一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒，具体涉及细菌葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法及试剂盒，属于生物催化技术领域。

背景技术

为检测葡萄糖基转移酶的活性，目前通常是采用酶谱法。其操作过程是先将样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）凝胶电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的葡萄糖基转移酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带颜色的深浅与葡萄糖基转移酶活性成正比。该方法存在的缺陷包括：（1）检测方法实验周期长，一般需要2～3天；（2）操作过程较为复杂，涉及到SDS-PAGE凝胶电泳等多个操作步骤，对实验结果的影响因素较多；（3）孵育液中含剧毒药品，具备一定风险性；（4）蛋白酶的活性对实验结果影响较大，结果为图像数据，难以定量分析；（5）受到电泳等实验环节限制，难以实现葡萄糖基转移酶抑制剂的快速和高通量筛选。

现有技术中，公开号为CN104178554A的发明专利公开了羟甲唑啉作为葡萄糖醛酸转移酶UGT1A9 专属性底物的应用，通过采用羟甲唑啉作为底物，将其在生物体系中进行葡萄糖醛酸化反应，通过定量测定单位时间内底物的消除量或者葡萄糖醛酸化产物的生成量来测定生物体系中的UGT1A9酶活性。以及公开号为CN112695070A的发明专利公开了一种糖基转移酶活性测定新方法，该方法通过构建UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶与蔗糖合酶的偶联反应体系，利用DNS显色法检测双酶偶联反应产生的果糖，从而建立基于颜色反应的糖基转移酶的活性检测或筛选方法，具有操作简便、成本低，通量高等优点，可用于UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶的活性测定、新型UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶的筛选、UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶突变的活性筛选等方面。上述专利中，由于羟甲唑啉具有高度的UGT 代谢酶选择性（只由UGT1A9代谢），而UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶与蔗糖合酶构建的偶联反应体系也仅适用于UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶的活性检测，因此，在除UGT1A9和UDP外的葡萄糖基转移酶活性检测时，是否仍然能够发挥其反应活性，还有待实验证明。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法，该方法以蔗糖作为唯一底物，T70葡聚糖作为后续生产的聚糖链接载体，通过葡聚糖转移酶与蔗糖反应生成葡聚糖，并通过其吸光度值来反映葡聚糖转移酶的活性，适用于多种葡聚糖转移酶的活性简单，具有检测周期短、操作流程简单、检测结果准确、无毒无污染等诸多优点，明显优于现有酶谱法的检测流程，具有良好的应用前景。为此，本发明还提供了一种快速检测葡萄糖基转移酶活性的试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法，以含有T70葡聚糖和蔗糖的磷酸钠缓冲液为底物，加入待检测的葡萄糖基转移酶进行反应，测定终产物葡聚糖的吸光度值，从而获得葡萄糖基转移酶的酶活性。

将所述底物中T70葡聚糖的质量浓度控制在0.2%。

将所述底物中蔗糖的质量浓度控制在2.5%。

所述待检测的葡萄糖基转移酶为变异链球菌中的葡糖基转移酶，包括GtfBCD、GtfB、GtfC或GtfD。

所述底物中，待检测的葡萄糖基转移酶的加入量控制在22.5～45μg。

所述反应时，控制反应体系的pH为6～7，反应温度为37℃，反应时间为10～12h。

向所述反应体系中加入NaOH和/或HCl，来调节反应体系的pH值。

所述吸光度值为540nm下终产物葡聚糖的最大吸光度值。

本发明还提供了一种快速检测葡萄糖基转移酶活性的试剂盒，包含检测试剂，所述检测试剂为含有T70葡聚糖和蔗糖的磷酸钠缓冲液。

进一步的，所述检测试剂中，T70葡聚糖的质量浓度控制在0.2%，蔗糖的质量浓度控制在2.5%。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明方法明显优于现有酶谱法的检测流程，具有检测时间短、操作流程简单、实验周期短、使用试剂无毒无污染的优点，具体而言，

A.酶谱法检测所需时间较长，需要进行制胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、脱色、染色等步骤，实验周期一般需要2～3天；而本发明方法耗时较短，一般在10h左右。葡萄糖基转移酶以蔗糖为唯一底物，生成葡聚糖的产量以吸光度值来表现，反应大概在10h左右进入拐点，后续变化幅度较小。

B.酶谱法操作较为复杂，涉及到SDS-PAGE凝胶电泳等操作过程，需要进行培训和学习才能完成实验；而本发明法操作简便，易于实现，且结果易于统计分析，更不需进行SDS-PAGE凝胶电泳，可以在普通的96孔板里实现，通过加入底物和酶来实现反应。

C.酶谱法实验周期较长，且一次操作只能加入几个样品，难以实现高通量的快速筛选；而本发明方法实验周期短，且可以实现高通量的快速筛选，实际操作时，可在96孔板里进行筛选，一个孔板里可以添加几十个反应，操作时可以多个孔板同时进行实验，实现对抗菌药物的高通量筛选。

D.酶谱法需要使用孵育液，涉及到剧毒药品的使用，具有一定的风险性；而本发明方法所需化学品常见且易于获得，无毒环保，减少金钱的浪费。

（2）本发明方法首次提供了适用于变异链球菌中的葡糖基转移酶GtfB/C/D的活性检测，通过采用蔗糖作为唯一的特异性底物而进行反应，反应体系中不存在其他影响反应活性的杂质，T70葡聚糖作为后续生成的聚糖链接载体，并通过合理控制其反应过程中的pH值、反应时间和反应温度，可以有效的反映待检测酶的活性，使得检测结果更加准确。

（3）本发明通过对变异链球菌中的葡糖基转移酶GtfB/C/D的活性检测，可以适用于龋病发病机制研究、药物开发、公共卫生等领域，有助于抗龋防龋药物的快速筛选以及快速评估患者的龋风险等。

附图说明

图1为不同底物对葡糖基转移酶转移酶催化活性的影响（37℃）。

图2为不同底物对葡糖基转移酶转移酶催化活性的影响（25℃）。

图3为反应体系不同pH对葡糖基转移酶催化活性的影响。

图4为反应体系不同金属离子对葡糖基转移酶催化活性的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法。

首先，在96孔板的A1、A2、A3孔中加入200µL含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶GtfBCD，B1、B2、B3加入200ul含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的乳糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶，以此类推，均做三个复孔；然后，调节反应体系的pH为6后，在所有加入样品的孔中以50µL矿物油封层，保持体系稳定，反应温度控制在37℃，待反应10h后，采用全波长酶标仪，在吸光度值OD=540nm处连续检测24h，即得GtfBCD的反应活性。

实施例2：

本实施例是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法。

首先，在96孔板的A1、A2、A3孔中加入200µL含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶GtfB，B1、B2、B3加入200ul含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的乳糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶，以此类推，均做三个复孔；然后，调节反应体系的pH为7后，在所有加入样品的孔中以50µL矿物油封层，保持体系稳定，反应温度控制在37℃，待反应10h后，采用全波长酶标仪，在吸光度值OD=540nm处连续检测24h，即得GtfB的反应活性。

实施例3：

本实施例是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法。

首先，在96孔板的A1、A2、A3孔中加入200µL含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶GtfC，B1、B2、B3加入200ul含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的乳糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶，以此类推，均做三个复孔；然后，调节反应体系的pH为6.5后，在所有加入样品的孔中以50µL矿物油封层，保持体系稳定，反应温度控制在37℃，待反应11h后，采用全波长酶标仪，在吸光度值OD=540nm处连续检测24h，即得GtfC的反应活性。

实施例4：

本实施例是一种葡萄糖基转移酶活性的快速检测方法。

首先，在96孔板的A1、A2、A3孔中加入200µL含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶GtfD，B1、B2、B3加入200ul含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的乳糖的0.2M磷酸钠缓冲液底物以及15µL的葡聚糖转移酶，以此类推，均做三个复孔；然后，调节反应体系的pH6.5为后，在所有加入样品的孔中以50µL矿物油封层，保持体系稳定，反应温度控制在37℃，待反应12h后，采用全波长酶标仪，在吸光度值OD=540nm处连续检测24h，即得GtfD的反应活性。

实施例5：

本实施例是一种快速检测葡萄糖基转移酶活性的试剂盒。

该试剂盒中具有检测试剂及其他辅助材料，如96孔板、矿物油等等，该检测试剂为含有0.2%的T70葡聚糖和2.5%的蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液。在进行检测时，可采用上述实施例1至实施例4所述的快速检测方法进行检测。

实验部分：

（一）不同底物对葡糖基转移酶转移酶催化活性的影响

采用实施例1所述快速检测方法，分别替换其中的底物（浓度不变），如下表1所示。

表1 不同底物的组成表

分别在37℃和25℃下进行反应，测量GtfBCD的反应活性，测试结果参见图1和图2。由图1可知，37℃条件下，在含有不同底物的体系中加入同等量葡糖基转移酶GtfBCD，当底物为T70葡聚糖和蔗糖时（即实施例1），葡糖基转移酶GtfBCD的活性最佳，葡聚糖生成量最多。由图2可知，25℃条件下，在含有不同底物的体系中加入同等量葡糖基转移酶GtfBCD，当底物为T70葡聚糖和蔗糖时，葡糖基转移酶GtfBCD的活性最佳，葡聚糖生成量最多。

（二）反应体系中不同pH值对葡糖基转移酶转移酶催化活性的影响

采用实施例1所述快速检测方法，通过添加NaOH或HCl，分别调整反应系统的pH值，如下表2所示。

表2 反应体系的不同pH值

在37℃下进行反应，测量GtfBCD的反应活性，测量结果参见如图3。

由图3可知，反应体系pH值在6～7范围内，葡糖基转移酶GtfBCD的活性最佳，葡聚糖生成量最多。

（三）反应体系中不同金属离子对葡糖基转移酶催化活性的影响

采用实施例1所述快速检测方法，分别向反应体系中添加不同的金属离子（100μM），如下表3所示。

表3 反应体系的不同金属离子的添加

在37℃下进行反应，测量GtfBCD的反应活性，测量结果参见如图4。

由图4可知，向反应体系中添加不同金属离子（100 μM）并未影响葡糖基转移酶活性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。