一株片球菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株片球菌及其应用。

背景技术

肥胖已经成为近年来较为常见的宠物代谢病之一，严重危害着宠物的健康。目前宠物脂肪肝的发病率也在急剧升高。肥胖和脂肪肝是多种代谢疾病的潜在危险因素，会导致心血管疾病和癌症的发病率及死亡率大幅度增高。肥胖也是宠物糖尿病及胰腺炎的高风险因素。因此，有必要采取有效的措施控制肥胖及其综合症，以提高动物福利。目前用于治疗宠物肥胖的药物鲜有报道，因此亟需开发新的宠物抗肥胖产品来抵抗肥胖引起的代谢类疾病。

益生菌可以通过定植于胃肠道中，改变宿主肠道菌群组成，进而影响宿主代谢和消化吸收。目前能够有效缓解宠物肥胖、高脂血症和脂肪肝的益生菌仍少有报道。因此，开发新的能够有效缓解宠物肥胖、高脂血症和脂肪肝的益生菌对于宠物健康具有重要意义。

发明内容

本发明提供一株片球菌及其应用。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供片球菌（

片球菌L-14-1分离自健康猫粪便，具有较好的耐酸、耐胆盐特性，能够适应人体胃肠道环境，对抗生素敏感，具有较高的安全性；该菌株能够有效缓解高脂饮食引起的血脂升高、肠道菌群失衡以及体重增长，具有降脂、缓解脂肪积累和脂肪组织病变、减轻炎症、缓解肥胖以及调节肠道菌群的功效，还能够有效抑制大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌等动物致病菌，具有开发为益生菌制剂的潜力。

本发明提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含所述片球菌L-14-1。

所述微生物制剂优选为益生菌制剂。

优选地，所述微生物制剂中，片球菌L-14-1以活菌形式存在。

所述微生物制剂可以为液体制剂或固体制剂。

所述微生物制剂的活性成分包含片球菌L-14-1，除片球菌L-14-1外，所述微生物制剂还可包含微生物制剂领域允许的辅料。

优选地，所述微生物制剂中，所述片球菌L-14-1的含量为1.0×10

在本发明的一些实施方式中提供一种冻干粉剂，其包含片球菌L-14-1，还包含冻干保护剂，所述冻干保护剂包含蔗糖0.5-2份，半乳糖0.5-2份，海藻糖0.5-2份，脱脂奶粉15-25份，水70-80份（优选地，按重量百分数计为：1%蔗糖、1%半乳糖、1%海藻糖、20%脱脂奶粉和77% ddH

在本发明的一些实施方式中，所述冻干粉剂的制备方法包括如下步骤：

将所述片球菌L-14-1使用MRS液体培养基、于35-37℃培养20-28h后，离心沉淀菌体，后使用ddH

本发明提供所述微生物制剂的制备方法，所述方法包括培养所述片球菌L-14-1的步骤。

优选地，所述培养使用的培养基为MRS培养基，所述培养为在35-37℃条件下进行。

基于片球菌L-14-1的功能，本发明提供该菌株的以下应用：

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备饲料、饲料添加剂、保健品或药物中的应用。

片球菌L-14-1可作为益生菌添加于动物饲料、饲料添加剂或动物保健品中，也可作为药物的活性成分。

优选地，所述饲料、饲料添加剂、保健品或药物具有以下功能中的一种或多种：

（1）预防、缓解或治疗肥胖；

（2）降脂；

（3）预防、缓解或治疗高脂血症

（4）缓解肝脏脂肪积累；

（5）缓解脂肪组织病变；

（6）减轻炎症；

（7）预防、缓解或治疗代谢综合征；

（8）改善肠道菌群；

（9）抑制病原菌。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备用于预防、缓解或治疗肥胖的产品中的应用。

优选地，所述预防、缓解或治疗肥胖表现为减少脂肪积累、减轻体重和/或抑制体重增加等。

优选地，所述肥胖为高脂饮食诱导的肥胖。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备降脂产品中的应用。

所述降脂为选自降低总胆固醇、降低甘油三酯、降低低密度脂蛋白胆固醇、升高高密度脂蛋白胆固醇中的一种或多种。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备用于预防、缓解或治疗高脂血症的产品中的应用。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备用于改善肠道菌群的产品中的应用。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备用于缓解肝脏脂肪积累、缓解脂肪组织病变、减轻炎症或用于预防、缓解或治疗代谢综合征的产品中的应用。

本发明提供所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂在制备抑菌产品中的应用。

所述抑菌产品包括但不限于杀菌剂、抗动物病原菌的饲料或药物等。

所述菌为动物病原菌，包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。

本发明中，所述应用针对的对象优选为哺乳动物，更优选为猫。

现有的猫用益生菌多是从其他动物或植物源中分离得到的，但是在临床中并未表现出良好效果，这可能是由于种属特异性导致的益生菌无法较好地在猫肠道内定植，且益生菌表现出的生理特性可能无法很好地满足猫肠道所需。本发明提供的片球菌L-14-1是从猫肠道中特异性分离的，是特定的针对于猫的肥胖症状的乳酸菌，应用于猫引起的猫应激反应较小，更适于作为猫用益生菌。

上述应用中，所述产品为饲料、饲料添加剂、保健品或药物。

本发明提供一种产品，所述产品包含所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂，或者，所述产品由所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂制备得到。

优选地，所述产品具有以下功能中的一种或多种：

（1）预防、缓解或治疗肥胖；

（2）降脂；

（3）预防、缓解或治疗高脂血症

（4）缓解肝脏脂肪积累；

（5）缓解脂肪组织病变；

（6）减轻炎症；

（7）预防、缓解或治疗代谢综合征；

（8）改善肠道菌群；

（9）抑制病原菌。

优选地，所述产品的活性成分包含片球菌L-14-1。

优选地，所述产品的活性成分为片球菌L-14-1。

所述产品为饲料、饲料添加剂、保健品或药物。所述产品的剂型包括但不限于胶囊、片剂、冻干粉剂、溶液、混悬液等。

本发明提供一种用于缓解猫肥胖的药物，其包含所述片球菌L-14-1或所述微生物制剂。

本发明的有益效果至少包括：

本发明提供的片球菌L-14-1具有较好的耐酸和耐胆盐特性，能够适应胃肠道环境，对常用抗生素敏感，具有较高的安全性；该菌株能够有效缓解高脂饮食引起的血脂升高、肠道菌群失衡以及体重增长，减少胆固醇吸收，降低总胆固醇含量，具有降脂、缓解脂肪积累和脂肪组织病变、减轻炎症的功效，对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌等常见致病菌具有较强的杀菌作用，具有开发为益生菌制剂的潜力。

本发明提供的片球菌L-14-1是从猫肠道中特异性分离的，是特定的针对于猫的肥胖症状的乳酸菌，应用于猫引起的猫应激反应较小，可应用于猫粮等动物饲料中益生菌的添加或猫等动物用保健品的制备，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中片球菌CGMCC No.27676菌株镜检图。

图2为本发明实施例2中片球菌CGMCC No.27676菌株的耐酸性能检测结果图，其中CON代表空白对照组。

图3为本发明实施例2中片球菌CGMCC No.27676菌株的耐胆盐性能检测结果图，其中，CK代表空白对照组。

图4为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠肝脏总胆固醇含量变化图。

图5为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量变化图。

图6为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠肥胖指数的变化图。

图7为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠肝脏指数的变化图。

图8为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠脂肪组织病变病理切片图，HE染色，放大100倍。

图9为本发明实施例4中片球菌CGMCC No.27676菌株引发的小鼠血清中炎性因子白介素-6的变化图。

图10为本发明实施例4中小鼠粪便微生物物种多样性（属水平）分析结果，其中，L1411-4分别为L-14-1组的4个样品，CON1-4分别为空白对照组的4个样品，M1-4分别为模型组的4个样品。

图4-图10中，L141代表L-14-1组，CON代表空白对照组，M代表高脂饮食模型组。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对现有用于调节猫肥胖的乳酸菌及猫用益生菌产品存在的诸多问题，本发明提供能够有效缓解高脂饮食诱导肥胖、具有降脂功效的猫源性片球菌CGMCC No.27676菌株，并将片球菌CGMCC No.27676制备为冻干益生菌制剂，用于开发缓解猫肥胖的药物、饲料或保健品。该菌株冻干后仍具有高活力，且对猫临床常见致病菌具有较强的抑制效果，可耐受胃酸环境和高胆盐浓度，适应胃肠道环境，能够有效增加肥胖动物体内胆固醇代谢，降低总胆固醇含量，缓解脂肪积累和脂肪组织病变，可用于临床以减少猫肥胖的发生。

本发明的技术方案具体如下：

本发明从健康猫粪便中分离获得一株新的益生菌菌株L-14-1，通过微生物学性状分析以及16S rRNA基因序列（SEQ ID NO.1）对比分析，鉴定该菌株为片球菌（

通过耐酸实验发现，片球菌CGMCC No.27676在pH为3的环境中生长良好（4h存活率为97.32%），在pH为2的酸性环境中4h后的活菌计数存活率为96.8%，表明片球菌CGMCCNo.27676可以很好地耐受胃内酸性环境，能到达肠道发挥生物学作用。

通过耐胆盐实验发现，片球菌CGMCC No.27676在胆盐浓度为0.3%的环境中生长良好，存活率达82.6%，在胆盐浓度为0.6%的环境中存活率为71.2%，表明该菌株可以很好地耐受胆盐，能够在肠道发挥生物学作用。

通过抑菌实验发现，片球菌CGMCC No.27676对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

通过耐药性实验发现，临床常用的红霉素、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄西林等9种抗生素均可对片球菌CGMCC No.27676的生长产生有效抑制，表明片球菌CGMCC No.27676无耐药性，可安全地应用于临床。

本发明的片球菌CGMCC No.27676可以制备为益生菌制剂，该益生菌制剂含有片球菌CGMCC No.27676的活菌形式。本发明的益生菌制剂可以为胶囊、溶液或袋装粉剂。益生菌制剂的单剂量可含有1.0×10

优选地，所述益生菌制剂为口服制剂。

本发明的片球菌CGMCC No.27676还可以制备为饲料、饲料添加剂。

本发明提供了片球菌CGMCC No.27676的冻干益生菌制剂，其包含片球菌CGMCCNo.2767和冻干保护剂，所述冻干保护剂按重量百分数计为：1%蔗糖、1%半乳糖、1%海藻糖、20%脱脂奶粉和77% ddH

具体地，所述冻干益生菌制剂由片球菌CGMCC No.27676冻干粉与所述冻干保护剂按照1:8的重量比例混合制备得到。

具体地，所述冻干益生菌制剂中，片球菌CGMCC No.27676的含量为1.0×10

本发明进一步通过小鼠高脂饮食模型验证片球菌CGMCC No.27676的冻干益生菌制剂对于高脂饮食引发的肥胖具有良好的缓解作用。

具体地，在小鼠高脂饮食模型中，片球菌CGMCC No.27676的冻干益生菌制剂可以缓解腹部脂肪囤积，降低肝脏脂肪病变，减少脂质积累；可降低小鼠高脂饮食模型中血清LDL-C的含量，与饲喂PBS的小鼠高脂饮食模型的LDL-C含量存在差异；可降低小鼠高脂饮食模型中肝脏TC含量，与饲喂PBS的小鼠高脂饮食模型的TC含量存在差异。

由本发明的片球菌CGMCC No.27676制备的益生菌制剂、饲料、饲料添加剂、保健品、药物可用于防治高脂饮食导致的肥胖发生，用于预防猫肥胖的发生。

实施例1 片球菌L-14-1的筛选分离与鉴定

1、菌株L-14-1的筛选与分离

收集85只健康猫粪便样本，接种至MRS液体培养基，37℃静置培养24h后，使用PBS稀释至10

2、菌株鉴定

将分离纯化出的单菌落进行革兰氏染色、镜检，确定为单菌后使用甘油于-80℃冻存。利用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸菌基因组DNA，采用16S rRNA通用引物27F、1492R扩增目的片段，将纯化回收的PCR产物分别送生工生物工程有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI网站进行BLAST同源性比对。选取同源性最高的乳酸杆菌模式菌株核酸序列进行同源性分析，以邻接法(Neighbor-joining, NJ）构建系统进化树。结合生物学特征以及16SrRNA基因序列（SEQ ID NO.1）比对，确认L-14-1菌株为片球菌（

片球菌（

实施例2 片球菌CGMCC No.27676的特性检测

1、耐酸特性检测

将MRS液体培养基调节至pH分别为2、3、4，在培养基中按照0.01%的接种量接种片球菌CGMCC No.27676，在培养4h后，接种固体培养基并于37℃培养24h后，使用平板计数法计算活菌数，测定片球菌CGMCC No.27676的耐酸能力。

片球菌CGMCC No.27676菌株的耐酸能力如图2所示，片球菌CGMCC No.27676菌株在pH为2的酸性环境中培养4h后的存活率高达96.8%，在pH为3的环境中生长良好（培养4h，存活率高达97.32%），表明片球菌CGMCC No.27676菌株可耐受胃内酸性环境，能到达肠道发挥生物学作用。

2、耐胆盐特性检测

在MRS液体培养基中分别加入0.1%、0.3%、0.6%的牛胆盐，在培养基中按照0.01%的接种量接种片球菌CGMCC No.27676，在培养4h后，接种固体培养基并于37℃培养24h后，使用平板计数法计算活菌数，测定片球菌CGMCC No.27676的耐胆盐能力。

片球菌CGMCC No.27676菌株的耐胆盐能力如图3所示，片球菌CGMCC No.27676在胆盐浓度为0.3%的环境中生长良好，存活率达82.6%，在胆盐浓度为0.6%的环境中存活率为71.2%，表明片球菌CGMCC No.27676菌株具有较好的耐胆盐能力，可较好地耐受胃肠道环境，能够进入肠道发挥生物学作用。

3、抑菌特性检测

将处于对数生长期的片球菌CGMCC No.27676用生理盐水稀释至浓度为10

片球菌CGMCC No.27676的抑菌结果如表1所示，片球菌CGMCC No.27676菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌产生抑制作用。

表1 片球菌CGMCC No.27676菌株的抑菌实验结果

4、抗生素敏感性检测

采用纸片扩散试验法（K-B法），根据抑菌环大小，判断片球菌CGMCC No.27676对速诺、头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素等猫临床常用抗菌药物是否敏感。无菌条件下，用已灭菌的接种环挑取单菌落，接种于MRS培养基中37 ℃培养24h。每个平板涂布菌液100 μL，滴于MRS固体培养基表面，均匀涂布后，用灭菌的镊子以无菌操作方式取出含药纸片贴于培养基表面，静置一段时间后放于37 ℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌结果并用游标卡尺量取各药片组的抑菌圈半径大小，运用EXCEL软件计算其平均值，同时根据《抗微生物药物敏感性实验规范》，判断药敏效果，并将结果分为耐药、中介（耐药中介敏感）、敏感三种，检测片球菌CGMCC No.27676的抗生素敏感特性。

片球菌CGMCC No.27676菌株的抗生素敏感性结果如表2所示，猫临床常用的红霉素、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄西林等9种抗生素均可对片球菌CGMCC No.27676的生长产生有效抑制，表明片球菌CGMCC No.27676菌株对临床常见的猫用抗生素敏感，可安全应用于临床。

表2 片球菌CGMCC No.27676菌株的抗生素敏感性检测结果

实施例3 片球菌CGMCC No.27676菌株的冻干益生菌制剂的制备

将片球菌CGMCC No.27676制备为冻干粉剂，该冻干粉剂为片球菌CGMCC No.27676以及冻干保护剂的组合物，冻干保护剂按重量百分比组成如下：1%蔗糖、1%半乳糖、1%海藻糖、20%脱脂奶粉、77% ddH

冻干粉剂的制备方法具体如下：

将活化后的片球菌CGMCC No.27676使用MRS液体培养基于37℃、湿度65-70%，pH＜7条件下静置培养24h后，以6000rpm，25℃，10min进行离心，沉淀菌体，后使用ddH

片球菌CGMCC No.27676菌株冻干后菌粉活菌数量为1.0×10

实施例4 小鼠高脂饮食模型评价片球菌CGMCC No.27676缓解肥胖和降脂功效

本实施例采用高脂饮食动物模型评价片球菌CGMCC No.27676的缓解肥胖和降脂功效，具体方法和结果如下：

1、试验饲喂及分组情况

选取9只健康的4周龄Babl/c雄性鼠，随机分为L-14-1组、模型组和空白对照组，每组3只，每笼3只。使用普通繁殖料适应饲喂3天后，L-14-1组及模型组饲喂HFD（高脂肪饮食）饲料，空白对照组饲喂普通小鼠繁殖料，同时对L-14-1组灌服片球菌CGMCC No.27676的冻干益生菌制剂（制备方法参考实施例3），连续灌服28d，灌服剂量为0.1mL（1×10

2、总胆固醇及脂质代谢相关蛋白测定

试验结束时，对小鼠进行眼球摘除取血，血液采样后室温静置10min，4000rpm，离心1min，分离血清。对小鼠剖检后取出小鼠肝脏，称取0.1g加入9mL无水乙醇，进行匀浆处理后取上清进行检测。使用试剂盒测定小鼠肝脏总胆固醇（TC）及小鼠血清中LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）含量。

结果如图4、图5所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂28天后的小鼠肝脏中总胆固醇含量降低（P>0.05），血清中LDL-C含量低于模型组（P<0.05）。

3、肥胖指数变化

小鼠剖检后取出腹部脂肪，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重后计算肥胖指数，记录差异变化：

肥胖指数=（腹部脂肪重量/体重）×100；

肥胖指数结果如图6所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂的小鼠的肥胖指数显著小于仅饲喂高脂饲料的小鼠（P<0.05），表明片球菌CGMCC No.27676能够有效减少腹部脂肪堆积。

4、肝脏的脏器指数

小鼠剖检后取出肝脏，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重后计算肝脏脏器指数，记录差异变化：

脏器指数=（脏器重量/体重）×100；

肝脏的脏器指数结果如图7所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂的小鼠的肝脏脏器指数显著小于仅饲喂高脂饲料的小鼠（P<0.05），表明片球菌CGMCCNo.27676能够有效减少肝脏脂肪堆积。

5、脂肪病变情况

小鼠剖检后取出小鼠腹部脂肪，使用脂肪5-10倍体积的4%组织固定液固定脂肪组织，制作病理切片观察组织变化情况。

结果如图8所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂的小鼠腹腔脂肪细胞增生肥大情况较仅喂食高脂饲料的小鼠少，仅见少量炎性细胞，无脂肪细胞坏死灶。可见片球菌CGMCC No.27676对体内脂肪异常堆积具有明显的减轻作用。

6、体内炎症情况

试验结束时，对小鼠进行眼球摘除取血，血液采样后室温静置10min，4000rpm，离心1min，分离血清。使用ELISA试剂盒对小鼠血清中与高脂饮食相关炎性因子——白介素-6进行检测，观察体内炎症严重程度。

结果如图9所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂的小鼠体内炎症水平明显降低，白介素-6明显减少（P<0.001）。

7、粪便微生物变化情况

试验结束时，取小鼠新鲜粪便经液氮速冻后冻存于-80℃，之后使用E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA Kit (Omega, M5635-02,USA)从12个粪便样品（L-14-1组、空白对照组、模型组各取4个样品）中提取DNA，并使用Quibit dsDNA HS（Thermo，美国）测试DNA样品的浓度。之后进行PCR扩增，正向引物序列为CCTACGGGNGGCWGCAG，反向引物序列为GACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR扩增两次，PCR反应条件为：94℃，3分钟，94℃，30秒，45℃，20秒，65℃，30秒，5个循环；在94°C±20秒、55°C±20秒、72°C±30秒下进行20次循环；72°C，5分钟。使用电泳检查PCR产物。提取的DNA样品在生工生物技术（上海）有限公司进行16SrRNA测序。

微生物物种多样性（属水平）分析结果如图10所示，饲喂片球菌CGMCC No.27676冻干益生菌制剂的小鼠粪便中

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。