高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌及选育方法

技术领域

本发明属于微生物领域，特别涉及一种高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌及其选育方法。

背景技术

硒(Selenium,Se)是人体生长发育所必需的微量元素，人体摄取硒元素的主要途径为食物中的膳食硒，适量地补充硒有利于提高人体的免疫能力和抗癌、抗衰老等能力，但过量摄入会引发硒中毒。在自然界中，硒资源主要存在于地壳中，其含量为0.05ppm。硒也存在于天然食品当中，但是其中的硒含量普遍较少，并且由于无机硒的毒性比较高，用于食品中并不合适。所以经过菌种生物转化与合成，生产安全高效的含硒食品，是非常具有意义的。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种好氧的革兰氏阳性细菌，在自然界中广泛分布于土壤、水、空气、食物等以及动物肠道等处。枯草芽孢杆菌不仅具有耐盐、抗高温、耐酸、易于培养和保存等特性，还具有调节肠道菌群、合成多种维生素、促进发酵等能力以及发酵周期短等优点，是一种常见的益生菌。其可以表达很多种酶应用于食品生产中，也可以发酵豆豉使营养物质更易被人体吸收利用。作为一种益生菌，枯草芽孢杆菌还可以作为饲料添加剂添加于饲料中来平衡动物肠道的菌群，提高动物免疫力以降低动物饲养成本。自19世纪起硒的微生物转化就成了热点，所以枯草芽孢杆菌的富硒转化就极具代表性。富硒枯草芽孢杆菌就是在枯草芽孢杆菌培养的过程中加入硒，使枯草芽孢杆菌在生长时就吸收利用了硒，并经过体内的一系列有机结合(与蛋白质、多糖等)转化为有机硒，很多研究表明在饲料中添加富硒菌可以提高生物的生长率免疫力、抗病力以及消化酶活性。那么将无机硒转化为有机硒，作为人和动物的良好硒补充剂，消除无机硒对生物机体的毒副作用以及对肠胃的刺激，使硒能更安全高效的被生物体吸收利用。

因此对于现在食品经过菌种生物转化与合成用来生产安全高效的硒补充剂、含硒食品等，是非常具有意义的。

发明内容

本发明提供一种高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌及选育方法，使硒能更安全高效的被生物体吸收利用。

本发明采取的技术方案是，

一种高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLU-201，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.25995，保藏日期2022年10月31日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201分离自传统发酵食品泡菜中，其菌种形态特征：该菌种细胞大小为0.4-0.8μm×2.0-3.0μm，呈杆状，革兰氏阳性菌，菌体中央或偏处有芽孢，呈椭圆或圆柱状，芽孢宽0.8μm，长为1.5μm-1.8μm，其菌落形态特征：菌落表面干燥不平整、边缘有褶皱，不透明、呈乳白色或褐色，菌落直径有1.0-1.5mm；生理生化特征：枯草杆菌生长速度快,对营养要求比较低,在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟；耐酸碱。其代谢产物不会产生毒素,是一种无致病性的安全微生物。

本发明所述高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

本发明所述的高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201的选育方法，包括下列步骤：从传统发酵食品泡菜中分离采集出样品，经培养纯化后，取待测悬浮液涂布到亚硒酸钠LB固体培养基中，选出耐硒能力较强的菌落，将菌株接种到不同亚硒酸钠浓度、不同亚硒酸钠添加时间的LB液体培养基中培养，通过GB5009.93—2017食品安全国家标准食品中硒的测定对枯草芽孢杆菌JLU-201有机硒转化率测定实验，得到枯草芽孢杆菌JLU-201最佳富硒条件。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201在1-30mmol/L亚硒酸钠LB培养基中培养，培养时间在24h内，亚硒酸钠浓度为5mmol/L时的有机硒转化率可达到86.2％。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201的含硒固体平板的耐受性能达到1-30mmol/L。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201的富硒培养经条件优化后，亚硒酸钠添加浓度为0.1-1.5mmol/L，最佳亚硒酸钠添加浓度为1mmol/L，亚硒酸钠添加时间为8h，有机硒转化率可达到94.61％。

本发明的有益效果如下：

枯草芽孢杆菌JLU-201从传统发酵食品泡菜中分离得到，基于对耐硒能力的测定，是一个新的品种；通过序列分析和生理生化特性JLU-201被鉴定为枯草芽孢杆菌，所提供的枯草芽孢杆菌JLU-201能够在高硒浓度情况下，保持较高活性并且有较高的有机硒转化率。因其是从食物中提取，因此是一种安全可食用的益生菌。作为一个新被发现的菌种，对于枯草芽孢杆菌JLU-201的高耐硒和高富硒率特性的相关研究是空白的，本发明结果为枯草芽孢杆菌JLU-201的开发和应用提供了可借鉴的经验，因枯草芽孢杆菌JLU-201既具有较高的耐硒能力，又具有较高的有机硒转化效率，其在富硒食品补充剂方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌JLU-201在固体平板上的菌落形态图；

图2.是枯草芽孢杆菌JLU-201的革兰氏染色图；

图3是枯草芽孢杆菌JLU-201在固体平板上的菌落形态图；

图4是枯草芽孢杆菌JLU-201基于16S rDNA基因发育树。

具体实施方式

一种高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JLU-201，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.25995，保藏日期2022年10月31日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201分离自传统发酵食品泡菜中，其菌种形态特征：该菌种细胞大小为0.4-0.8μm×2.0-3.0μm，呈杆状，革兰氏阳性菌，菌体中央或偏处有芽孢，呈椭圆或圆柱状，芽孢宽0.8μm，长为1.5μm-1.8μm，如图2；其菌落形态特征：菌落表面干燥不平整、边缘有褶皱，不透明、呈乳白色或褐色，菌落直径有1.0-1.5mm；如图1；生理生化特征：枯草杆菌生长速度快,对营养要求比较低,在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟；耐酸碱。其代谢产物不会产生毒素,是一种无致病性的安全微生物。

本发明所述高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

本发明所述的高耐硒、高有机硒转化率的可食用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JLU-201的选育方法，包括下列步骤：从传统发酵食品泡菜中分离采集出样品，经培养纯化后，取待测悬浮液涂布到亚硒酸钠LB固体培养基中，选出耐硒能力较强的菌落，将菌株接种到不同亚硒酸钠浓度、不同亚硒酸钠添加时间的LB液体培养基中培养，通过GB5009.93—2017食品安全国家标准食品中硒的测定对枯草芽孢杆菌JLU-201有机硒转化率测定实验，得到枯草芽孢杆菌JLU-201最佳富硒条件。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201在1-30mmol/L亚硒酸钠LB培养基中培养，培养时间在24h内，亚硒酸钠浓度为5mmol/L时的有机硒转化率可达到86.2％。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201的含硒固体平板的耐受性能达到1-30mmol/L。

本发明所述枯草芽孢杆菌JLU-201的富硒培养经条件优化后，亚硒酸钠添加浓度为0.1-1.5mmol/L，最佳亚硒酸钠添加浓度为1mmol/L，亚硒酸钠添加时间为8h，有机硒转化率可达到94.61％。

为了能够更加清楚的了解本发明的技术方案，以下将结合具体实例，详细说明本发明的技术方案。

实施例1.枯草芽孢杆菌JLU-201菌株的分离、筛选、纯化

将泡菜汁经四层纱布过滤除去汤汁中的沉淀物，取10mL滤液于锥形瓶中加入90mL无菌水，于80℃水浴中加热10min以去除非枯草芽抱杆菌体，加热后的泡菜汁置于无菌操作台中，取10mL加入装有90mL的培养基A中，于恒温振荡培养箱中37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，整个过程均在紫外超净工作台中完成。将培养好的培养液取100μL涂布于培养基B上，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察其是否出现表面粗糙不透明、污白色或微黄色的特征菌落。用接种环挑取平板上生长良好的特征单菌落，接种于100mL的培养基A中培养24h，获得分离、筛选后的富集菌液A。

向100ml培养基A中加入1ml菌液A，在37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，获得细菌富集液。

取细菌富集液100μL滴加到由培养基B制备的培养平板中并进行涂布，涂布后将培养平板在37℃的恒温培养箱中培养24h，观察其是否出现白色或微黄色特征菌落。

用接种环挑取培养平板B上单个特征菌落置于培养基C中，在37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，获得富硒菌液(菌液C)。

取100μL菌液C再次涂布于培养平板B上，涂布后将平板在37℃的恒温培养箱中培养24h，再挑取紫色特征菌落于培养基A中培养获得菌悬液。重复本步骤纯化3次，可获得目标菌株，如图1。

培养基A成分(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g，自然pH值；

培养基B成分(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、琼脂粉15g，自然pH值。

实施例2.枯草芽孢杆菌JLU-201菌株的鉴定

(1)枯草芽孢杆菌JLU-201菌株的形态学和生理生化特征

菌种形态特征：该菌种细胞大小为0.4-0.8μm×2.0-3.0μm，呈杆状，革兰氏阳性菌。菌体中央或偏处有芽孢，呈椭圆或圆柱状，芽抱大小约宽0.8μm，长约为1.5μm-1.8μm，如图2；

菌落形态特征：菌落表面干燥不平整、边缘有褶皱，不透明、呈乳白色或褐色，菌落大小直径约有1.0-1.5mm，如图1；

生理生化特征：枯草杆菌生长速度快,对营养要求比较低,在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20min；耐酸碱。其代谢产物不会产生毒素,是一种无致病性的安全微生物。

(2)枯草芽孢杆菌JLU-201菌株16S rDNA鉴定

将目标菌液接种于培养基A中，将其置于37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，进行菌种的扩大培养，获得菌悬液。将菌悬液送至生工生物工程上海股份有限公司进行测序。该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

表1菌株序列片段系统分析表

对菌株序列片段进行了系统分析，通过与NCBI中已有的16S rDNA序列进行Blast相似性对比确定菌株的种属，结果表明所筛选的枯草芽孢杆菌JLU-201菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有超过98％的相似性。再结合菌株的形态学特征和比对结果，最终将菌株确定为芽孢杆菌属，命名为枯草芽孢杆菌JLU-201。采用相邻法构建出JE21的基因发育树，如图4所示。

实施例3.枯草芽孢杆菌JLU-201菌株的耐硒能力实验

参考GB 5009.93—2017食品安全国家标准食品中硒的测定对枯草芽孢杆菌JLU-201有机硒转化率测定实验。

将枯草芽孢杆菌JLU-201菌液接种于培养基A中，将其置于37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，进行菌种的扩大培养，获得菌悬液。

以5％的接种量将枯草芽孢杆菌JLU-201菌悬液接种于培养基C、培养基D、培养基E、培养基F、培养基G中，将其置于37℃、180rpm/min的恒温摇床中震荡培养24h，获得富硒菌液，取1mL富硒菌液8000rpm离心10min，弃上清，用生理盐水反复冲洗沉淀中的菌体，再用生理盐水稀释至浓度为1×10

上述实验重复3次，求其平均菌落数。

表2枯草芽孢杆菌JLU-201对不同硒浓度的耐受情况

表2结果显示枯草芽孢杆菌JLU-201在高浓度硒中能长势良好并且有较高的生物量。有机硒转化率公式：

式中：A------总硒量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L)。

B------无机硒量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L)。

表3枯草芽孢杆菌JLU-201不同硒浓度的有机硒转化率

表3结果显示枯草芽孢杆菌JLU-201在高浓度硒中有较高的有机硒转化能力。

培养基C(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、亚硒酸钠0.173g，自然pH值。

培养基D(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、亚硒酸钠0.865g，自然pH值。

培养基E(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、亚硒酸钠1.73g，自然pH值。

培养基F(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、亚硒酸钠3.46g，自然pH值。

培养基G(g/L)：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母浸出粉5g、亚硒酸钠5.19g，自然pH值。

实施例4.枯草芽孢杆菌JLU-201菌株的富硒亚硒酸钠添加时间实验

参考GB 5009.93—2017食品安全国家标准食品中硒的测定对枯草芽孢杆菌JLU-201有机硒转化率测定实验。

向不同生长阶段的枯草芽孢杆菌中添加亚硒酸钠都会影响枯草芽孢杆菌的生长，本实验研究枯草芽孢杆菌JLU-201生长的最适亚硒酸钠添加时间。

根据枯草芽孢杆菌JLU-201生长曲线来选取时间点，本实验在枯草芽孢杆菌JLU-201生长的第0、4h、8h、12h、16h这5个时间点添加亚硒酸钠。以0、4h、8h、12h、16h作为亚硒酸钠的添加时间，添加20mmol/L的亚硒酸钠，以不添加亚硒酸钠的培养基A作为空白对照组。以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌JLU-201的种子37℃、180rpm/min条件下培养24h，获得富硒菌液，取1mL富硒菌液8000rpm离心10min，弃上清，用生理盐水反复冲洗沉淀中的菌体，测定对枯草芽孢杆菌JLU-201有机硒含量。通过有机硒转化率确定枯草芽孢杆菌JLU-201的生长过程中的最适亚硒酸钠添加时间。有机硒转化率公式：

式中：A------总硒量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L)。

B------无机硒量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或mg/L)。

表4.枯草芽孢杆菌JLU-201相同硒浓度不同时间的有机硒转化率

表4结果显示第8h有机硒转化率较高，为枯草芽孢杆菌JLU-201在高浓度硒中最适亚硒酸钠添加时间。培养基中添加Na