌。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了组合物。所述组合物的活性成分可含有抗程序性死亡受体-配体1的抗体和B，所述B可为上文中所述长链非编码RNA和/或上文中所述长链非编码RNA的编码基因和/或上文中所述生物材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了B在制备增强抗程序性死亡受体-配体1的抗体的抗肿瘤活性产品中的应用。所述B可为上文中所述长链非编码RNA和/或上文中所述长链非编码RNA的编码基因和/或上文中所述生物材料。

所述抗肿瘤活性可体现为抑制肿瘤的增长。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

上文中所述长链非编码RNA作为肿瘤标志物在制备检测肿瘤的产品中或制备检测肿瘤对于治疗反应的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

以上文中所述长链非编码RNA或上文中所述长链非编码RNA的编码基因作为治疗靶点的物质在制备和/或开发治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述物质可为上述生物材料。

上文所述产品可为药物或装置。

上文所述的组合物或上文所述的应用中，所述肿瘤可为非小细胞肺癌肿瘤。所述非小细胞肺癌可为肺腺癌。

上文所述的长链非编码RNA和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明公开了一种长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)LINC02418及其在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的应用。本发明利用NSCLC细胞系H1703进行了LINC02418过表达，结果发现过表达LINC02418后细胞的程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)表达水平降低，显示LINC02418的水平与PD-L1的表达呈负相关。利用由外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)活化所得T细胞对H1703细胞进行共同孵育，结果显示，过表达H1703细胞中的LINC02418后T细胞的杀伤作用显著增强。在小鼠体内进行肿瘤接种并给予PD-L1单克隆抗体治疗，结果显示LINC02418的过表达与PD-L1单克隆抗体具有协同治疗NSCLC的作用。临床样本分析显示，在人肺腺癌组织中LINC02418的表达水平与PD-L1呈负相关。本发明针对LINC02418的发现将为NSCLC提供新的治疗靶点。

本发明发现，在NSCLC细胞中lncRNA分子LINC02418与PD-L1水平呈负相关，是PD-L1的负向调控分子，具有抑癌作用。LINC02418可与PD-L1单克隆抗体发挥协同治疗NSCLC的作用。综上所述，作为一种lncRNA，LINC02418可通过调控PD-L1为治疗NSCLC提供靶点。

附图说明

图1为利用LINC02418过表达质粒和空载体EV转染H1703细胞后，细胞中PD-L1蛋白水平和LINC02418的RNA水平检测。上图为Western blot检测PD-L1蛋白水平的结果；下图为实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)定量检测LINC02418的RNA水平的结果，纵坐标为LINC02418的相对RNA水平，“**”代表p<0.01。

图2为通过流式细胞术分析和荧光显微镜观察PD-L1的表达情况。(A)为通过流式细胞术分析过表达LINC02418或EV后H1703细胞表面PD-L1的表达，左图纵坐标为细胞计数，横坐标为荧光标记的PD-L1抗体的荧光强度；右图为量化柱状图，纵坐标为标准化后的PD-L1水平，“***”代表p<0.001。(B)为通过免疫荧光观察细胞表面的PD-L1，magnification为局部放大后显像，左图为荧光显微镜观察结果，图中标尺为10μm；右图为荧光强度量化柱状图，纵坐标为标准化后的荧光强度，“***”代表p<0.001。

图3为LINC02418对免疫细胞杀伤NSCLC细胞的影响。(A)LINC02418对免疫细胞杀伤NSCLC细胞的影响的实验流程示意图。(B)通过流式细胞术分析过表达LINC02418或EV的H1703细胞被PBMC细胞杀伤后的凋亡比例，右图为量化柱状图，纵坐标为凋亡细胞所占比例，“**”代表p<0.01。(C)通过荧光显微镜分析过表达LINC02418或EV的H1703细胞被PBMC细胞杀伤后的凋亡比例，Hochest33342代表所有的细胞核；右图为量化柱状图，纵坐标为凋亡细胞所占比例，“**”代表p<0.01。

图4为皮下移植荷瘤小鼠的研究。(A)皮下移植荷瘤小鼠的接种和治疗方案。对照组小鼠给予对照抗体IgG2a治疗，治疗组小鼠给予PD-L1 mAb治疗。所有抗体均为腹腔注射，剂量为5mg/kg，从接种肿瘤后第7天开始每3天给予一次抗体注射。当肿瘤体积超过1,200mm

图5为小鼠肿瘤组织切片的PD-L1和Ki67的代表性IHC染色，Tunel和DAPI的代表性荧光染色。比例尺大小为50μm。右上图为各组织中4930573I07Rik的表达水平，纵坐标为4930573I07Rik的相对表达水平，“****”代表p<0.0001；右下图为根据各组的Tunel染色所计算的细胞凋亡率，纵坐标为细胞凋亡比例，“***”代表p<0.001。

图6为肺腺癌患者中LINC02418与PD-L1表达的相关性染色观察结果。左图为染色观察结果，其中肺腺癌患者肿瘤切片中LINC02418采用FISH染色，PD-L1采用IHC染色。比例尺大小为50μm。右图柱状图为LINC02418与PD-L1在标本中的比例图，纵坐标为各对应数据所占临床样本比例。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中：

pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro质粒载体：来源于美国System Biosciences公司；

pMD2.G质粒：来源于武汉淼灵生物科技有限公司；

psPAX2质粒：来源于武汉淼灵生物科技有限公司；

Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen品牌)：来源于美国Thermo Fisher公司；

H1703细胞：来源于美国ATCC公司；

293T细胞：来源于美国ATCC公司；

Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma cell,LLC)：来源于美国ATCC公司；

APC荧光标记PD-L1抗体：来源于美国Proteintech公司；

PD-L1单克隆抗体：来源于美国Proteintech公司；

小鼠IgG2a同型对照：来源于美国Thermo Fisher公司；

β-Tubulin抗体：来源于上海艾比玛特医药科技有限公司；

anti-CD3抗体：来源于美国BioLegend公司；

anti-CD28抗体：来源于美国Proteintech有限公司；

DAPI荧光染料：来源于美国Thermo Fisher公司；

淋巴细胞分离液：来源于爱必信生物科技公司；

白细胞介素-2(IL-2)：来源于美国BioLegend公司；

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒：来源于北京索莱宝科技有限公司；

Hoechst 33342/PI双染试剂盒：来源于北京索莱宝科技有限公司；

Tunel细胞凋亡检测试剂盒：来源于武汉赛维尔生物科技有限公司；

Ki67抗体：来源于武汉赛维尔生物科技有限公司，Ki67小鼠单克隆抗体，Anti-Ki67mouse mAb(GB121141)；

实验用小鼠：来源于中国斯贝福(北京)生物技术有限公司。

实施例1、LINC02418的水平与PD-L1的表达呈负相关

1.过表达载体的构建和H1703细胞的转染

人长链非编码RNA LINC02418核苷酸序列为序列表中序列1所示，LINC02418在小鼠中的同源基因名为4930573I07Rik，4930573I07Rik基因编码的长链非编码RNA的核苷酸序列为序列表中序列3所示。

其中，序列1序列如下：

5’-AGCCCUGCGCUUCCCCAGGUGAACCGGGCAGGAGCCUGUUGGGAAGGCAGCGACCCACAUCUGUGUGCACCUUUGUGGAUUUCAGGUUCCGGACGCAGGCGACCAAGCCAGAGCCAGCGCUGUCAUACGCAGAGCACCUGCCGAGCCAUGUGACGUGCUGCUCUCUGCCAGCCCUGAUCGCCUUCCUUUCCAGCAGGACUUGCGCUUCACACUGGACCUUGAGGCCCCAUGGAGAUCUGCCAUUUUGGGCAGGUUCUGCUCACAGUGCCAGUAACUUCACCUAGGAGAAGAGCGACAACUUCAAGGCCGCAUGACCCAUCUGAUUGUCAUCACACAGGUCCCCGCAGGAGAAUUUCCAUGGCGUUUCUCACUCUUUGUUUGCAAAGAAUUUCUUUUUUUAUCGUUUUCUUUUUCUUUUUCUAUUUUCUUUUUUCUUUUUUUUUUGAGACAGAGUCUCUCUCUGUUGCCCAGGCUGGAGUGCAGUGGCAUGACCUCGGCUCACUGCAACCUCGGCCUCCUGGGUUCAAGCAAUUCUCCUGCCUCAGCCUCCCGAGUAGCUGGGAUUACGGGCACACACCACAACGCUCAGCUAAUUUUUGUAUUUUUAGAAAAGACAGGGUUUUACCAUGUUGGCCAGGCUGGUCUCGAUCUUCUGAGCUCGUGAUCCACCUGCCUCGGCCUCCAAAGUGCUGGGAUUACAGGCGUGAGCCACCACACCCAGCCUAAGAAUUUCUUAGAAUUAAUAUCUGCACUUGGCCCCACAUCCUCUGAGUGAUAACUUAGAACUGUCACUUUAAUUGUUGAGAGAGGAUAUUCAGAGAAUAGUGGGUGAUUUUACAAGCAAGGAUAUGUUUGGGGAGCAUGUUCCCGGUGCAUUCUCAGGGUCUCGUGCAUUCUUUUAGACAUUGAAGACAUCCUGAUCUCCAGUGGAAGCAGAGCCCCAGUCAUACACUUAUCCACCGGGGACGAGUUCCAAGACCCCCAGGGAAUGCCUGAAAGCUCGGGUAGUGCUUACCUCUAUGGAUGUUGUGCACAAAUUUAUUUUUCCCUCUUUACAACUUCAUAGAUUGAAGGUUCGUUCUUACCAAAGAUCUUAGCAACCUUAGCUUAUCAUUCCUUUUAUUUCCUGAUUAAGUGGAGAACUUUCACCUUUUCACUAAAAAAAAAAAGUGCUUUACGGCUGCCUUUGCCACGUGCACAUGGUCUUUUGGGACCAUCCUUAAGUCAAAUAAGGGUGACCUGGAUGCAAGCACUGUGAUACAGAGAAAGUCCAGCUCACCACCAAGAUGGCUGCUGAGCCGCUGGUGGGCGCGGAGUGUCGUGUCUGCAGCGUGAACAUGCCGGGCAAAGGAAUAAUGCAUGUCAGGGAUAGGGUGGAGAAGGACUGUGCCAGGCUUCAUCACACUACUCAGAAUGGCACACAGUUUAGAACUUAUAAAUGAUUUAUUUCUGGAGUGAUCCACUGCAUAUUUUCAGACGGUGGUUGAUCGUGGGUAACUGAAAGCAAAACCUGACUGAAAGGGGCUGCUGUGUUCAUGUCAGCAACGCUGAUGCCCUCGAGGCCAGAAGAGUAACCACCAAUCUGGUACCUGAGCACCUGGCUGUAAGUCCACCCUCCAUUUCUGGCCAGGGCCGAGGAAUUCUCUCUUUUUCUCUUUAUUUUCCUCUUGAUUUGAGAAGGUCAACUCUGAGCAUGCUCUAAACACAAAUCAGCAUCUCUACACUUCUUCGGCACCAGGUGUUGCUACUGUCUUUCUGAUUAGAAAAAAAGAAAUAUCCAGGAAUUCUGGAAGACAGUGAUUGAUUUGCAGCUAUGCUGCAAUGGAGCUAAGAAUCAUUAGCACAACCCGUGCUGGUGUUCGACAAGAUGCCCAAUCAAUUCAUCCGAUGACAGGUGCGCUGUGUCUGCGAAGCGCGAAGCCACGGAGUGAGGUGCUGACCAGGCUCCACCAGGAGCAAGGAACAAGACUCCCCAGGGGCUCCUGGUCCACAGAAGGCAGGGACGCCCACAAACAUACCAUGAGUAAAUAGUUCCAAUGUGAAGAAGACUGAAAAUGCCACAGAAGUGUGAGCCCACUGUUUUGAAAUUCUUUCUGCUGAAGGGAUUGAGAAGAACUCUUCCAUAAAGGAGCAUGACCGAGCCAUGAGUUAUAAUAUAUACAUGCAUAUAGAAAGAGGAUGUGAAUACAGUUGCAGAAGGGCGUCAAAGCCAAAAACACACAGGGAAUGACUUGAGGAAGCUGAGGACCAAGAGCAGUGCUAGCCAUGCCAGUGACUGUGGUCGCUGAGAACUGGAUGAUGGAUGUUUGAGUGACCGUCAGGAGGAUCAGCAUGGGACCAGGAGGAUCAGCAUGGGACCAGGAGGAUCAGCAUGGGACCAGGAGGAUCAGCAUGGGACCAGGAAACAGCAGGCGAGUGAAUGUGAACUCCACUCUCAACAGGGAGAUGACGUGGGUCUCGGAAACCUACAGAUCUGAGUGCUUGCUGUCAGGUCAUGGCAGGGCUCUGACUGCACUGUGGAGGGAACAUCUGUGUUUUUGUCCUCCUGGAACCUAGUGCCCCUUUCCUGGAGGCAGCAUCCUAUUUGACCUGUGUGGGUCCAACCCCACCUCUCUCCUGUAGCAGUGGCAUGGGACCCGGGGCUGGGCCAUUCGCAGCAUUGCCACAGGCAGCAAUGGUGAUUGAUCUAGGAGUUGAUCAUUGAUCCUAACUGGGUGCUCAGGCCAAGGGGAUUGAUUCUUGGUAUUUUUUAAUCUCUUUUUUCCACUGGAAUUAUAGCUAAUAUGAUGAAGCCUAGAUAUACUGCGUAUCUGGCUUUUAGACAGGGCAAACCUGCCUAGAAAUGAAAAUGAAGUCACCACCUGUGAAAGCAGAAACAAGAGCUUGAGAGAGACUGAGUCCUGGUGAGAAUUUCUGAACCCCUUGAUCCAGCGAUGCCUGAAGCCAGAACUACUUGUAAACUUUUCAGUCAUGCAAUCCUGUCACUUCUGUUUGUUCUUAAGUGCAUUUUGUAUGGUUUCUGCCGCUGACCACGGAAACGUCCUUCACUAACAGGGAAGCAGAGUUACCCCAUUUGAGAGCCUCAGAAGGAAGAUGGCAUUCAUGCAAAGGAAGCAUGCGUUUGCUCUCACUUCCUGAGAGAAAGCCUGAAAAUGAAGCCAAUCUCAUUUUCUUUCAGAGAUGAGUCUCUUGAUCAGAGAAUGCCUCAGUU-3’；

序列3序列如下：

5’-AUCCUAGAGAAACCACCAUGCGGAGAGCAGUGGCUGUGUCCCAGACCAAGAAGAGGGCGUUGGAUUCUCCGGAACUGGAAUUACAGGCGGUUCUGUGCCUCCGUGUGGACGCUCUGAGCCAUCUCUCCAGCCCCACAUGGCUGGCUUUAGUCUGUCCUGCGGUUGAAAUCUUAAGUGAAUAUACAAGAUUCAAAAUUCAUGAGGAAUUAUCAAAAUUGUGAAUGAGGCCAGAGCAGGGAGUGUGGUACUAGAGGCUGAAGCAAAGAAAGAAGCUGAAGCAGACACCAGAAUUUCUUCAGAGCUCUGCUACUGUGUCCGACUUCCUCCUCAGUGGAGGGAGCCGCCGUGCUUGGCAAUCUCUCUCCCGACUAGGAAAUGUUCUUAAAUGGUGCUUAAUUAAGUCUUGAGGAAGA-3’。

1.1 LINC02418过表达慢病毒载体构建

将LINC02418按表1所示体系进行过表达质粒构建，质粒重组程序设置为室温2h、16℃3h。

表1.LINC02418过表达质粒重组体系

重组后所得产物即为LINC02418过表达质粒(pCDH-LINC02418)。序列2序列如下：

5’-AGCCCTGCGCTTCCCCAGGTGAACCGGGCAGGAGCCTGTTGGGAAGGCAGCGACCCACATCTGTGTGCACCTTTGTGGATTTCAGGTTCCGGACGCAGGCGACCAAGCCAGAGCCAGCGCTGTCATACGCAGAGCACCTGCCGAGCCATGTGACGTGCTGCTCTCTGCCAGCCCTGATCGCCTTCCTTTCCAGCAGGACTTGCGCTTCACACTGGACCTTGAGGCCCCATGGAGATCTGCCATTTTGGGCAGGTTCTGCTCACAGTGCCAGTAACTTCACCTAGGAGAAGAGCGACAACTTCAAGGCCGCATGACCCATCTGATTGTCATCACACAGGTCCCCGCAGGAGAATTTCCATGGCGTTTCTCACTCTTTGTTTGCAAAGAATTTCTTTTTTTATCGTTTTCTTTTTCTTTTTCTATTTTCTTTTTTCTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATGACCTCGGCTCACTGCAACCTCGGCCTCCTGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACGGGCACACACCACAACGCTCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGAAAAGACAGGGTTTTACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGATCTTCTGAGCTCGTGATCCACCTGCCTCGGCCTCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCACACCCAGCCTAAGAATTTCTTAGAATTAATATCTGCACTTGGCCCCACATCCTCTGAGTGATAACTTAGAACTGTCACTTTAATTGTTGAGAGAGGATATTCAGAGAATAGTGGGTGATTTTACAAGCAAGGATATGTTTGGGGAGCATGTTCCCGGTGCATTCTCAGGGTCTCGTGCATTCTTTTAGACATTGAAGACATCCTGATCTCCAGTGGAAGCAGAGCCCCAGTCATACACTTATCCACCGGGGACGAGTTCCAAGACCCCCAGGGAATGCCTGAAAGCTCGGGTAGTGCTTACCTCTATGGATGTTGTGCACAAATTTATTTTTCCCTCTTTACAACTTCATAGATTGAAGGTTCGTTCTTACCAAAGATCTTAGCAACCTTAGCTTATCATTCCTTTTATTTCCTGATTAAGTGGAGAACTTTCACCTTTTCACTAAAAAAAAAAAGTGCTTTACGGCTGCCTTTGCCACGTGCACATGGTCTTTTGGGACCATCCTTAAGTCAAATAAGGGTGACCTGGATGCAAGCACTGTGATACAGAGAAAGTCCAGCTCACCACCAAGATGGCTGCTGAGCCGCTGGTGGGCGCGGAGTGTCGTGTCTGCAGCGTGAACATGCCGGGCAAAGGAATAATGCATGTCAGGGATAGGGTGGAGAAGGACTGTGCCAGGCTTCATCACACTACTCAGAATGGCACACAGTTTAGAACTTATAAATGATTTATTTCTGGAGTGATCCACTGCATATTTTCAGACGGTGGTTGATCGTGGGTAACTGAAAGCAAAACCTGACTGAAAGGGGCTGCTGTGTTCATGTCAGCAACGCTGATGCCCTCGAGGCCAGAAGAGTAACCACCAATCTGGTACCTGAGCACCTGGCTGTAAGTCCACCCTCCATTTCTGGCCAGGGCCGAGGAATTCTCTCTTTTTCTCTTTATTTTCCTCTTGATTTGAGAAGGTCAACTCTGAGCATGCTCTAAACACAAATCAGCATCTCTACACTTCTTCGGCACCAGGTGTTGCTACTGTCTTTCTGATTAGAAAAAAAGAAATATCCAGGAATTCTGGAAGACAGTGATTGATTTGCAGCTATGCTGCAATGGAGCTAAGAATCATTAGCACAACCCGTGCTGGTGTTCGACAAGATGCCCAATCAATTCATCCGATGACAGGTGCGCTGTGTCTGCGAAGCGCGAAGCCACGGAGTGAGGTGCTGACCAGGCTCCACCAGGAGCAAGGAACAAGACTCCCCAGGGGCTCCTGGTCCACAGAAGGCAGGGACGCCCACAAACATACCATGAGTAAATAGTTCCAATGTGAAGAAGACTGAAAATGCCACAGAAGTGTGAGCCCACTGTTTTGAAATTCTTTCTGCTGAAGGGATTGAGAAGAACTCTTCCATAAAGGAGCATGACCGAGCCATGAGTTATAATATATACATGCATATAGAAAGAGGATGTGAATACAGTTGCAGAAGGGCGTCAAAGCCAAAAACACACAGGGAATGACTTGAGGAAGCTGAGGACCAAGAGCAGTGCTAGCCATGCCAGTGACTGTGGTCGCTGAGAACTGGATGATGGATGTTTGAGTGACCGTCAGGAGGATCAGCATGGGACCAGGAGGATCAGCATGGGACCAGGAGGATCAGCATGGGACCAGGAGGATCAGCATGGGACCAGGAAACAGCAGGCGAGTGAATGTGAACTCCACTCTCAACAGGGAGATGACGTGGGTCTCGGAAACCTACAGATCTGAGTGCTTGCTGTCAGGTCATGGCAGGGCTCTGACTGCACTGTGGAGGGAACATCTGTGTTTTTGTCCTCCTGGAACCTAGTGCCCCTTTCCTGGAGGCAGCATCCTATTTGACCTGTGTGGGTCCAACCCCACCTCTCTCCTGTAGCAGTGGCATGGGACCCGGGGCTGGGCCATTCGCAGCATTGCCACAGGCAGCAATGGTGATTGATCTAGGAGTTGATCATTGATCCTAACTGGGTGCTCAGGCCAAGGGGATTGATTCTTGGTATTTTTTAATCTCTTTTTTCCACTGGAATTATAGCTAATATGATGAAGCCTAGATATACTGCGTATCTGGCTTTTAGACAGGGCAAACCTGCCTAGAAATGAAAATGAAGTCACCACCTGTGAAAGCAGAAACAAGAGCTTGAGAGAGACTGAGTCCTGGTGAGAATTTCTGAACCCCTTGATCCAGCGATGCCTGAAGCCAGAACTACTTGTAAACTTTTCAGTCATGCAATCCTGTCACTTCTGTTTGTTCTTAAGTGCATTTTGTATGGTTTCTGCCGCTGACCACGGAAACGTCCTTCACTAACAGGGAAGCAGAGTTACCCCATTTGAGAGCCTCAGAAGGAAGATGGCATTCATGCAAAGGAAGCATGCGTTTGCTCTCACTTCCTGAGAGAAAGCCTGAAAATGAAGCCAATCTCATTTTCTTTCAGAGATGAGTCT CTTGATCAGAGAATGCCTCAGTT-3’。

1.2 pCDH-LINC02418质粒转化扩增及质粒提取

将pCDH-LINC02418质粒加入感受态细胞DH5α中，吹匀后冰浴30min、42℃热冲击1.5min、冰浴2min。随后，向感受态细胞中加入无抗性的LB培养基，在37℃下以200rpm/min的速度在摇床中孵育1h。孵育完成后离心弃去上清，将剩余菌液吹匀后均匀涂至添加氨苄西林的固体LB培养板上，将培养板倒置放入37℃温箱培养。培养24h后挑取单克隆菌落，分别置入添加氨苄西林的LB液体培养基中，37℃摇床上孵育1h。孵育完成后利用质粒提取试剂盒进行质粒提取。将全部菌液加入离心管内离心并弃去上清。随后加入重悬液将细菌充分重悬混匀，向细菌重悬液中加入裂解液，上下翻转8次以充分裂解细菌，随后加入中和液，上下翻转8次充分混匀，可见离心管中出现白色絮状沉淀。离心后提取上清液即为pCDH-LINC02418质粒溶液。

以293T细胞作为转染工具细胞，使用三质粒系统包装慢病毒。利用Lipofectamine3000转染试剂盒进行转染。使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine 3000试剂，充分混匀。使用Opti-MEM培养基配制待转染质粒(总质量为10μg，其中pMD2.G质粒2.2μg、psPAX2质粒3.3μg、pCDH-LINC02418质粒4.4μg)，制备质粒预混液，随后添加P3000试剂并充分混匀；将稀释后的Lipofectamine 3000试剂与所配制的质粒稀释液混合后室温孵育10min。最后将混合液加入接种有293T细胞的培养皿中，37℃孵育48h，随后收集病毒液得到LINC02418过表达慢病毒载体。

1.3 LINC02418过表达慢病毒载体转入H1703细胞

使用0.45μm的无菌过滤器过滤病毒液。使用细胞培养基将病毒液稀释4倍，并加入4μL 1％polybrene帮助感染，充分混合为病毒感染培养基。将病毒感染培养基加入接种有H1703细胞的培养皿中，37℃下感染。感染12h后，再次配制新鲜的病毒感染培养基，更换后继续感染H1703细胞。第二次感染12h后，将感染细胞进行传代，以60％密度接种，向细胞培养基中加入嘌呤霉素(puro)筛选被感染的细胞。以未感染的野生型H1703细胞作为对照，加入同样浓度的puro，待对照组细胞全部死亡后撤药，即获得过表达LINC02418的H1703细胞。

1.4空载体(empty vector,EV)构建

按表2所示进行重组，重组程序设置为室温2h、16℃3h。

表2.EV质粒重组体系

重组后所得质粒产物即为EV，将所得质粒进行转化扩增与质粒提取。转化扩增与质粒提取步骤与步骤1.2中pCDH-LINC02418质粒相同。

以293T细胞作为转染工具细胞，使用三质粒系统包装EV慢病毒载体，包装步骤与步骤1.2中LINC02418过表达慢病毒载体相同。

1.5EV慢病毒载体转入H1703细胞

EV慢病毒载体转入H1703细胞的步骤与步骤1.3中LINC02418过表达慢病毒载体转入H1703细胞的步骤相同。

1.6H1703细胞转染细胞中LINC02418表达量的检测

分别构建过表达EV和过表达LINC02418的H1703细胞，得到的细胞分别命名为EV-H1703和LINC02418-H1703。定量检测结果显示，LINC02418-H1703细胞中(图1中下图的LINC02418)的LINC02418的RNA水平显著高于EV-H1703细胞(图1中下图的EV)，p<0.01，表明在LINC02418-H1703细胞中LINC02418过表达。

2.Western blot实验

分别将EV-H1703和LINC02418-H1703细胞用胰酶消化后收集细胞，离心后弃去上清液。向细胞沉淀物中加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，随后加入1×SDS上样缓冲液并混匀。沸水煮样15min后对样品进行离心，离心后取上层裂解液作为电泳样品。将提取所得蛋白样品进行电泳。首先利用80V电压进行浓缩胶电泳10min，随后利用120V电压进行分离胶电泳40min。电泳结束后，利用半干电转仪将蛋白质分子转移到硝酸纤维素膜上。转膜完成后，利用封闭液常温封闭纤维素膜1h。封闭后清洗纤维素膜，利用PD-L1单克隆抗体以及β-Tubulin抗体常温孵育2h，随后利用HRP标记的二抗常温孵育1h。进行3次洗膜后，将A、B显影液混匀并均匀滴在硝酸纤维素膜上，在凝胶成像系统中进行显影。

Western blot结果显示，相对于EV-H1703细胞(图1中上图的EV)，LINC02418-H1703细胞中过表达LINC02418后，PD-L1蛋白表达水平(图1中上图的LINC02418)显著降低，表明LINC02418的水平与PD-L1的表达呈负相关，LINC02418能够负向调控PD-L1蛋白的表达。

3.流式细胞术分析和荧光显微镜观察实验

将EV-H1703和LINC02418-H1703细胞与APC荧光标记的PD-L1抗体一起孵育，通过流式细胞术分析和荧光显微镜观察研究细胞表面PD-L1水平的变化。

3.1流式细胞术实验步骤

将EV-H1703和LINC02418-H1703细胞消化后制备为细胞悬浮液，向细胞悬浮液中加入APC荧光标记的PD-L1抗体，室温避光孵育30min。染色完成后利用PBS清洗细胞3次，随后利用流式细胞仪(美国BD公司)对细胞进行分析。

3.2荧光显微观察实验步骤

向EV-H1703和LINC02418-H1703细胞培养皿中加入标记APC荧光标记的PD-L1抗体，室温孵育30min。染色完成后利用PBS清洗细胞3次，清洗后利用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min。利用PBS清洗细胞3次后在荧光显微镜下对细胞进行观察。

流式细胞术分析结果表明，相对于EV-H1703细胞(图2中A中的EV)，LINC02418-H1703细胞表面的PD-L1表达水平(图2中A中的LINC02418)显著降低，p<0.001。

通过荧光显微镜进行免疫荧光观察，结果显示，EV-H1703细胞中荧光强度(图2中B中的EV)显著高于LINC02418-H1703细胞(图2中B中的LINC02418)。

此实验进一步验证了LINC02418可对NSCLC细胞表面的PD-L1发挥负向调节作用。

实施例2、过表达LINC02418增强T细胞的杀伤作用

进一步研究LINC02418在NSCLC细胞的免疫杀伤中所起的作用，实验流程如图3中A所示：依据说明书，利用人淋巴细胞分离液从人全血中分离人外周血单核细胞(peripheralblood mononuclear cell，PBMC)；在PBMC中加入anti-CD3抗体、anti-CD28抗体和白细胞介素-2(IL-2)使PBMC中的T细胞被活化，得到T细胞活化的PBMC；将活化的PBMC分别与实施例1中得到的EV-H1703细胞或LINC02418-H1703细胞共培养24h；随后分别利用流式细胞术(图3中B)和荧光显微镜观察(图3中C)分析H1703细胞的凋亡情况。

流式细胞术分析细胞凋亡情况：将待检测细胞消化后制备为细胞悬浮液。依据说明书，利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对细胞进行染色。染色完成后利用PBS清洗细胞3次，随后利用流式细胞仪对细胞进行分析。

荧光显微镜观察细胞凋亡情况：将细胞培养皿中的待检测细胞进行清洗，随后利用Hoechst 33342/PI双染试剂盒对细胞进行染色。染色完成后利用PBS清洗细胞3次，在荧光显微镜下对细胞进行观察。

结果显示，与EV-H1703细胞相比(图3中B中的EV)，LINC02418-H1703细胞(图3中B中的LINC02418)的凋亡比例显著升高。荧光显微镜观察结果(图3中C)与流式细胞术结果一致，在LINC02418-H1703细胞(图3中C中的LINC02418)中观察到细胞的凋亡比例显著升高，即过表达LINC02418后H1703细胞可以被T细胞大量杀伤。因此，H1703细胞过表达LINC02418可使T细胞对其杀伤作用显著增强。

实施例3、4930573I07Rik在体内对NSCLC治疗的应用

进一步验证LINC02418的小鼠同源基因4930573I07Rik在体内对NSCLC治疗的影响。4930573I07Rik过表达慢病毒载体的构建方法与实施例1中LINC02418过表达慢病毒载体的构建方法相同。

按表3所示进行4930573I07Rik过表达质粒构建，重组程序设置为室温2h、16℃3h。

表3. 4930573I07Rik过表达质粒重组体系

序列4序列如下：

5’-AGAGCAGTGGCTGTGTCCCAGACCAAGCCAGAAGAGGGCGTTGGATTCTCCGGAACTGGAATTACAGGCGGTTCTGTGCCTCCGTGTGGACGCTCTGAGCCATCTCTCCAGCCCCACATGGCTGGCTTTAGTCTGTCCTGCGGTTGAAATCTTAAGTGAATATACAAGATTCAAAATTCATGAGGAATTATCAAAATTGTGAATGAGGCCAGAGCAGGGAGTGTGGTACTAGAGGCTGAAGCAAAGAAAGAAGCTGAAGCAGACACCAGAATTTCTTCAGAGCTCTGCTACTGTGTCCGACTTCCTCCTCAGTGGAGGGAGCCGCCGTGCTTGGCAATCTCTCTCCCGACTAGGAAATGTTCTTAAATGGTGCTTAATTAAGTCTTGAGGAAGAAA-3’。

重组后所得质粒产物即为4930573I07Rik过表达质粒(pCDH-4930573I07Rik)，将所得质粒进行转化扩增与质粒提取。转化扩增与质粒提取步骤与实施例1中pCDH-LINC02418质粒相同。以293T细胞作为转染工具细胞，使用三质粒系统包装4930573I07Rik过表达慢病毒载体，包装步骤与实施例1中LINC02418过表达慢病毒载体包装步骤相同。

构建过表达EV和过表达4930573I07Rik(序列4)的LLC细胞，分别命名为EV-LLC细胞和4930573I07Rik-LLC细胞。EV和4930573I07Rik过表达慢病毒载体转入LLC细胞的步骤与实施例1中LINC02418过表达慢病毒载体转入H1703细胞的步骤相同。

将实验小鼠(体重18±0.35g)随机分为3组，每组15只，分别使用EV-LLC细胞、4930573I07Rik-LLC细胞通过皮下注射接种不同组小鼠，构建荷瘤小鼠。其中(1)对照组注射EV-LLC细胞(15只小鼠形成皮下肿瘤)，(2)EV组注射EV-LLC细胞(14只小鼠形成皮下肿瘤)，(3)4930573I07Rik组注射4930573I07Rik-LLC细胞(14只小鼠形成皮下肿瘤)，注射剂量均为2×10

将每3天测量的小鼠肿瘤体积(游标卡尺)绘制成瘤曲线，将各组每只小鼠的成瘤曲线均进行单独绘制。成瘤曲线结果显示，接受低剂量PD-L1单克隆抗体治疗的荷瘤小鼠的肿瘤生长(图4中B中的(2)和(3)所代表)均慢于对照组接受IgG2a抗体治疗的荷瘤小鼠(图4中B中的(1)所代表)；同时4930573I07Rik组荷瘤小鼠的肿瘤生长(图4中B中的(3)所代表)显著慢于EV组(图4B中的(2)所代表)，并且在14只小鼠中有2只小鼠最终存活。

依据各组小鼠死亡及存活情况绘制存活曲线。存活曲线结果显示，接受低剂量PD-L1单克隆抗体治疗的荷瘤小鼠生存时间(图4中C中的(2)和(3)所代表)均长于对照组接受IgG2a抗体治疗的荷瘤小鼠(图4中C中的(1)所代表)；同时4930573I07Rik组荷瘤小鼠的生存时间(图4中C中的(3)所代表)显著长于EV组(图4C中的(2)所代表)。

因此，PD-L1单克隆抗体对NSCLC肿瘤具有显著的治疗作用，并且4930573I07Rik的过表达与PD-L1单克隆抗体具有协同治疗作用，使小鼠体内的肿瘤得到了更有效的抑制。

将上述不同分组的荷瘤小鼠的肿瘤组织冷冻切片后进行免疫组化(immunohistochemical,IHC)染色，以观察PD-L1及Ki67(细胞增殖核抗原)的水平；并且进行Tunel(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)检测和DAPI荧光染色分析细胞凋亡情况。

IHC结果显示，接受IgG2a抗体治疗的对照组(图5中左图(1)所代表)其PD-L1染色较深、Ki67染色中染为深色的细胞数量较多。对过表达EV的肿瘤组织给予PD-L1单克隆抗体治疗后(图5中左图(2)所代表)其PD-L1染色颜色变为浅色、Ki67染色中染为深色的细胞数量显著减少，证明其PD-L1和Ki67水平显著降低。而在给予同等剂量PD-L1单克隆抗体治疗的情况下，过表达4930573I07Rik的肿瘤组织(图5中左图(3)所代表)中PD-L1染色进一步变淡、Ki67染色中染为深色的细胞数量进一步减少，证明其PD-L1和Ki67水平进一步降低。细胞凋亡分析结果显示，过表达EV的肿瘤组织给予PD-L1单克隆抗体治疗后其细胞凋亡比例显著升高(图5中右下图(2)所代表)。在给予同等剂量PD-L1单克隆抗体治疗的情况下，过表达4930573I07Rik的肿瘤组织中细胞凋亡比例(图5中右下图(3)所代表)进一步升高。由以上结果可知，4930573I07Rik在体内可通过调控PD-L1表达水平实现与PD-L1单克隆抗体协同抗肿瘤的作用。

实施例4、临床样本分析LINC02418表达水平对PD-L1水平的影响

通过荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)评估27个人肺腺癌临床样本(均与患者签署知情同意书，经中国人民解放军总医院第一医学中心伦理委员会通过)中LINC02418的表达，通过IHC染色评估PD-L1的表达。27份肺腺癌样本分为两组，一组为LINC02418低水平表达组，另一组为LINC02418高水平表达组。图6中左图的case 1表示LINC02418高水平表达组的代表性样本，case 2表示LINC02418低水平表达组的代表性样本。

结果显示，LINC02418在肺腺癌样本中的表达与PD-L1的表达呈负相关。当LINC02418表达水平较高时PD-L1的表达水平较低，而当LINC02418表达水平较低时PD-L1的表达水平则较高。临床样本进一步证实了LINC02418在人肺腺癌细胞中对PD-L1的负向调控作用，本发明针对LINC02418的发现将为NSCLC提供新的肿瘤标志物和治疗靶点。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。