SUMO在对糖基化以线粒体自噬的调节上的应用及测试方法

技术领域

本发明属于糖基化以及线粒体调节技术领域，尤其涉及一种CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用。

背景技术

目前，缺血再灌注(I/R〉诱导的心肌损伤仍是临床上棘手的问题，但I/R的损伤机制尚未阐明。CARD9是细胞浆内重要的结合蛋白，蛋白质谱显示CARD9结合HOXB5，HOXB5是线粒体自噬因子Parkin的潜在转录因子。分析显示CARD9蛋白SUMO修饰促进CARD9与HOXB5结合，但阻碍HOXB5的O-GLcNAc糖基化，该修饰是蛋白核转位的重要信号。CARD9蛋白SUMO受PIAS3调控，后者与I/R诱导的心肌损伤有关。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

1)不明确的损伤机制：虽然已经发现CARD9与HOXB5的结合以及相关蛋白质修饰作用，但I/R诱导的心肌损伤的具体机制尚未完全阐明。这限制了对于心肌损伤治疗策略的制定和优化。

2)缺乏有效干预手段：现有技术尚未提供针对CARD9和HOXB5之间相互作用的有效干预手段，例如如何有效调控或影响CARD9蛋白SUMO修饰和HOXB5的O-GLcNAc糖基化等，以减轻I/R诱导的心肌损伤。

3)PIAS3调控机制不明：虽然已知PIAS3调控CARD9蛋白SUMO修饰，并与I/R诱导的心肌损伤有关，但其具体调控机制和与心肌损伤的关联尚不清晰，这使得针对PIAS3的潜在治疗策略难以制定。

4)方法学局限性：现有技术在研究I/R诱导的心肌损伤时，可能受限于实验方法和技术手段，导致在细胞和分子层面的研究进展缓慢。随着新技术的发展，可能会出现更加高效、准确的研究方法，有助于揭示心肌损伤的相关机制。

综上所述，现有技术在I/R诱导的心肌损伤研究中存在损伤机制不明、缺乏有效干预手段、调控机制不明和方法学局限性等问题和缺陷。解决这些问题将有助于为心肌损伤的治疗提供更有针对性的策略，从而提高患者的生活质量和生存率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用。

本发明是这样实现的，一种CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用。

进一步，包含：

敲减PIAS3抑制CARD9蛋白SUMO，促进CARD9与HOXB5的解离和HOXB5的O-GlcNAc糖基化；

HOXB5核转位促进Parkin诱导线粒体自噬，缓解心肌I/R损伤。

进一步，采用免疫共沉淀，线粒体和溶酶体荧光追踪研究CARD9蛋白SUMO对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、本发明通过敲减PIAS3抑制CARD9蛋白SUMO，促进CARD9与HOXB5的解离和HOXB5的O-GlcNAc糖基化，进而HOXB5核转位促进Parkin诱导线粒体自噬，缓解心肌I/R损伤。

第二，本发明采用免疫共沉淀，线粒体和溶酶体荧光追踪等技术研究CARD9蛋白SUMO对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节，进一步阐明心肌I/R损伤的分子机制。

第三，深入了解机制：通过敲减PIAS3抑制CARD9蛋白SUMO，以及促进CARD9与HOXB5的解离和HOXB5的O-GlcNAc糖基化，有助于深入了解I/R诱导心肌损伤的分子机制，为未来研究提供更多信息。

新型治疗策略：通过调节CARD9蛋白SUMO和HOXB5之间的相互作用，以及HOXB5的核转位和Parkin诱导的线粒体自噬，为缓解心肌I/R损伤提供了一种新的潜在治疗策略。

实验方法优化：采用免疫共沉淀、线粒体和溶酶体荧光追踪等实验方法，有助于更准确地研究CARD9蛋白SUMO对HOXB5的O-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节机制，提高研究效率和准确性。

潜在临床应用：通过调节CARD9蛋白SUMO、HOXB5的O-GlcNAc糖基化和线粒体自噬等分子机制，有望在实际临床应用中缓解I/R诱导的心肌损伤，降低患者的病死率和改善生活质量。

促进相关领域研究：这种应用不仅在I/R诱导的心肌损伤领域具有重要意义，还可能推动其他与CARD9、HOXB5、SUMO修饰和线粒体自噬相关的疾病领域的研究，拓展研究范围和深度。

总之，CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的O-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用，具有深入了解机制、提供新型治疗策略、优化实验方法、潜在临床应用和促进相关领域研究等积极效果和优点。这将有助于为心肌损伤的治疗提供更有针对性的策略，提高患者的生活质量和生存率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的具体的采用以下几种方法：

1.基因编辑技术：通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术，敲减或敲除目标基因(如PIAS3)，以研究其对CARD9蛋白SUMO修饰和HOXB5的O-GlcNAc糖基化的影响。

2.荧光共振能量转移(FRET)：利用FRET技术研究CARD9和HOXB5之间的相互作用，以及其在不同条件下(如PIAS3敲减)的变化情况。

3.蛋白质质谱分析：通过蛋白质质谱分析，鉴定和定量HOXB5的O-GlcNAc糖基化水平，以及在CARD9蛋白SUMO修饰调控下的变化情况。

4.细胞和动物模型：建立缺血再灌注诱导的心肌损伤细胞和动物模型，评估敲减PIAS3和调控CARD9蛋白SUMO修饰对心肌损伤的影响，以及HOXB5的O-GlcNAc糖基化和线粒体自噬在其中的作用。

5.药物筛选：筛选潜在的小分子化合物或生物药物，以调控CARD9蛋白SUMO修饰和HOXB5的O-GlcNAc糖基化，从而缓解心肌I/R损伤。

6.临床研究：在动物实验取得积极结果后，进一步开展临床试验，以评估调控CARD9蛋白SUMO修饰和HOXB5的O-GlcNAc糖基化在缓解心肌I/R损伤中的安全性和有效性。

通过这些方法和实验技术，可以更全面地研究CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的O-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用，为心肌损伤的治疗提供新的策略和方向。

如图1所示，本发明实施例提供的CARD9蛋白SUMO在对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节上的应用的过程，包含以下步骤：

S101：敲减PIAS3抑制CARD9蛋白SUMO，促进CARD9与HOXB5的解离和HOXB5的O-GlcNAc糖基化；

S102：HOXB5核转位促进Parkin诱导线粒体自噬，缓解心肌I/R损伤。

本发明采用免疫共沉淀，线粒体和溶酶体荧光追踪等技术研究CARD9蛋白SUMO对HOXB5的0-GlcNAc糖基化以及线粒体自噬的调节，进一步阐明心肌I/R损伤的分子机制。

作为本发明实施例的一个具体的优化方案，具体为:

(1)心肌细胞及心肌细胞系:主要应用于体外实验,通过细胞培养、转染等方法研究CARD9 SUMO化对HOXB5糖基化和线粒体自噬的调节机制。

(2)成年小鼠心肌或心脏:通过feeding、腹腔注射等方法在小鼠体内调控PIAS3和CARD9,研究其对心肌HOXB5糖基化、线粒体自噬以及心肌细胞损伤和死亡的影响。

(3)离体心脏灌流模型:通过灌流方式在离体小鼠心脏上研究PIAS3及CARD9SUMO化对心肌I/R损伤的影响及机制。

(4)成年小鼠心肌梗死模型:通过冠状动脉结扎方式建立梗死模型,研究PIAS3和CARD9 SUMO化对梗死损伤程度、心肌功能恢复及存活率的影响。

实施例1:采用免疫共沉淀和Western blot检测正常小鼠心肌细胞中CARD9与HOXB5的相互作用,以及HOXB5的O-GlcNAc糖基化水平；采用线粒体和溶酶体特异荧光探针观察线粒体自噬情况。

实施例2:在小鼠心肌细胞中敲减PIAS3,Western blot检测CARD9与HOXB5相互作用的变化以及HOXB5O-GlcNAc糖基化水平的变化；采用线粒体和溶酶体特异荧光探针观察线粒体自噬的变化。

实施例3:在实施例2的基础上,通过免疫荧光定量分析检测HOXB5在细胞核内的表达变化；Western blot检测Parkin等线粒体自噬相关蛋白的表达变化。

实施例4:在小鼠心肌梗死模型中,比较敲减PIAS3组和对照组的CARD9 SUMO化、CARD9与HOXB5相互作用、HOXB5糖基化及转位、Parkin表达、线粒体损伤和心肌细胞死亡情况。

实施例5:采用免疫共沉淀、Western blot和免疫荧光定量分析检测高糖培养的小鼠心肌细胞中HOXB5的O-GlcNAc糖基化、细胞核内HOXB5表达及线粒体自噬的变化。

实施例6:在体外模拟的小鼠心肌细胞I/R模型中,比较PIAS3敲减组和对照组的线粒体损伤、细胞死亡、HOXB5糖基化、HOXB5核转位及线粒体自噬的变化。

1)CARD9蛋白SUMO调节CARD9与HOXB5结合以及HOXB5蛋白O-GlcNAc糖基化的分子机制

本发明在体外实验中敲减PIAS3下调了H/R后心肌细胞中CARD9蛋白的SUMO分子水平，并且减少了CARD9蛋白上HOXB5蛋白的水平，而HOXB5蛋白上O-GlcNAc糖基化增加。本发明将进一步地明确SUMO对CARD9与HOXB5结合的调节作用，以及CARD9与HOXB5的结合对O-GlcNAc糖基化的影响。

实施例1:选用小鼠和大鼠心肌细胞HL-1和H9c2。在HL-1/H9c2中敲减或过表达PIAS3,PCR检测PIAS3，Western blot(WB)检测PIAS3、CARD9、HOXB5；采用免疫共沉淀检测CARD9、HOXB5蛋白上SUMO分子和O-GlcNAc分子水平，以及CARD9蛋白上HOXB5的水平。

实施例2:在HL-1/H9c2中过表达PIAS3的同时敲减CARD9，WB检测CARD9、HOXB5表达；采用免疫共沉淀检测HOXB5蛋白上O-GlcNAc分子水平。

过表达PIAS3提升CARD9蛋白SUMO水平，CARD9蛋白上HOXB5增加，HOXB5蛋白O-GlcNAc糖基化水平下调；过表达PIAS3同时敲减CARD9，HOXB5蛋白O-GlcNAc糖基化水平升高。

本发明构建低免疫原性且适用于心脏组织特异性结合的AAV6血清型腺病毒AAV6-shRNA-PIAS3，通过尾静脉注射SD大鼠，敲减心脏组织中PIAS3，取心肌组织，PCR检测PIAS3表达，WB检测PIAS3、CARD9、HOXB5表达；免疫共沉淀检测CARD9、HOXB5蛋白上SUMO分子和O-GlcNAc分子水平，以及CARD9蛋白上HOXB5水平。

2)O-GlcNAc糖基化HOXB5核转位提升Parkin表达促进I/R后心肌细胞线粒体自噬的作用

虽然I/R后心肌细胞整体O-GlcNAc糖基化修饰水平提升，但是HOXB5上多个O-GlcNAc糖基化修饰位点可能被HOXB5结合CARD9后所占据，从而阻碍了HOXB5的糖基化，抑制了HOXB5向细胞核转位。

实施例1:在HL-1/H9c2中敲减CARD9或同时敲减CARD9和OGT(O-GlcNAc糖基转移酶)，

实施例2:进行H/R处理，PCR检测CARD9，OGT；WB检测CARD9、HOXB5蛋白；免疫共沉淀检测HOXB5蛋白上O-GlcNAc分子水平；WB分别检测细胞浆和细胞核中HOXB5的水平；免疫荧光(IF)观察HOXB5在细胞浆和细胞核中的分布。

本发明敲减CARD9后，HOXB5的O-GlcNAc糖基化位点被暴露出来，O-GlcNAc糖基化修饰促进HOXB5向细胞核转位；但是同时敲减CARD9和OGT，阻断HOXB5的O-GlcNAc糖基化，抑制HOXB5向细胞核转位。

本发明为明确HOXB5核转位能通过提升Parkin的表达促进H/R后心肌细胞线粒体自噬，在HL-1/H9c2中敲减CARD9，过表达HOXB5，同时敲减CARD9和HOXB5，或过表达HOXB5同时敲减Parkin，然后进行H/R处理，PCR检测CARD9、HOXB5、Parkin表达；WB检测CARD9、HOXB5、Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达；染色质免疫共沉淀检测HOXB5与Parkin基因启动子结合；双荧光素酶报告基因检测HOXB5转录调控Parkin；电镜观察线粒体自噬；同时用线粒体特异性荧光探针Mito Tracker和溶酶体特异性荧光探针Lyso Tracker追踪线粒体自噬的动态过程。本发明中敲减CARD9和过表达HOXB5都促进Parkin的转录和H/R后线粒体自噬，但敲减CARD9同时敲减HOXB5或过表达HOXB5同时敲减Parkin抑制了H/R后线粒体自噬。

本发明构建AAV6血清型腺病毒AAV6-shRNA-CARD9、AAV6-shRNA-OGT、AAV6-shRNA-HOXB5，通过尾静脉注射SD大鼠后构建大鼠I/R模型，取心肌组织，PCR检测CARD9、OGT、HOXB5；WB检测CARD9、OGT、HOXB5、Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白；免疫共沉淀检测HOXB5蛋白上O-GlcNAc分子水平；WB分别检测细胞浆和细胞核中HOXB5的水平；染色质免疫共沉淀检测HOXB5与Parkin基因启动子结合；电镜观察线粒体自噬。

3)验证PIAS3下调CARD9蛋白SUMO水平通过促进HOXB5诱导线粒体自噬，缓解I/R诱导的心肌损伤的作用

分析显示CARD9结合HOXB5，阻碍后者进入细胞核启动Parkin的表达和I/R后线粒体自噬。但是CARD9具有心肌保护作用，不宜通过敲减CARD9的方式激活HOXB5的功能。本发明通过敲减PIAS3下调CARD9蛋白SUMO水平，促进HOXB5诱导的线粒体自噬，缓解I/R诱导的心肌损伤。

实施例1:HL-1/H9c2转染PIAS3敲减载体，同时转染PIAS3和HOXB5敲减载体，或同时转染PIAS3和Parkin敲减载体，

实施例2:进行H/R处理，PCR检测PIAS3、HOXB5、Parkin表达；WB检测CARD9、HOXB5、Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达；线粒体膜电位检测；电镜观察线粒体自噬；

同时用线粒体特异性荧光探针Mito Tracker和溶酶体特异性荧光探针LysoTracker追踪线粒体自噬的动态过程；检测心肌细胞活力和凋亡率。

本发明构建AAV6血清型腺病毒AAV6-shRNA-PIAS3、AAV6-shRNA-HOXB5、AAV6-shRNA-Parkin通过尾静脉注射SD大鼠后构建大鼠I/R模型。超声心电图检测：LVFS、LVEDD、LVEF；试剂盒检测血清CK、CK-MB、cTnI、cTnT和LDH含量；HE染色观察各组大鼠心肌组织的病理改变；Tunel染色评估细胞凋亡；取心肌组织，PCR检测PIAS3、HOXB5、Parkin表达；WB检测PIAS3、HOXB5、Parkin、PINK1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达；电镜观察线粒体自噬。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。