智能响应型三硫键桥连阿霉素单体前药的制备与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及三硫键桥连阿霉素单体前药的制备与应用，具体涉及三硫键桥连阿霉素-维生素E前药和三硫键桥连阿霉素-硬脂醇前药的合成，以及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

癌症是全球面临的重大公共卫生健康问题之一，也是导致人类死亡的第二大原因。如何攻克癌症仍然是医学上的一大难题。目前的癌症治疗手段主要包括传统的手术、化疗、放疗和新兴的免疫疗法等。化疗是一种全身的治疗手段，通过使用化学治疗药物杀灭肿瘤细胞达到治疗目的。相比于手术和放疗这种局部治疗手段，化疗对于潜在的转移病灶，或者有全身扩散倾向的肿瘤都能起到治疗效果，尤其对于不能手术切除及已经发生临床转移的中晚期肿瘤。化学治疗药物种类繁多，作用机理各不相同。其中，蒽环类药物阿霉素是目前临床上使用的一种广谱抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有治疗作用，其作用机制通过嵌入DNA双螺旋结构，影响核酸的合成，从而达到杀死肿瘤细胞的作用，属于周期非特异性药物。然而，阿霉素在治疗疾病的同时，也会带来心脏毒性，导致心律失常、心力衰竭、肥大性心肌病等严重不良反应。值得注意的是，阿霉素在临床上没有绝对的安全剂量，患者体内代谢蒽环类药物相关的基因差异使得低剂量的阿霉素也可能引起心脏毒性，这极大地限制了阿霉素的临床使用。基于纳米技术在药物递送领域的发展，盐酸多柔比星脂质体注射液(商品名：Doxil)有效地降低了其心脏的毒性，但高达25％的患者存在严重的皮肤毒性副作用，阿霉素的毒副作用仍为其临床应用带来限制，影响患者的预后。这些问题说明，为克服化疗临床的局限，亟需提高化疗药物的作用选择性，从源头上提高化疗药物的安全性，构建高效-低毒的抗肿瘤药物智能递释系统。

前药技术通过对母药进行化学结构修饰得到前药化合物，以改善药物的不良性质。前药本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程有助于增加药物的生物利用度，加强药物靶向性和选择性，降低毒副作用。与正常细胞不同，肿瘤细胞持续进行快速增殖和生长，具有非常高的活性氧(ROS)水平。同时，为了避免氧化应激带来的损伤，肿瘤细胞内的还原物质谷胱甘肽(GSH)浓度是正常细胞的四倍以上，以维持高水平的氧化还原稳态。肿瘤细胞异于正常细胞的高氧化还原水平为设计智能型前药提供了基础，已经有大量研究在前药设计中引入氧化还原敏感键，例如单硫键和二硫键，以实现肿瘤响应性释放药物，选择性杀伤肿瘤细胞。三硫键是新型的高级氧化还原敏感键，具有三个氧化还原反应位点和较高的氧化还原电位，显示出了比单硫键和二硫键更高的GSH敏感性。并且，当三硫键与药物通过酯键连接时也表现出氧化敏感性。因此，使用三硫键构建的前药分子，能够超敏响应肿瘤微环境，快速释放出活性药物发挥抗肿瘤效果，既提高了药物的抗肿瘤效果，又降低药物对正常组织的毒副作用。使用三硫键构建的阿霉素单体前药分子的相关研究还未见报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供智能响应型三硫键桥连阿霉素单体前药的制备以及在肿瘤治疗中的应用，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种三硫键桥连的前药，如通式(I)所示：

其中，R为硬脂酸基、硬脂醇基、胆固醇、维生素E、油酸-乙二醇酯、油醇、亚麻醇或亚油醇；三硫键桥联基团为含有三硫桥连的二元羧酸化合物，包括2,2'-三硫代二乙酸、3,3'-三硫代二丙酸和4,4'-三硫代二丁酸；Drug为抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物选自紫衫烷类、蒽醌类、核苷类、喜树碱类、铂类、长春碱类、泊苷类、青蒿素类化合物。

基于上述技术方案，进一步地，R选自硬脂酸基、维生素E；三硫键桥联基团为3,3'-三硫代二丙酸；所述Drug为阿霉素。

基于上述技术方案，进一步地，以硬脂酸基为侧链的三硫键桥连的阿霉素-硬脂酸前药(DOX-SSS-SA)的结构为：

基于上述技术方案，进一步地，以维生素E为侧链的三硫键桥连的阿霉素-维生素E前药(DOX-SSS-VE)结构为：

本发明提供所述的三硫键桥连的前药的制备方法，包括如下步骤：

(1)在30～60℃下，将溴丙酸水溶液在搅拌下缓缓滴加至五水合硫代硫酸钠的水溶液中，并惰性气体保护下持续反应2～6h，降至室温，然后滴加九水合硫化钠水溶液，在室温下反应10～16h，分离纯化获得3,3'-三硫代二丙酸；

(2)将步骤(1)中所得的3,3'-三硫代二丙酸溶于乙酸酐，室温下搅拌1～5h，加入硬脂酸/维生素E和DMAP，室温条件下搅拌0.5～2h，纯化得到三硫键桥连的硬脂酸或三硫键桥连的维生素E中间产物；

(3)将步骤(2)得到三硫键桥连的硬脂酸或三硫键桥连的维生素E中间产物、HBTU和DIPEA溶于DMF，冰浴活化0.5～2h，加入DOX，室温下避光反应20～50h，分离纯化获得三硫键桥连的前药。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的五水合硫代硫酸钠的水溶液的浓度为0.1～1g/mL，溴丙酸水溶液的浓度为0.1～0.5g/mL，九水合硫化钠水溶液的浓度为0.05～0.2g/mL，五水合硫代硫酸钠、溴丙酸与九水合硫化钠的摩尔比为1：0.5～0.9：0.1～0.5。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的3,3'-三硫代二丙酸与乙酸酐的摩尔比为1：2～6；硬脂酸/维生素E、DMAP与3,3'-三硫代二丙酸的摩尔比为1：0.1～0.3：1～3。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)的所述的三硫键桥连的硬脂酸或三硫键桥连的维生素E中间产物、HBTU、DIPEA和DOX的摩尔比为1：1～2：1～3：1。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)的全程都在惰性气体保护下进行。

一种药物组合物，包含所述三硫键桥连的前药以及药学上可接受的载体和赋形剂。

本发明还提供所述三硫键桥连的前药或上述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

(1)本发明设计合成了含有硬脂酸或维生素E为侧链的三硫键桥连的阿霉素单体前药，硬脂酸的长碳链结构可以提高分子的灵活性，打乱分子间的紧密堆积，进而改善化疗药物的理化性质，并使得其更容易穿过细胞膜，从而拥有更好的药动学行为和抗肿瘤效果；另一方面，硬脂酸具有良好的生物相容性、安全性、较高的稳定性，可以提升药物在正常内环境的稳定性；维生素E是机体内重要的抗氧化剂，可清除体内自由基，降低脂质过氧化物水平，一定程度上可增强机体的抗病能力，协同抗肿瘤药物共同抑制肿瘤的生长和转移，并且合成方法简单易行。

(2)本发明考察了三硫键桥连的阿霉素单体前药的细胞毒性，综合实验结果，由于三硫键具有超敏感的还原响应，两种三硫键桥连的阿霉素单体前药均能智能响应肿瘤细胞异常高的氧化还原水平，具有良好的抗肿瘤细胞增殖效果，本发明为开发智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为本发明实施例1的三硫键桥连的阿霉素-硬脂酸前药(DOX-SSS-SA)的结构验证，其中，A：DOX-SSS-SA的质谱图，B：DOX-SSS-SA的高效液相色谱纯度图。

图2为本发明实施例2中的三硫键桥连的阿霉素-维生素E前药(DOX-SSS-VE)的结构验证，其中，A：DOX-SSS-VE的质谱图，B：DOX-SSS-VE的高效液相色谱纯度图。

图3为本发明实施例1中的三硫键桥连的阿霉素-硬脂酸前药(DOX-SSS-SA)和实施例2中的三硫键桥连的阿霉素-维生素E前药(DOX-SSS-VE)对4T1细胞的细胞毒性图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1：三硫键桥连的阿霉素-硬脂酸前药(DOX-SSS-SA)的合成

首先，配制五水合硫代硫酸钠的水溶液10mL(浓度为0.5g/mL)，在50℃的油浴下，将2.3g溴丙酸溶解于20mL的纯水中，在搅拌下缓缓滴加至上述溶液中，并氮气保护下持续反应5h。反应结束后，待上述反应液降至室温，将1.1g九水合硫化钠溶解于10mL的纯水中，然后滴加至上述降温的反应液中，在室温下过夜反应12h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取三次上述反应液，合并分离得到的乙酸乙酯层液，旋干，得3,3'-三硫代二丙酸粗产物，通过制备液相分离纯化；

随后，将所得1.9g 3,3'-三硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥，将所得产物溶于20mL二氯甲烷中，并加入0.56g硬脂酸和0.025gDMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到三硫键桥连的硬脂酸中间产物；

最后，将0.91g中间产物、1g HBTU和0.32mL DIPEA(中间产物、HBTU和DIPEA摩尔比为1:1.5:1)溶于50mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴1h，然后加入1g阿霉素，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化，上述反应全程都在N

采用质谱法验证实施例1中制得的DOX-SSS-SA的结构，采用高效液相色谱法来验证实施例1中制得的DOX-SSS-SA的纯度，结果如图1所示。质谱结果为MS(ESI)m/z[M+Na]

实施例2：三硫键桥连的阿霉素-维生素E前药(DOX-SSS-VE)的合成

首先，配制五水合硫代硫酸钠的水溶液10mL(浓度为0.5g/mL)，在50℃的油浴下，将2.3g溴丙酸溶解于20mL的纯水中，在搅拌下缓缓滴加至上述溶液中，并氮气保护下持续反应5h。反应结束后，待上述反应液降至室温，将1.1g九水合硫化钠溶解于10mL的纯水中，然后滴加至上述降温的反应液中，在室温下过夜反应12h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取三次上述反应液，合并分离得到的乙酸乙酯层液，旋干，得3,3'-三硫代二丙酸粗产物，通过制备液相分离纯化。

随后，将所得1.9g 3,3'-三硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于20mL二氯甲烷中，并加入0.85g维生素E和0.025gDMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到三硫键桥连的维生素E中间产物；

最后，将1.25g中间产物、1g HBTU和0.32mL DIPEA(中间产物、HBTU和DIPEA摩尔比为1:1.5:1)溶于50mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴1h，然后加入1g阿霉素，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化，上述反应全程都在N

采用质谱法来验证实施例2中制得的DOX-SSS-VE的结构，采用高效液相色谱法来验证实施例2中制得的DOX-SSS-VE的纯度，结果如图2所示。质谱结果为MS(ESI)m/z：[M+Na]

实施例3：三硫键桥连的阿霉素单体前药的细胞毒性

采用MTT法考察三硫键桥连的阿霉素单体前药对小鼠乳腺癌(4T1)细胞的毒性。首先将形态良好的细胞消化，用培养液稀释至10000个细胞/mL，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后分别加入DOX溶液、实施例1和实施例2中制备的三硫键桥连阿霉素单体前药溶液。本实验中药物溶液均用培养相应细胞的培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔，于加药后48h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后弃去培养基，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。

结果如图3所示，由于前药在细胞中发挥作用需要经历激活的过程，因此两种三硫键桥连的阿霉素单体前药的细胞毒性均弱于阿霉素溶液剂。但是，由于三硫键具有超敏感的还原响应，两种三硫键桥连的阿霉素单体前药均能智能响应肿瘤细胞异常高的氧化还原水平，表现出良好的抗肿瘤细胞增殖效果，并且将有利于体内治疗降低脱靶毒性，提高治疗安全性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。