一种基于18种代谢标志物的蚝油产品质量快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体地，涉及一种基于18种代谢标志物的蚝油产品质量快速鉴定方法。

背景技术

调味品是人们菜肴烹调和日常生活中必不可少的食材，随着人们的口感需求及调味品的各种配方加工，食品加工技术的发展和商品多样化丰富化。蚝油是粤港澳大湾区居民以及餐饮行业常用的传统的鲜味调料，也是调味汁类大宗产品之一，味道鲜美、蚝香浓郁，黏稠适度，营养价值高。

蚝油的传统生产方式主要有两种，一是利用牡蛎蒸、煮后的汁液进行浓缩，二是直接用牡蛎肉打碎熬汁，再加入食糖、食盐、淀粉、改性淀粉等原料制成，这两种方法无分高下，生产出来的都是有蚝汁的蚝油。在实际的蚝油规模化生产工艺上，一部分厂家是采用直接购买蚝水进行加工生产蚝油，也有一部分厂家是采用生蚝直接打碎熬汁生产蚝油。

根据GB/T 21999-2008的蚝油国家标准规定，无论是哪种生产方式，蚝油必须得含有蚝汁。但是，当前并没有强制要求市场上销售的蚝油都要在产品包装上明确标注蚝汁的含量，也没有切实可靠的蚝油分级标准。其原因在于，尽管国标中规定了蚝油的主要理化指标“氨基酸态氮含量”须不低于0.3％，然而由于生产蚝油的过程中往往会加入豉油来增加咸味，而豉油里同样含有氨基酸态氮，所以无法检测判定成品蚝油中的氨基酸态氮究竟是来自蚝汁还是豉油，现有技术不能精准测定蚝汁在蚝油中所占的比例。因此，亟需建立准确评定蚝油品质的方法。

发明内容

为了解决现有技术不能精准测定蚝汁在蚝油中所占的比例，以及缺少准确评定蚝油品质的方法，本发明提供一种基于18种代谢标志物的蚝油产品质量快速鉴定方法。

本发明的第一个目的是提供检测代谢小分子的试剂在鉴定蚝汁中的应用。

本发明的第二个目的是提供检测上述代谢小分子的试剂在检测和/或预测蚝汁含量中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测代谢小分子的方法。

本发明的第四个目的是提供一种检测蚝汁含量的方法。

本发明的第五个目的是提供一种测定蚝汁含量的系统。

本发明的第六个目的是提供一种计算机可读存储介质。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明基于高分辨质谱与代谢组学技术相结合的方法，以生蚝的代谢物及这些代谢物经生产加工后发生变化的产物作为分析对象，筛选到差异性代谢物，根据差异性代谢物的来源、循环代谢途径等，推断其工艺及原料添加等可能造成组间差异的原因，得到能够用于精准测定蚝汁在蚝油中所占的比例的代谢小分子标志物。

检测代谢小分子的试剂在鉴定蚝汁中的应用，所述代谢小分子包括尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸。

检测代谢小分子的试剂在检测和/或预测蚝汁含量中的应用，所述代谢小分子包括尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸。

检测代谢小分子的试剂在检测和/或预测蚝油中的蚝汁含量的应用，所述代谢小分子包括尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸。

一种检测代谢小分子的方法，所述代谢小分子包括尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸；

所述方法包括如下步骤：检测所述代谢小分子在待测样品中的含量，得到检测数据；利用检测数据和预测模型得到待测样品的蚝汁含量；

其中，所述预测模型是利用纯蚝汁的数据作为训练集基于偏最小二乘法判别分析得到的。

优选地，利用高效液相色谱-质谱检测所述代谢小分子在待测样品中的含量。

更优选地，所述高效液相色谱的条件如下：

采用C18色谱柱；流速为0.4～0.6mL/min；进样量为4～6μL；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序中，流动相B的体积百分比变化为：0～9min，流动相B从5％升至90％；9～11min，流动相B从90％升至100％；11～16min，流动相B为100％；16～17min，流动相B从100％降至5％；17～20min，流动相B为5％。

进一步优选地，所述C18色谱柱为Waters BEH C

更进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为38～42℃。

再进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为40℃。

进一步优选地，流速为0.5mL/min。

进一步优选地，进样量为5μL。

更优选地，所述质谱的条件如下：

离子源模式：ESI为测定离子源，APCI为校准离子源，正离子和负离子模式；气帘气：30psi，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助气：45psi，离子源温度：500℃，离子源电压：正离子模式的离子源电压为5000V，负离子模式的离子源电压为-4500V；一级TOF-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，数据采集时间100ms，DP:90V/-90V，CE:5eV/-5eV；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，DP:90V/-90V，CE:35±10V/-35±10V。

进一步优选地，监测模式：TOF-IDA-MS模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps。

进一步优选地，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

更优选地，在检测前将待测样品制成供试品，所述供试品为纯化的待测样品的甲醇提取液。

进一步优选地，所述待测样品的甲醇提取液的制备方法包括以下步骤：将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀，超声提取，离心，所得上清即为待测样品的甲醇提取液。

更进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀。

更进一步优选地，将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

再进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

更进一步优选地，超声的条件为：频率20kHz～50kHz，共超声提取18～22min。

再进一步优选地，超声的条件为：频率40kHz，共超声提取20min。

进一步优选地，所述纯化待测样品的甲醇提取液的方法为：用活化的C18固相萃取柱处理待测样品的甲醇提取液。

具体的，所述供试品的制备方法步骤如下：

称取2g待测样品(精确至0.01g)于带刻度的聚四氟乙烯具塞离心管中，加入30％v/v甲醇水溶液至10mL刻度，混合均匀，超声波(频率40kHz)提取20min，以10000r/min离心5min，收集上清液；

用10mL甲醇活化C18固相萃取柱，取5mL上清液进行过柱净化，待1mL过柱液流出后开始接收过柱液，收集到的过柱液经过0.22μm滤膜过滤，即得到供试品，备用待测。

一种检测蚝汁含量的方法，使用任一上述方法检测待测样品。

优选地，所述蚝汁为蚝油中的蚝汁。

优选地，利用高效液相色谱-质谱检测所述代谢小分子在待测样品中的含量。

更优选地，所述高效液相色谱的条件如下：

采用C18色谱柱；流速为0.4～0.6mL/min；进样量为4～6μL；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序中，流动相B的体积百分比变化为：0～9min，流动相B从5％升至90％；9～11min，流动相B从90％升至100％；11～16min，流动相B为100％；16～17min，流动相B从100％降至5％；17～20min，流动相B为5％。

进一步优选地，所述C18色谱柱为Waters BEH C

更进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为38～42℃。

再进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为40℃。

进一步优选地，流速为0.5mL/min。

进一步优选地，进样量为5μL。

更优选地，所述质谱的条件如下：

离子源模式：ESI为测定离子源，APCI为校准离子源，正离子和负离子模式；气帘气：30psi，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助气：45psi，离子源温度：500℃，离子源电压：正离子模式的离子源电压为5000V，负离子模式的离子源电压为-4500V；一级TOF-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，数据采集时间100ms，DP:90V/-90V，CE:5eV/-5eV；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，DP:90V/-90V，CE:35±10V/-35±10V。

进一步优选地，监测模式：TOF-IDA-MS模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps。

进一步优选地，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

更优选地，在检测前将待测样品制成供试品，所述供试品为纯化的待测样品的甲醇提取液。

进一步优选地，所述待测样品的甲醇提取液的制备方法包括以下步骤：将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀，超声提取，离心，所得上清即为待测样品的甲醇提取液。

更进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀。

更进一步优选地，将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

再进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

更进一步优选地，超声的条件为：频率20kHz～50kHz，共超声提取18～22min。

再进一步优选地，超声的条件为：频率40kHz，共超声提取20min。

进一步优选地，所述纯化待测样品的甲醇提取液的方法为：用活化的C18固相萃取柱处理待测样品的甲醇提取液。

具体的，所述供试品的制备方法步骤如下：

称取2g待测样品(精确至0.01g)于带刻度的聚四氟乙烯具塞离心管中，加入30％v/v甲醇水溶液至10mL刻度，混合均匀，超声波(频率40kHz)提取20min，以10000r/min离心5min，收集上清液；

用10mL甲醇活化C18固相萃取柱，取5mL上清液进行过柱净化，待1mL过柱液流出后开始接收过柱液，收集到的过柱液经过0.22μm滤膜过滤，即得到供试品，备用待测。

一种测定蚝汁含量的系统，包括：信息采集模块、储存模块、信息分析模块和输出模块；

所述信息采集模块用于采集数据，所述数据包括代谢小分子在待检测样品中的含量；所述代谢小分子包括尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸所述储存模块用于储存所述信息采集模块采集到的数据；

所述信息分析模块利用储存模块中的数据并和预测模型得到待测样品的蚝汁含量；其中，所述预测模型是利用纯蚝汁的数据作为训练集基于偏最小二乘法判别分析得到的；以待测样品的数据作为预测集；

所述输出模块用于信息分析模块所得的输出蚝汁含量。

优选地，所述信息采集模块中采集数据的方法为利用高效液相色谱-质谱检测所述代谢小分子在待测样品中的含量。

更优选地，所述高效液相色谱的条件如下：

采用C18色谱柱；流速为0.4～0.6mL/min；进样量为4～6μL；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序中，流动相B的体积百分比变化为：0～9min，流动相B从5％升至90％；9～11min，流动相B从90％升至100％；11～16min，流动相B为100％；16～17min，流动相B从100％降至5％；17～20min，流动相B为5％。

进一步优选地，所述C18色谱柱为Waters BEH C

更进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为38～42℃。

再进一步优选地，所述C18色谱柱的柱温为40℃。

进一步优选地，流速为0.5mL/min。

进一步优选地，进样量为5μL。

更优选地，所述质谱的条件如下：

离子源模式：ESI为测定离子源，APCI为校准离子源，正离子和负离子模式；气帘气：30psi，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助气：45psi，离子源温度：500℃，离子源电压：正离子模式的离子源电压为5000V，负离子模式的离子源电压为-4500V；一级TOF-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，数据采集时间100ms，DP:90V/-90V，CE:5eV/-5eV；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，DP:90V/-90V，CE:35±10V/-35±10V。

进一步优选地，监测模式：TOF-IDA-MS模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps。

进一步优选地，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

更优选地，在检测前将待测样品制成供试品，所述供试品为纯化的待测样品的甲醇提取液。

进一步优选地，所述待测样品的甲醇提取液的制备方法包括以下步骤：将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀，超声提取，离心，所得上清即为待测样品的甲醇提取液。

更进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为(1～3)g：(8～12)mL混合均匀。

更进一步优选地，将待测样品与25～35％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

再进一步优选地，将待测样品与30％v/v甲醇水溶液按照质量体积比为2g：10mL混合均匀。

更进一步优选地，超声的条件为：频率20kHz～50kHz，共超声提取18～22min。

再进一步优选地，超声的条件为：频率40kHz，共超声提取20min。

进一步优选地，所述纯化待测样品的甲醇提取液的方法为：用活化的C18固相萃取柱处理待测样品的甲醇提取液。

具体的，所述供试品的制备方法步骤如下：

称取2g待测样品(精确至0.01g)于带刻度的聚四氟乙烯具塞离心管中，加入30％v/v甲醇水溶液至10mL刻度，混合均匀，超声波(频率40kHz)提取20min，以10000r/min离心5min，收集上清液；

用10mL甲醇活化C18固相萃取柱，取5mL上清液进行过柱净化，待1mL过柱液流出后开始接收过柱液，收集到的过柱液经过0.22μm滤膜过滤，即得到供试品，备用待测。

一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质上存储有被编程或配置以执行任一上述方法或任一上述系统的计算机程序。

一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器上存储有在所述处理器上可以执行的计算机程序；所述计算机程序被处理器执行时，实现任一上述方法或任一上述系统的操作。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以18个蚝源性代谢小分子作为检测标志物，建立了切实可行的蚝汁含量评定方法，18个代谢小分子化合物的平均回收率介于82.2％～106％之间，相对标准偏差RSD为1.97％～6.98％，重复性好，灵敏度高，精密度佳。使用该方法对不同蚝汁含量的蚝油盲样进行预测，结果准确度为94％。该方法填补了本领域的技术空白，为鉴定蚝油品质以及制定蚝油分级标准提供可靠的技术支持和保障。

附图说明

图1为不含蚝汁蚝油样品A、纯蚝汁样品A及8个不同蚝汁浓度的蚝油样品的蚝汁含量PLS-DA得分图。

图2为不含蚝汁蚝油样品A、纯蚝汁样品A及8个不同蚝汁浓度的蚝油样品的蚝汁含量PLS-DA得分的回归线性拟合结果。

图3为不含蚝汁蚝油样品B、纯蚝汁样品B及8个不同蚝汁浓度的蚝油样品的蚝汁含量PLS-DA得分图。

图4为不含蚝汁蚝油样品B、纯蚝汁样品B及8个不同蚝汁浓度的蚝油样品的蚝汁含量PLS-DA得分的回归线性拟合结果。

图5为不含蚝汁蚝油样品A和B与含有5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品的蚝汁含量PLS-DA得分图；N组为不含蚝汁蚝油样品，Y组为含有5％蚝汁的蚝油样品。

图6为8个蚝汁含量为10％(质量分数)的盲样和10个蚝汁含量为20％(质量分数)的盲样蚝汁含量PLS-DA得分图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例所用的仪器设备包括：Triple

本发明实施例所用的常规试剂包括：甲醇、乙腈(色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司)；C18固相萃取柱(500mg/6mL，上海安谱公司)；腺苷、一磷酸腺苷、胞苷、尿苷、腺嘌呤、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、甘氨酸甜菜碱、葫芦巴碱、β-丙氨酸甜菜碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、六氢吡啶羧酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、异戊酰基卡尼汀、2-甲基丁酰基卡尼汀、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、氨基戊甜菜碱、砷甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、一磷酸尿苷、琥珀酸和牛磺酸(标准品，纯度≥97.0％，天津阿尔塔公司)；实验用水为经Milli-Q纯水系统制得的超纯水(电阻率为18.2MΩ·cm)。

分别准确称取18个代谢小分子化合物的标准品各0.0100g于100mL棕色具塞容量瓶中，用30％v/v甲醇溶解并定容配制成100mg/L标准品溶液。分别取0.5mL的18个代谢小分子化合物的100mg/L标准溶液于10mL棕色具塞容量瓶中，用30％v/v甲醇溶解并定容配制成5mg/L标准品混合溶液。

实施例1用于鉴定蚝油的代谢小分子标志物的确定

一、质控样品的非靶向分析

(1)实验方法

1、质控样品的制备

将蚝汁A(厂家：厦门洋江食品有限公司，货号：20200903)、蚝汁B(厂家：厦门中坤食品有限公司，货号：GZF22-005409)和蚝汁C(厂家：福建省南安市建新海产有限公司，货号：20220405)按照等质量分数混合均匀，得到质控样品。本发明提及的蚝汁及定义均参照标准SB/T 11191-2017《蚝汁》。

2、供试品的制备

称取2g质控样品(精确至0.01g)于带刻度的聚四氟乙烯具塞离心管中，加入30％(V/V)甲醇水溶液至10mL刻度，混合均匀，超声波(频率40kHz)提取20min，以10000r/min离心5min，收集上清液。

用10mL甲醇活化C18固相萃取柱，取5mL上清液进行过柱净化，待1mL过柱液流出后开始接收过柱液，收集到的过柱液经过0.22μm滤膜过滤，即得到供试品，备用待测。

3、高效液相色谱条件

按照以下条件对供试品进行高效液相色谱检测：

色谱柱：Waters BEH C

4、质谱检测条件

按照以下条件对供试品进行质谱检测：

离子源：ESI和APCI复合源(ESI为测定离子源，APCI为校准离子源)；电喷雾采用正离子和负离子两种模式采集数据；APCI源连接AB sciex公司自动校正系统(CDS)，校正液流速为0.3mL/min，每5个样品进行一次自动校正，以确保系统在批内的精准质量数稳定；气帘气：30psi，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助气：45psi，离子源温度：500℃，正离子模式的离子源电压为5000V，负离子模式的离子源电压为-4500V；

一级TOF-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，数据采集时间100ms，DP:90V/-90V，CE:5eV/-5eV；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，DP:90V/-90V，CE:35±10V/-35±10V；监测模式：TOF-IDA-MS模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

5、数据分析

用Analyst TF 1.6软件(AB Sciex公司)采集所有质谱数据，之后用PeakView2.0软件、MasterView 2.0软件和MultiQuant 3.0软件进行定性定量处理分析。根据TOF-MS和IDA-MS高分辨质谱获得化合物的精确分子量，定性定量分析蚝油中的代谢物。代谢物峰面积数据导入SIMCA 14.1软件(瑞典Umetrics公司)中，进行多元统计分析，鉴定和蚝油中蚝汁相关的标记物。对质控样品的高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱检测数据进行峰提取，得到质控样品的非靶向数据，依据峰的一级精确质量数和二级碎片，对其中信噪比超过100的峰进行鉴定。最后将鉴定出来的化合物峰面积进行OPLS-DA建模，依据VIP值分析确定蚝汁中的标记物。

(2)实验结果

如表1所示，对质控样品进行非靶向分析，共鉴定得到34种蚝汁来源的代谢小分子。

表1 34种蚝汁来源的代谢小分子的检测结果

二、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选标志物

(1)实验方法

1、分析样品的制备

以不含蚝汁蚝油样品A、不含蚝汁蚝油样品B、含5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品和含10％(质量分数)蚝汁的蚝油样品作为分析样品。

不含蚝汁蚝油样品A和不含蚝汁蚝油样品B的配方依次如表2和表3所示，具体制备方法如下：将水分成质量相同的两等份，一份用于溶解小麦粉和羟丙基二淀粉磷酸酯得到小麦粉-羟丙基二淀粉磷酸酯水溶液；另一份放置于干净的锅中煮沸，然后一边搅拌一边加入制小麦粉-羟丙基二淀粉磷酸酯水溶液，充分混匀后再加入其余成分，溶解混匀后保持微沸20min，冷却至室温，装罐。

表2不含蚝汁蚝油样品A

表3不含蚝汁蚝油样品B

含5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品的配方为：20g蚝汁A+380g不含蚝汁蚝油样品A，具体制备方法如下：准确称取20g蚝汁A于洁净烧杯中，加入380g不含蚝汁蚝油样品A，搅拌混合均匀。

含10％(质量分数)蚝汁的蚝油样品的配方为：40g蚝汁B+360g不含蚝汁蚝油样品B，具体制备方法如下：准确称取40g蚝汁B于洁净烧杯中，加入360g不含蚝汁蚝油样品B，搅拌混合均匀。

2、检测

按照本实施例第一部分中“供试品的制备”、“高效液相色谱检测条件”和“质谱检测条件”对分析样品进行检测。

3、OPLS-DA分析

由于肌苷酸钠和鸟苷酸钠是蚝油的常用配料，并蚝汁添加量低的情况下部分化合物低于仪器检出限，所以将上一步所得的34种蚝汁来源的代谢小分子中剔除鸟苷、一磷酸鸟苷、一磷酸尿苷、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、砷甜菜碱和一磷酸腺苷。

将剩余的28种代谢小分子在分析样品中的峰面积数据进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA分析)，通过建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。经过OPLS-DA分析，每个代谢物可以得出一个VIP值(即变量重要性投影，VariableImportance inProjection)，VIP值越大代表该物质对于区分不同组所具有的贡献越大，VIP值大于1表明该变量对不同组别的区分具有显著意义。

(2)实验结果

经过OPLS-DA分析，共有18个代谢小分子化合物的VIP值大于1，分别为尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸。

三、基质效应

由于离子化的影响，质谱检测方法会产生基质效应，影响测定结果，所以本实施例进一步考察上述18个代谢小分子化合物的基质效应。

(1)实验方法

1、基质效应检测样品的制备

空白基质标准溶液：将不含蚝汁蚝油样品A按照实施例1中“供试品的制备”的方法制得到1mg/L的不含蚝汁蚝油样品A基质提取液，即空白基质标准溶液。

纯溶剂标准溶液：将30％(V/V)甲醇按照实施例1中“供试品的制备”的方法制得1mg/L的纯溶剂溶液，即纯溶剂标准溶液。

对空白基质标准溶液和纯溶剂标准溶液进行定量分析。

2、检测

按照本实施例第一部分中“高效液相色谱检测”和“质谱检测”的方法对空白基质标准溶液和纯溶剂标准溶液进行检测。

3、基质效应分析

根据18个代谢小分子化合物在基质和纯溶剂中的峰面积计算得到基质效应，计算公式为：ME(％)＝(A1-A2)/A2×100％，其中A1为基质中的峰面积，A2为纯溶剂中的峰面积。

(2)实验结果

表4蚝油中的代谢物基质效应

如表4所示，18个代谢小分子化合物在蚝油基质的基质效应均为抑制，且抑制效应比较明显。因此为提高检测的准确度，后续在使用18个代谢小分子化合物对蚝油中的蚝汁进行定量分析时需采用基质校正曲线。

四、方法学考察

1、实验方法

(1)加标样品制备及检测

通过加样回收实验，在不含蚝汁蚝油样品A中分别加入5.0mg/kg、10mg/kg和25mg/kg 3个浓度水平的18个代谢小分子化合物标准品(即尿苷标准品、次黄嘌呤标准品、甜菜碱标准品、葫芦巴碱标准品、缬氨酸甜菜碱标准品、脯氨酸甜菜碱标准品、苯丙氨酸标准品、酪氨酸标准品、黄尿酸标准品、烟酸标准品、L-甲硫氨酸标准品、N-乙酰基-L-酪氨酸标准品、L-亮氨酸标准品、哌可酸甜菜碱标准品、γ-丁酰甜菜碱标准品、肉碱标准品、琥珀酸标准品和牛磺酸标准品)，按照本实施例第一部分中“供试品的制备”、“高效液相色谱检测”和“质谱检测”的方法对分析样品进行检测，同时测定6组平行试验。

(2)回收率和精密度分析

根据5.0mg/kg、10mg/kg和25mg/kg 3个浓度水平的6组平行加标样品的定量结果计算平均回收率和相对标准偏差。

2、实验结果

表5 18个代谢小分子化合物的平均回收率及相对标准偏差(n＝6)

如表5所示，18个代谢小分子化合物的平均回收率介于82.2％～106％之间，相对标准偏差RSD为1.97％～6.98％，回收率和精密度均满足国标GB/T27404-2008的要求。

综上，本实施例提供的上述18个代谢小分子化合物(尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸)定性及定量结果准确、稳定，是可用于鉴定蚝油中蚝汁含量的代谢小分子标志物。

实施例2一种蚝油中的蚝汁含量的检测方法

本发明提供一种蚝油中的蚝汁含量的定量检测方法，具体步骤如下：

一、标准品及样品的制备

(1)标准品

分别准确称取实施例1所得18个代谢小分子化合物的标准品(即尿苷标准品、次黄嘌呤标准品、甜菜碱标准品、葫芦巴碱标准品、缬氨酸甜菜碱标准品、脯氨酸甜菜碱标准品、苯丙氨酸标准品、酪氨酸标准品、黄尿酸标准品、烟酸标准品、L-甲硫氨酸标准品、N-乙酰基-L-酪氨酸标准品、L-亮氨酸标准品、哌可酸甜菜碱标准品、γ-丁酰甜菜碱标准品、肉碱标准品、琥珀酸标准品和牛磺酸标准品)各0.0100g于100mL棕色具塞容量瓶中，用30％v/v甲醇溶解并定容配制成100mg/L标准品溶液。分别取0.5mL的18个代谢小分子化合物的100mg/L标准溶液于10mL棕色具塞容量瓶中，用30％v/v甲醇溶解并定容配制成5mg/L标准品混合溶液。

(2)样品

样品组1：使用纯蚝汁A样品(厂家：厦门中坤食品有限公司，货号：GZF22-005409)，按照实施例1中的方法，制备得到8个不同蚝汁浓度的蚝油样品，即含5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M1)、含10％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M2)、含15％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M3)、含20％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M4)、含25％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M5)、含30％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M6)、含35％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M7)、含40％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为M8)。

样品组2：使用纯蚝汁B样品(厂家：厦门中坤食品有限公司，货号：GZF22-005409)，按照实施例1中的方法，制备得到8个不同蚝汁浓度的蚝油样品，即含5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L1)、含10％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L2)、含15％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L3)、含20％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L4)、含25％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L5)、含30％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L6)、含35％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L7)、含40％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(记为L8)。

二、供试品的制备

按照实施例1中“供试品的制备”的方法分别处理样品组1和样品组2，即得到供试品组1和供试品组2。

三、高效液相色谱检测

按照以下条件对标准品、供试品组1和供试品组2进行高效液相色谱检测：

色谱柱：Waters BEH C

四、质谱检测

按照以下条件对标准品、供试品组1和供试品组2进行质谱检测：

离子源：ESI和APCI复合源(ESI为测定离子源，APCI为校准离子源)；电喷雾采用正离子和负离子两种模式采集数据；APCI源连接AB sciex公司自动校正系统(CDS)，校正液流速为0.3mL/min，每5个样品进行一次自动校正，以确保系统在批内的精准质量数稳定；气帘气：30psi，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助气：45psi，离子源温度：500℃，正离子模式的离子源电压为5000V，负离子模式的离子源电压为-4500V；

一级TOF-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，数据采集时间100ms，DP:90V/-90V，CE:5eV/-5eV；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1500Da，DP:90V/-90V，CE:35±10V/-35±10V；监测模式：TOF-IDA-MS模式，数据采集时间50ms，信号阈值100cps，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

对标准品和供试品组1的质谱数据进行比对处理，即得到样品组1的定量检测数据；对标准品和供试品组2的质谱数据进行比对处理，即得到样品组2的定量检测数据。

五、数据分析

(一)、预测方法建立

1、建模分析

使用样品组1的定量检测数据，采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)的建模方式，考察不同蚝汁含量的蚝油样品的得分图。考察R2X(cum)和Q2(cum)等模型关键参数，一般而言，拟合模型预测成分累计统计量R2X(cum)和预测能力参数Q2(cum)大于0.5表示模型区分良好，具有较佳的预测精度。同时以实际添加的蚝汁含量为观测值(y)，以模型预测的蚝汁含量为预测值(x)，对y值和x值进行回归分析，考察模型的预测精度。RMSEE(评估均方差)表示用校正集样品所建模型预测校正集样品自身平均误差的一个指标。RMSE cv(均方差误差变异系数)是均方根误差(RMSE)与预测值平均值的比值，通常用百分比表示。RMSE cv越小，说明模型的预测精度越高。

2、实验结果

如图1所示，不含有蚝汁的蚝油的得分与添加了蚝汁的蚝油的得分区分明显，且随着蚝汁含量增加与不含蚝汁蚝油的差异越来越明显。R2X(cum)为0.929，Q2(cum)为0.839，均大于0.5，表示模型区分良好，具有较佳的预测精度。

如图2所示，PLS-DA模型拟合的回归方程为：y＝x-5.587×10

(二)、预测方法的重现性

使用不同的蚝汁样品，考察本方法的建模预测方式是否能重现。

1、建模分析

使用样品组2的质谱检测数据，采用PLS-DA的建模方式，考察不同蚝汁含量的蚝油样品的得分图。考察拟合模型预测成分累计统计量R2X(cum)和预测能力参数Q2(cum)等模型关键参数，一般而言，R2X(cum)和Q2(cum)大于0.5表示模型区分良好，具有较佳的预测精度。同时以实际添加的蚝汁含量为观测值(y)，以模型预测的蚝汁含量为预测值(x)，对y值和x值进行回归分析，考察模型的预测精度。RMSEE(评估均方差)表示用校正集样品所建模型预测校正集样品自身平均误差的一个指标。RMSE cv(均方差误差变异系数)是均方根误差(RMSE)与预测值平均值的比值,通常用百分比表示。RMSE cv越小,说明模型的预测精度越高。

2、实验结果

如图3所示，不含有蚝汁的蚝油的得分与添加了蚝汁的蚝油的得分区分明显，且随着蚝汁含量增加与不含蚝汁蚝油的差异越来越明显。R2X(cum)为0.801，Q2(cum)为0.812，均大于0.5，表示模型区分良好，具有较佳的预测精度。

如图4所示，PLS-DA模型拟合的回归方程为：y＝x-9.915×10

(三)灵敏度

使用5％蚝汁含量的蚝油样品与自制不含蚝汁蚝油样品两两建模分析，考察两组样品能否区分。

1、建模分析

使用样品组1和样品组2中的5％蚝汁含量的蚝油样品与自制不含蚝汁蚝油样品的质谱检测数据，采用PLS-DA的建模方式，考察不同蚝汁含量的蚝油样品的得分图。考察拟合模型预测成分累计统计量R2X(cum)和预测能力参数Q2(cum)等模型关键参数，一般而言，R2X(cum)和Q2(cum)大于0.5表示模型区分良好。

2、实验结果

如图5所示，PLS-DA得分图可明显区分不含蚝汁蚝油样品A和B(标记为0％)与含有5％(质量分数)蚝汁的蚝油样品(标记为5％)。R2X(cum)为0.989，Q2(cum)为0.903，均大于0.5，表示模型区分良好。5％蚝汁含量的蚝油样品能与不含蚝汁的蚝油样品能区分，即表示检测限低于5％。说明本方法检测限低。

以上结果表明，本发明实施例2提供的一种蚝油中的蚝汁含量的检测方法具有良好的预测精度，可用于蚝油中蚝源性成分含量的预测。

实施例3检测方法的实际应用

一、盲样鉴定

1、实验方法

(1)样品检测

使用1号纯蚝汁样品和自制不含蚝汁样品A混合，制得8个蚝汁含量为10％(质量分数)的盲样(记为T1～T8)；使用2号纯蚝汁样品和自制不含蚝汁样品B混合，制得10个蚝汁含量为20％(质量分数)的盲样(记为T9～T18)。

以T1～T18作为待测样品，利用实施例2的检测方法进行测定。

(2)结果判定

按照如下标准判定预测结果是否准确：

若T1～T8在预测结果(10％)组内的预测值最大，则预测结果为准确；若T9～T18在预测结果(20％)组内的预测值最大，则预测结果为准确；若T1～T8的最大预测值不在预测结果(10％)组内，则预测结果为不准确；若T9～T18的最大预测值不在预测结果(20％)组内，则预测结果为不准确。

按照如下公式计算预测结果的准确度：

准确度％＝预测准确样品数÷样品总数×100％。

2、实验结果

表6盲样预测结果汇总

如图6和表6所示，18个盲样中，8个蚝汁含量为10％(质量分数)的盲样全部预测准确；10个蚝汁含量为20％(质量分数)的盲样中有9个预测准确，1个预测结果为蚝汁含量为10％。总体预测准确度为94％。

二、实际样品检测

1、实验方法

以市面上购买到的10个不同品牌且不同价位的蚝油(均标示有蚝汁含量)作为待测样品，利用实施例2的检测方法进行测定，统计18个代谢小分子化合物(尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸)在样品中的总含量，即得到特征物总量。

2、实验结果

表7实际样品检测预测结果

如表7所示，从总体上看，市售蚝油样品的蚝汁含量与价格呈现正相关，但是第7个和第10个样本的蚝汁含量预测结果比官方标示的蚝汁含量低了15％～30％。以上结果表明，本发明实施例3提供的一种蚝油中的蚝汁含量的检测方法具有良好的预测精度，可用于市售蚝油中蚝源性成分含量的预测，具备了蚝油品质鉴别的潜力。

实施例4一种测定蚝汁含量的系统

本实施例提供一种测定蚝汁含量的系统，包括：信息采集模块、储存模块、信息分析模块和输出模块。

所述信息采集模块用于采集数据，所述数据包括利用实施例1中的“供试品的制备”、“高效液相色谱条件”和“质谱检测条件”检测尿苷、次黄嘌呤、甜菜碱、葫芦巴碱、缬氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、苯丙氨酸、酪氨酸、黄尿酸、烟酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-亮氨酸、哌可酸甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、肉碱、琥珀酸和牛磺酸在待检测样品中的含量。

所述储存模块用于储存所述信息采集模块采集到的数据。

所述信息分析模块利用储存模块中的数据并和预测模型得到待测样品的蚝汁含量；其中，所述预测模型是利用纯蚝汁(纯蚝汁A样品(厂家：厦门中坤食品有限公司，货号：GZF22-005409)和纯蚝汁B样品(厂家：厦门中坤食品有限公司，货号：GZF22-005409))的数据作为训练集基于偏最小二乘法判别分析得到的，以待测样品的数据作为预测集。

所述输出模块用于信息分析模块所得的输出蚝汁含量。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。