一种BMP2激动剂及在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及BMP2激动剂的发现与在干细胞诱导分化中的应用，具体涉及一种BMP2激动剂及在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种来源于胚胎发育时期的中胚层细胞，具有较强的自我复制和多项分化潜能的成体干细胞。科学研究发现，BMSCs在特定的环境和培养条件下能够分化成为多种功能性细胞，如心肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及成骨细胞等。同时，BMSCs因为具有易于分离和培养、生长迅速以及多项分化和低免疫等特点在干细胞治疗中发挥重要作用。骨质疏松是一种以骨丢失和骨组织结构退化为特征的慢性骨代谢紊乱，随着老年人口的增长，骨质疏松已成为世界范围内的主要公共卫生问题。通过诱导BMSCs成骨分化已经成为一种治疗骨质疏松的干细胞治疗手段。

BMPs家族成员较多，至今已有40多种BMP蛋白被成功地分离。其中BMP2是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的多功能细胞因子，可在骨损伤局部及异位促进细胞增殖，提高其碱性磷酸酶活性，也是唯一能够单独在异位诱导成骨形成的信号分子，这使其在骨关节疾病特别是骨折、骨缺损的临床治疗中具有极大的潜在应用价值。研究表明BMP2是BMP家族成员中骨诱导作用最强的因子，大量实验也证实了将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成，促进BMP2表达可以促进BMSCs成骨分化。

BMP2激动剂的寻找和发现对促进BMSCs成骨分化研究具有重要意义。现有已经发现的BMP2激动剂的数量和种类尚欠缺，无法很好满足BMSCs成骨分化用于干细胞治疗的需求。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术不足，提供一种BMP2激动剂及在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。

本发明目的通过下面的技术方案实现：

一种BMP2激动剂，该BMP2激动剂为巴西苏木素。

上述BMP2激动剂在促进骨髓间充质干细胞增殖、诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。MTT实验显示，10μMA值＞5μMA值＞0μMA值，说明巴西苏木素有效促进BMSCs增殖，且巴西苏木素浓度越高，对BMSCs的促增殖作用越强。茜素红染色结果显示，5μM矿化结节＞0μM矿化结节，说明巴西苏木素有效促进BMSCs成骨分化。

进一步地，所述应用为用于制备促进骨髓间充质干细胞增殖、诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基。

本发明取得的有益效果：

已知BMP2是BMP家族成员中骨诱导作用最强的因子，大量实验也证实了将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成，促进BMP2表达可以促进BMSCs成骨分化。本发明巴西苏木素有效促进BMP2 mRNA、BMP2蛋白表达，为一种有效的BMP2激动剂，这可能是巴西苏木素发挥促进BMSCs成骨分化的关键机制。同时，巴西苏木素可以有效促进BMSCs增殖。综合来看，巴西苏木素在BMSCs体外培养和诱导分化方面应用前景广阔。

附图说明

图1为光学显微镜下观察到的细胞形态。

图2中A为琼脂糖凝胶电泳测定结果，B为Western blot测定结果，C为茜素红染色结果。

具体实施方式

为了更好地介绍本发明，下面通过具体实施例详细阐述本发明的实质性内容，但需要注意并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

一、实验材料

DMEM/F12培养基购自Gibco公司。

胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。

双抗购自Sigma-Aldrich公司。

胰酶购自Sigma-Aldrich公司。

巴西苏木素购自上海源叶(B20024)，分析标准品，HPLC≥98％。

TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒购自碧云天。

Westernblot一抗、二抗购自碧云天。

人BMSCs成骨分化诱导培养基购自赛业(广州)生物科技有限公司。

二、实验方法

1、BMSCs培养

人BMSCs购自弗元(上海)生物科技有限公司，来自健康成年男性的骨髓。复苏后，用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养基于37℃、5％CO

2、MTT检测BMSCs增殖

取生长状态良好的传代BMSCs，胰酶消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬，调整细胞密度为5×10

3、琼脂糖凝胶电泳测定BMP2 mRNA表达水平

取生长状态良好的传代BMSCs，胰酶消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬，以3×10

4、Westernblot测定BMP2蛋白表达水平

取生长状态良好的传代BMSCs，胰酶消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬，以3×10

5、成骨诱导分化

取生长状态良好的传代BMSCs，胰酶消化，用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬，以5×10

6、统计学分析

所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，多组之间比较采用ANOVA分析方法，两组间差异的比较采用t检验方法，P＜0.05具有显著差异，采用SPSS20.0进行相关数据统计分析。

三、实验结果

1、BMSCs培养

细胞贴壁生长，光学显微镜下观察到细胞呈梭形，整体分布呈旋涡状，如图1所示。符合人BMSCs的生长特点，生长状态良好。

2、BMSCs增殖

酶标仪测定的490nm波长处光密度(A)值见表1，A值与细胞数量成正比例相关。从表1的A值可以看出，10μMA值＞5μMA值＞0μMA值，说明巴西苏木素有效促进BMSCs增殖，且巴西苏木素浓度越高，对BMSCs的促增殖作用越强。

表1490nm波长处光密度(A)值

3、BMP2 mRNA表达水平

琼脂糖凝胶电泳的测定结果见图2中A，从图2中A可以看出，10μM BMP2 mRNA表达水平＞5μM BMP2 mRNA表达水平＞0μM BMP2 mRNA表达水平，说明巴西苏木素有效促进BMSCs中BMP2 mRNA表达，且巴西苏木素浓度越高，促进作用越强。

4、BMP2蛋白表达水平

Western blot的测定结果见图2中B，从图2中B可以看出，10μM BMP2蛋白表达水平＞5μM BMP2蛋白表达水平＞0μM BMP2蛋白表达水平，说明巴西苏木素有效促进BMSCs中BMP2蛋白表达，且巴西苏木素浓度越高，促进作用越强。

5、茜素红染色

茜素红染色结果见图2中C，从图2中C可以看出，5μM矿化结节＞0μM矿化结节。只有成骨分化产生矿化结节后才能被茜素红染色，未分化的BMSCs不会被染色。一般成骨分化诱导培养基需要诱导培养7d左右才能观察到一定的矿化结节。从图中可以看出，0μM组在诱导7d时观察到较弱的成骨分化，而5μM组在诱导7d时已经可以观察到非常明显的成骨分化。因此，该染色结果说明巴西苏木素有效促进BMSCs成骨分化。

已知BMP2是BMP家族成员中骨诱导作用最强的因子，大量实验也证实了将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成，促进BMP2表达可以促进BMSCs成骨分化。本发明巴西苏木素有效促进BMP2 mRNA、BMP2蛋白表达，为一种有效的BMP2激动剂，这可能是巴西苏木素发挥促进BMSCs成骨分化的关键机制。同时，巴西苏木素可以有效促进BMSCs增殖。综合来看，巴西苏木素在BMSCs体外培养和诱导分化方面应用前景广阔。

实施例2：

一种促进骨髓间充质干细胞增殖、诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的培养基，含有活性成分巴西苏木素。

上述实施例的作用是为了详细阐述本发明的实质性内容，但需要强调的是，本领域技术人员不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。