一种纳豆激酶液态发酵工艺

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体为一种纳豆激酶液态发酵工艺。

背景技术

血栓栓塞与心肌梗死、脑卒中和静脉血栓栓塞症这三大类心血管疾病密切相关，在现代人的不合理膳食和老龄化的形势下，心脑血管疾病会给人们带来严重的健康威胁。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种丝氨酸蛋白溶纤酶，由275个氨基酸组成，等电点(pI)为8.6，平均分子量为27.7kDa。纳豆激酶作为一种食物补充剂，其强大的抗血栓/纤溶活性对心血管健康产生许多有益影响，此外纳豆激酶还具有降血脂、降血压、保护神经系统、抗肿瘤等功能。

纳豆激酶主要由芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)在发酵时产生，目前大多数产纳豆激酶的菌株都是从发酵食品中分离出来的。传统上纳豆激酶是以黄豆为主要发酵基质的固态发酵方式获得的，但在进行大规模的固态发酵过程中会存在染菌等问题，不同批次间的产量差异也较大。相比之下液态发酵有生产工艺简单、成本低和易于放大等优势，但现有的纳豆激酶液态发酵工艺酶活较低，无法满足大规模生产需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳豆激酶的液态发酵工艺，通过优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵培养基及补料工艺可以充分提升高酶活纳豆激酶的生产能力，同时提高生产效率、降低生产成本。从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种枯草芽孢杆菌液体培养基，其碳源为葡萄糖，氮源为大豆蛋白胨。优选技术方案中培养基包含如下含量的成分：葡萄糖1～2％，大豆蛋白胨2～5％，十二水磷酸氢二钠0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.5％，七水硫酸镁0.01～0.1％，氯化钙0.01～0.1％，消泡剂0.1～0.2％，其中百分比为质量体积比，pH 7.0-7.2。

进一步的优选，液体发酵培养基配方为：葡萄糖2％，大豆蛋白胨3％，十二水磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，消泡剂0.2％，其中百分比为质量体积比，pH 7.0-7.2。进一步的优选，所培养的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌MQ013-26。

在整个发酵期间，补料控制发酵液的总糖浓度为0.5～2％，优选1％；补料控制手段优选恒速流补葡萄糖溶液。进一步优选地，枯草芽孢杆菌种子液通过包括如下步骤的方法制备：将冷冻保存的枯草芽孢杆菌划线于LB固体培养基平板上培养；挑取单菌落接种于LB液体培养基中进行两次活化，得到种子液。

本发明提供的纳豆激酶液态发酵工艺，通过优化发酵培养基，发酵过程进行精准补料控制，发酵纳豆激酶酶活达到60000IU/ml，为现有技术最高水平。该发酵工艺简单可控，有利于工业化扩大生产。该高酶活纳豆激酶发酵液通过喷干可获得高酶活的纳豆激酶粉产品，也可用于制作高纳豆激酶活性的豆类发酵制品。

附图说明

图1发酵过程中不同总糖浓度控制下的纳豆激酶酶活。

具体实施方式

本发明利用本公司获得的高酶活纳豆激酶生产菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MQ013-26，于2023年04月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号：CGMCC M 2023432。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1：碳源筛选优化

1.摇瓶活化培养：接种环蘸取1环平板菌种单菌落接种于活化摇瓶中，接种后的摇瓶于摇床中34-38℃，220rpm培养16-18h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积100ml，121℃，20min高压灭菌。

2.种子培养：将步骤1中得到的活化菌液按1％接种量接种于种子培养基，接种后的摇瓶于摇床中37℃，220rpm培养8-10h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH7.0-7.2。培养基体积100ml，121℃，30min高压灭菌。

3.发酵培养：将步骤1中得到的活化菌液按10％接种量接种于发酵培养基，转速220rpm，培养温度37℃，培养24h。发酵培养基(W/V，％)：酵母浸粉2％，十二水磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，消泡剂0.2％。培养基体积100ml，pH 7.0-7.2。通过在培养基中添加不同种类的2％(W/V)碳源作为单一变量，选择发酵纳豆激酶酶活水平较高的碳源作为本菌的发酵碳源，发酵24h不同组之间的参数对比结果见表1。其葡萄糖作为单糖，更有利于微生物的吸收利用，以葡萄糖作为碳源，酶活水平较高，发酵24h总糖含量低，碳源利用率更高。

4.纳豆激酶酶活检测方法为：团体标准《T/CQAP 2001—2022》中的纳豆激酶测定方法——琼脂糖纤维蛋白平板法，下同。

表1不同碳源发酵结果对比

实施例2：氮源筛选优化

1.摇瓶活化培养：接种环蘸取1环平板菌种单菌落接种于活化摇瓶中，接种后的摇瓶于摇床中34-38℃，220rpm培养16-18h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积100ml，121℃，30min高压灭菌。

2.种子培养：将步骤1中得到的活化菌液按1％接种量接种于种子培养基，接种后的摇瓶于摇床中37℃，220rpm培养8-10h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积100ml，121℃，30min高压灭菌。

3.发酵培养：将步骤1中得到的活化菌液按5％接种量接种于发酵培养基，转速220rpm，培养温度37℃，培养24h。发酵培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，十二水磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，消泡剂0.2％。培养基体积100ml，pH 7.0-7.2。在实施例1的基础上，通过在培养基中添加不同种类的3％(W/V)氮源作为单一变量，选择发酵纳豆激酶酶活水平较高的氮源作为本菌的发酵碳源，发酵24h不同组之间的参数对比结果见表2。选择的氮源大多是大豆来源，这主要是因为所述菌种是从大豆发酵食品中筛选出来的。大豆蛋白胨作为氮源，其酶活水平更高，达23874IU/ml。

表2不同氮源发酵结果对比

实施例3：补糖工艺优化

1.摇瓶活化培养：接种环蘸取1环平板菌种单菌落接种于活化摇瓶中，接种后的摇瓶于摇床中34-38℃，220rpm培养16-18h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积100ml，121℃，20min高压灭菌。

2.种子培养：将步骤1中得到的活化菌液按1％接种量接种于种子罐中培养，培养条件：溶氧控制大于30％，空气流量1.0vvm，罐压：0.05Mpa，培养温度37℃，当OD600≥3移种到发酵罐中。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH7.0-7.2。培养基体积5L，121℃，30min高压灭菌。

3.发酵培养：将步骤1中得到的活化菌液按10％接种量接种于发酵培养基，溶氧控制大于30％，空气流量1.0vvm，罐压：0.05Mpa，培养温度37℃，培养24h。发酵培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，大豆蛋白胨3％，十二水磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，消泡剂0.2％。培养基体积30L，pH 7.0-7.2。

当发酵培养基中的总糖含量下降到0.5％后通过恒速流补50％的葡萄糖，维持总糖含量在不同水平(0.5％、1％、1.5％、2％)，24h后检测酶活和生物量。通过检测结果发现，发酵过程中维持总糖含量在1％时，纳豆激酶酶活最高，可达58312IU/ml。这表明通过补糖维持发酵液的一定糖含量能促进酶活的提高。通过培养基的碳氮源优化和补料工艺控制，最终提高了5倍的发酵酶活。

实施例4：工艺放大生产

1.摇瓶活化培养：接种环蘸取2环平板菌种单菌落接种于活化摇瓶中，接种后的摇瓶于摇床中34-38℃，220rpm培养16-18h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积3L，121℃，30min高压灭菌。

2.一级种子培养：将步骤1中得到的活化菌液按1％接种量接种于种子罐中培养，培养条件：溶氧控制大于30％，空气流量1.0vvm，罐压：0.05Mpa，培养温度37℃，当OD600≥3移种到发酵罐中。培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积300L，121℃，30min高压灭菌。

3.发酵培养：将步骤2中得到的活化菌液按10％接种量接种于发酵培养基，溶氧控制大于30％，空气流量1.0vvm，罐压：0.05Mpa，培养温度37℃，培养24h。发酵培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，大豆蛋白胨3％，十二水磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，消泡剂0.2％。发酵体积3T，pH 7.0-7.2。当发酵培养基中的总糖含量下降到0.5％后通过恒速流补50％的葡萄糖，维持总糖含量在1±0.2％。发酵30h,总补糖量323L，OD600达34.5，酶活达60078IU/ml。

4.喷雾干燥：发酵液于低温下，8000rpm离心获得发酵上清液。按10％(w/v)的比例将麦芽糊精添加至离心上清液中，搅拌至麦芽糊精完全溶解。然后进入喷雾干燥机进行干燥，控制进料温度120℃，调节进料流速控制出风温度在50℃，收集粉体经40目过筛机过筛分装，最终酶活达121018IU/g。

实施例5：纳豆激酶固态发酵工艺

1.摇瓶种子培养：单菌落接种于种子摇瓶中，接种后的摇瓶于摇床中34-38℃，220rpm培养16-18h。摇瓶培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积300ml，121℃，30min高压灭菌。

2.一级种子培养：将步骤1中得到的活化菌液按1％接种量接种于种子罐中培养，培养条件：溶氧控制大于30％，空气流量1.0vvm，罐压：0.05Mpa，培养温度37℃，当OD600≥3移种到发酵罐中。培养基(W/V，％)：葡萄糖2％，牛肉膏1％，酵母浸粉1％，pH 7.0-7.2。培养基体积30L，121℃，30min高压灭菌。

3.纳豆激酶大豆发酵产品制备：将300kg大豆清洗后通过清水浸泡过夜，晾干后放入固态发酵床中，121℃，在线灭菌30min。取步骤2制备的种子液与大豆混合均匀，于37℃并通无菌空气静置培养培养30h。通过培养，大豆长出大量菌丝，搅拌后粘度增加呈拉丝状，纳豆气味明显。大豆发酵制品的纳豆激酶酶活达26213IU/mL。