一种柠檬酸交联蛋白质-多糖复合凝聚纳米胶囊的制备方法

技术领域

本发明属于微胶囊包埋技术领域，具体涉及一种柠檬酸交联蛋白质-多糖复合凝聚纳米胶囊的制备方法。

背景技术

微胶囊技术作为一种包埋技术，已广泛应用于香精香料、药物的包覆，其能有效隔离芯材与外界环境，可有效解决上述易挥发损失及变质等问题。微胶囊同时可起到缓释控释、液态芯材固态粉末化等独特作用，为香精香料、医药工业及其他衍生产品的发展提供了广阔的机遇与前景。

与微胶囊相比，纳米胶囊具有更小的尺寸，能够提供更大的表面积，增加被动细胞吸收机制，有助于提高营养物质的溶解度和生物利用度。因此，由于纳米胶囊独特的物理化学和生物学特性，人们对其在功能性食品和饮料以及制药工业等领域中的应用产生了相当大的兴趣。

复合凝聚法常用于疏水性物质的纳米胶囊化，该方法具有温和的制备过程和安全的反应条件，包封效率高、载油量高等优点。通过控制静电作用强度可以改变形成复合物的大小，按照人们的意愿制备微米级胶囊或纳米胶囊。通过复合凝聚法制得的纳米胶囊具有较高的承载能力和耐热性。在复合凝聚过程中，通过调节蛋白质和多糖间的静电作用强度，可以分别得到微米级和纳米级复合物。但是与微胶囊的制备相比，纳米胶囊的形成条件要严格得多，只有少数具有适度电荷密度的蛋白质和多糖组合可以通过调节特定条件，在可溶性复合物阶段形成纳米复合物。文献报道，复合凝聚获得的纳米胶囊在某些pH或离子强度的条件下稳定性不佳。除此之外，部分纳米胶囊的壁材由人工合成的有机化合物组成，其存在一定的生物相容性问题。因此设计和开发高效、生物相容的纳米胶囊制备技术是急需的解决的难题。

发明内容

本发明旨在利用一种天然生物交联剂柠檬酸，使其交联蛋白质-多糖复合凝聚体，从而获得一种新型纳米胶囊的制备方法。目前尚未有关于柠檬酸交联蛋白质-多糖纳米胶囊的文献或报道。

本发明提供了一种包埋率高、稳定性好、生物相容性好、高效的包埋率的纳米胶囊制备方法，该方法以蛋白质和多糖为壁材，柠檬酸作为交联剂，通过复合凝聚法制备纳米胶囊。

进一步，所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠、明胶、豌豆蛋白、丝素蛋白中的一种或者多种。

进一步，所述多糖为阿拉伯胶、果胶、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、黄原胶中的一种或者多种。

本发明提供一种柠檬酸交联蛋白质-多糖复合凝聚纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)壁材溶液的制备：将蛋白质和多糖分别溶解在水中，形成蛋白质溶液和多糖溶液；

(2)O/W乳状液的制备：在蛋白质溶液中加入芯材，均质乳化制得O/W乳状液；

(3)复合凝聚过程：向步骤(2)中制得的O/W乳状液中滴加步骤(1)制得的多糖溶液，搅拌均匀后，调节pH为酸性，之后继续搅拌，得到混有多糖酸性的O/W乳状液；

(4)交联过程：在步骤(3)中制得的混有多糖酸性的O/W乳状液加入柠檬酸进行交联反应，搅拌得到交联后的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊分散液冷冻干燥后，制得纳米胶囊粉末。

进一步，所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠、明胶、豌豆蛋白、丝素蛋白中的一种或者多种。

进一步，所述多糖为阿拉伯胶、果胶、壳聚糖、海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、黄原胶中的一种或者多种。

进一步的，步骤(1)中所述蛋白质溶液中蛋白质的质量分数为0.1-10％；多糖溶液中多糖的质量分数的浓度为0.1-10％。

优选的，步骤(1)中所述蛋白质溶液中蛋白质的质量分数为0.4-0.6％；多糖溶液中多糖的质量分数的浓度为0.4-0.6％。

进一步的，所述步骤(2)中芯材为油溶性的香精、药物、不饱和油脂的一种或多种。

优选的，所述步骤(2)中芯材为β-紫罗兰酮、香草兰精油、紫苏精油、肉桂精油、噻唑膦、嘧菌酯、辣根素的一种或多种。

进一步的，步骤(2)中芯材的添加量为蛋白质溶液总质量分数的0.05％-5％。

优选的，步骤(2)中芯材的添加量为蛋白质溶液总质量分数的0.1％-0.3％。

进一步的，步骤(3)滴加的多糖和O/W乳状液中的蛋白质质量比为1：(0.5～2)。

优选的，步骤(3)滴加的多糖和O/W乳状液中的蛋白质质量比为1：1。

进一步的，步骤(3)pH调节为1～7。

优选的，步骤(3)pH调节为3～7。

进一步的，步骤(4)中柠檬酸的添加量混有多糖酸性的O/W乳状液中的总质量的0.001％-3％。

优选的，步骤(4)中柠檬酸的添加量混有多糖酸性的O/W乳状液中的总质量的0.01％-0.05％。

本发明提供根据上述方法制备得到的微胶囊。

本发明的有益效果：

1、本发明制备的纳米胶囊粒径约150-200nm，包埋率大于69％。

2、本发明制备的纳米胶囊耐热性好，可以保护芯材在230℃以下缓慢释放，并且具有良好的缓释性能，4℃下的贮藏20天纳米胶囊芯材释放率仅为35.4％，保质期长。

3、本发明选用柠檬酸作为交联剂，该天然生物交联剂生物相容性好，价格便宜，来源广泛，无毒无害。本发明拓宽了柠檬酸的应用范围，并且增加可制备微胶囊的原料来源。

4、本发明所采用的制备方法温和安全、操作简单、效率高、重复性好，且壁材原料生物相容性好，来源广泛，在日化、食品和药物递送等领域具有广阔的市场前景。

附图说明

图1所示为本发明实施例1的制备方法得到的纳米胶囊的扫描电镜照片。

图2所示为实施例1的纳米胶囊的原子力显微镜照片。

图3所示为柠檬酸、未交联的纳米胶囊和柠檬酸交联的纳米胶囊的红外光谱图。

图4为实施例1纳米胶囊贮藏20天纳米胶囊粒径图。

图5所示为实施例1多分散指数(PDI)图。

图6所示为实施例1纳米胶囊贮藏20天的芯材释放率图。

具体实施方式

原料来源

阿拉伯胶购自Aladdin公司、柠檬酸购自Accela公司、其余精油和蛋白质、多糖均购自Adamas-beta公司。

测试过程

1、包埋率的测定

标准曲线的绘制：(用于计算芯材浓度)利用紫外分光光度法计算纳米胶囊中疏水活性物的含量。取0.5g芯材于50mL容量瓶中，用无水乙醇定容，制得一系列浓度梯度的标准溶液。并用紫外分光光度计测定标准溶液在最大吸收波长下的吸光度，绘制芯材-乙醇紫外标准曲线并得出标准曲线回归方程。

包埋率测定方法：

使用有机溶剂萃取法测定纳米颗粒的包埋率。

芯材总含量的测定主要使用无水乙醇进行萃取。吸取一定体积的纳米颗粒溶液，以1:4的体积比(纳米颗粒溶液：无水乙醇)添加无水乙醇，将溶液超声1h使纳米颗粒破碎，以促进芯材完全溶出。超声提取后，将样品以3000rpm离心10min，并利用紫外分光光度计方法对稀释至合适浓度的样品溶液中的芯材含量进行测定。

使用正己烷溶液萃取来测量表面油含量。吸取2mL的样品溶液于10mL的离心管中，加入5mL的正己烷溶液，漩涡震荡30s，吸取上层溶液，经过适当的稀释，用紫外分光光度计中测量芯材含量。经过上面获得的标准曲线方程计算后，根据下面的公式计算纳米颗粒的包埋率。

包埋率％＝(1-表面油含量/芯材总含量)×100％

2、多分散指数(PDI)的测定

采用PALS(相位分析光散射)技术，利用Zeta电位及纳米粒度分析仪对纳米胶囊粒径分布以及zeta电位进行测定。测定前需将样品稀释至合适浓度。PDI数据在粒径测定过程中由仪器同时给出。

3、纳米胶囊耐热性的测定

通过热重分析仪测得。将制备好的纳米颗粒溶液进行冷冻干燥，然后称取3mg～5mg的样品于坩埚中进行热重分析(TGA)。设置升温范围为30℃～500℃，升温速率为20℃/min，氮气流速为20mL/min。

4、20天纳米胶囊芯材释放率的测定

所有新鲜制备的样品均在4℃下保存一段时间(20d)。利用Zeta电位及纳米粒度分析仪测定粒径分布，以监测所有样品的储存稳定性。通过紫外分光光度计法分析测定芯材的含量。并通过以下公式计算芯材的释放率。

释放率％＝1-包埋率％

实施例1：柠檬酸交联玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶复合凝聚β-紫罗兰酮纳米胶囊

首先将玉米醇溶蛋白、阿拉伯胶粉末分别分散在去离子水中，玉米醇溶蛋白和阿拉伯胶在去离子水中的质量分数均为0.5％，在玉米醇溶蛋白溶液中加入质量分数为0.3％的芯材β-紫罗兰酮，之后用均质机将混有β-紫罗兰酮的玉米醇溶蛋白溶液均质(11000r/min)乳化制得O/W乳状液，然后逐滴向O/W乳状液中滴加阿拉伯胶溶液(阿拉伯胶和玉米醇质量比为1：1)，搅拌30min后，用乙酸(浓度为10％)将混有阿拉伯胶溶液的O/W乳状液pH调节至4，之后加入占调酸过后的混有阿拉伯胶溶液的O/W乳状液质量分数为0.01％的柠檬酸搅拌进行交联反应，反应3h后得到柠檬酸交联纳米胶囊分散液，将得到的柠檬酸交联纳米胶囊分散液冷冻干燥后，制得纳米胶囊粉末。

对实施例1制得的纳米胶囊进行红外光检测，结果如图3所示，柠檬酸的光谱在3290cm

实施例2

参照实施例1的步骤进行制备，仅将玉米醇溶蛋白和多糖在去离子水中的质量分数调整为1％、3％、5％、7％、10％。

实施例3

参照实施例1的步骤进行制备，仅将芯材浓度调整为0.05％、0.1％、1％、3％、5％。

实施例4

参照实施例1的步骤进行制备，仅将复合凝聚反应pH调整为2、3、5、6、7。

实施例5

参照实施例1的步骤进行制备，仅将柠檬酸添加量调整为0.001％、0.1％、1％、3％。

实施例6

本实施例为纳米胶囊的粒径、多分散指数、包埋率检测，取实施例1～5制得的纳米胶囊分散液进行检测。

对于实施例2的实验，发现了总质量分数对纳米胶囊的影响，结果如下表所示：

当质量浓度大于3％时形成的为微米级胶囊，综上质量分数为0.5％时粒径和PDI最小，且包埋率最高。

对于实施例3的实验，发现了芯材浓度对纳米胶囊的影响，结果如下表所示：

尽管芯材浓度为0.05％时包埋率最高，但此时芯材浓度较小，从经济角度来看生产效率过低，因此综合来看芯材浓度为0.3％时最好，当芯材浓度为5％时，无法形成纳米胶囊。

对于实施例4的实验，发现了复合凝聚反应pH对纳米胶囊的影响，结果如下表所示：

当pH为2、6、7条件下，由于此时不满足静电作用范围，因此无法形成纳米胶囊，综上复合凝聚pH为4时粒径和PDI最小，且包埋率最高。

对于实施例5的实验，发现了柠檬酸添加量对纳米胶囊的影响，结果如下表所示：

发现柠檬酸添加量为0.01％时粒径和PDI最小，且包埋率最高。

因此，玉米醇溶蛋白最佳制备条件为：玉米醇溶蛋白和阿拉伯胶浓度为0.5％、芯材浓度为0.3％、复合凝聚pH为4、柠檬酸添加量为0.01％，此时纳米胶囊粒径和PDI最小且包埋率最高，纳米胶囊粒径为156.2nm，PDI＝0.274，包埋率为79.7％。

实施例7～11为替换了蛋白质、多糖、芯材的实施例，所有的实施例都进行了如实施例2～5的优化实验，为防止赘述，记载的皆为最优的配比。

实施例7：柠檬酸交联乳清蛋白-果胶复合凝聚香草兰精油纳米胶囊

将乳清蛋白、果胶分别分散在去离子水中，乳清蛋白和果胶的浓度均为0.6％，然后在乳清蛋白溶液中加入0.2％的芯材草兰精油，用膜乳化机将其乳化制得O/W乳状液，逐滴向乳状液中滴加果胶溶液，搅拌30min后用乙酸(浓度为10％)将体系pH调节至pH＝7，加入0.04％的柠檬酸进行交联反应，搅拌4h后得到柠檬酸交联的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊冷冻干燥后，可以进一步制得纳米胶囊粉末。

实施例8：柠檬酸交联大豆分离蛋白-卡拉胶复合凝聚肉桂精油纳米胶囊

将大豆分离蛋白、卡拉胶分别分散在去离子水中，大豆分离蛋白和卡拉胶的浓度均为0.6％，在大豆分离蛋白溶液中加入0.3％的芯材肉桂精油，用均质机将其乳化制得O/W乳状液，逐滴向乳状液中滴加卡拉胶溶液，搅拌30min后用乙酸(1％和10％，v/v)将体系pH调节至pH＝3，加入0.02％的柠檬酸进行交联反应，搅拌3h后得到柠檬酸交联的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊冷冻干燥后，可以进一步制得纳米胶囊粉末。

实施例9：柠檬酸交联丝素蛋白-果胶复合凝聚香草兰精油纳米胶囊

将丝素蛋白、果胶分别分散在去离子水中，丝素蛋白和果胶的浓度均为0.4％，在丝素蛋白溶液中加入0.1％的芯材香草兰精油，用均质机将其乳化制得O/W乳状液，逐滴向乳状液中滴加果胶溶液，搅拌1h后用乙酸(浓度为10％)将体系pH调节至pH＝4，加入0.01％的柠檬酸进行交联反应，搅拌3h后得到柠檬酸交联的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊冷冻干燥后，可以进一步制得纳米胶囊粉末。

实施例10：柠檬酸交联乳清蛋白-果胶复合凝聚辣根素纳米胶囊

将乳清蛋白、果胶分别分散在去离子水中，乳清蛋白和果胶的浓度均为0.6％，然后在乳清蛋白溶液中加入0.2％的芯材辣根素，用膜乳化机将其乳化制得O/W乳状液，逐滴向乳状液中滴加果胶溶液，搅拌30min后用乙酸(浓度为10％)将体系pH调节至pH＝6，加入0.05％的柠檬酸进行交联反应，搅拌3h后得到柠檬酸交联的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊冷冻干燥后，可以进一步制得纳米胶囊粉末。

实施例11：柠檬酸交联明胶-阿拉伯胶复合凝聚噻唑膦纳米胶囊

将明胶、阿拉伯胶分别分散在去离子水中，明胶和阿拉伯胶的浓度均为0.6％，然后，逐滴向明胶溶液中滴加阿拉伯胶溶液，明胶和阿拉伯胶的浓度均为0.4％，然后在明胶溶液中加入0.3％的芯材噻唑膦，用均质机将其乳化制得O/W乳状液，逐滴向乳状液中滴加阿拉伯胶溶液，搅拌30min后用乙酸(浓度为10％)将体系pH调节至pH＝4，加入0.04％的柠檬酸进行交联反应，搅拌4h后得到柠檬酸交联的纳米胶囊分散液，将得到的纳米胶囊冷冻干燥后，可以进一步制得纳米胶囊粉末。

实施例12

本实施例为纳米胶囊的缓释性能测试，取实施例1、7～11制得的纳米胶囊分散液，在4℃下的相同环境中保存20天，每隔五天取样进行测试。

实施例1在保存20天后，释放率为35.4％；实施例6为38.1％；实施例7为43.2％；实施例8为31.3％；实施例9为37.9％；实施例10为35.8％。

实施例1、7～11在缓释性能测试中都表现出良好的缓释性能，释放率在31.3％-43.2％之间，其中实施例8在缓释性能测试中表现出最好的缓释性，释放率较低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。