乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2及其应用。

背景技术

窖泥质量对浓香型白酒的风味和品质至关重要。窖池在自然老熟的过程中，易出现退化现象，退化窖泥的水分、pH值明显低于优质窖泥(pH 4.1 5.6之间)，进而出现板结变硬，窖泥表面夹杂大量乳酸钙、乳酸铁结晶等问题，且退化窖泥中有益菌如己酸菌、丁酸菌、酵母菌等代谢受阻，功能菌数量减少。因此，提高窖泥pH值对缓解窖泥老化或退化，稳定窖泥的微生态具有积极作用。

窖泥发酵液中乳酸含量很大程度上会影响浓香型大曲酒窖泥老化速度，乳酸含量高将使窖池退化加剧，显著降低浓香型白酒质量。因此，降低发酵过程中乳酸含量，对于调节窖池环境、养护窖池十分重要。

目前常通过化学添加Ca(OH)

发明内容

本发明针对现有技术中窖泥pH降低导致的窖泥退化或现有乳酸利用微生物生长条件严苛、难以在低pH条件下消耗乳酸等问题，提供一株乳酸利用菌Lysinibacillussp.R-2，并提供了该菌株在降解乳酸、白酒发酵等领域的应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

本发明提供了一株乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2，保藏编号为CCTCC NO.M2022654，于2022年05月17日保藏于湖北省武汉市武昌区武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类学命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)R-2。

上述所述的乳酸利用菌R-2分离于湖北浓香型优质老窖泥，具有优良的乳酸利用能力，可通过将其制成窖池养护液喷洒于窖池中，使窖池pH维持稳定状态，进而改善窖池pH较低成的窖池老化问题，防止由于窖泥酸化带来的微生物菌群失调现象，及时达到养窖护窖的作用。而且，消耗乳酸有利于防止钙化物质形成(乳酸钙、乳酸亚铁)，降低乳酸及乳酸乙酯浓度过高对白酒风味的不利影响，由此能够改善白酒的风味和品质。

乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2的特性如下：

形态特征：

菌株革兰氏阳性，菌体呈直杆状，无荚膜。菌落呈圆形、不透明乳黄色，突出于培养基表面，且菌落边缘有一圈半透明刺突状，菌落平均直径2-3mm。

培养特征：

Lysinibacillus sp.R-2在25-37℃的温度范围和3.0-8.0的pH范围内生长良好，优选生长温度为30-35℃、生长pH为4.0-7.0。

生理生化特征：

16S rRNA基因序列测序：对16s rRNA基因序列进行同源比对分析，Lysinibacillus sp.R-2与Lysinibacillus sp.序列相似性超过99％，显示乳酸利用菌R-2与Lysinibacillus sp.聚集在同一分支。

基于形态特征、培养特征、生理生化分析、16S rRNA基因序列多项分析，将本发明新分离的乳酸利用菌R-2归属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)。

Lysinibacillus sp.R-2在营养肉汤培养基中连续传代数代，其培养特征及菌落形态等均无明显变化，乳酸利用能力在25％-60％之间，菌株的生物学性状稳定。

另外，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2。以Lysinibacillus sp.R-2作为活性成分制备成菌剂，如液体菌剂或固体菌剂，该菌剂具有良好的乳酸利用能力。

进一步地，所述菌剂还包括培养基，所述培养基包括：乳酸5g/L、(NH

另外，本发明提供了如上所述的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2或如上所述的菌剂在白酒发酵中的应用。由于乳酸在窖池积累影响风味，本发明获得的菌株可应用于窖池发酵，促进乳酸消耗转化，降低乳酸含量，从而改善与提高白酒的风味与品质。

同时，本发明提供了如上所述的的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2或如上所述的菌剂在制备人工窖泥或养护人工窖泥中的应用。将本发明的菌株喷洒于窖池中，糟醅中的乳酸含量可降低40-80％，使窖池pH维持稳定状态，优级酒率提高30％以上。因此，乳酸利用菌R-2及含有该菌株的菌剂也可用于优质人工窖泥的制备。

进一步地，乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2及含有该菌株的菌剂在窖泥中的加入量为糟醅总质量的1-5％，优选为3-5％。

此外，本发明如上所述的的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2或如上所述的菌剂还可用于含有乳酸废水的治理中。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2具有优良的乳酸利用能力，可通过消耗乳酸使窖池pH维持稳定，防止由于窖泥酸化带来的微生物菌群失调和窖泥退化，达到养窖护窖的作用。而且，乳酸含量降低有利于抑制乳酸乙酯的合成，改善白酒的风味和品质。

2.本发明提供的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2具有宽泛的培养条件，能够适应白酒发酵和/或窖泥严苛的环境，具有耐受高乳酸、低pH酿造环境的特性，且在低pH下生长良好，有利于实际应用，强化低pH窖泥时的养护效果。

3.本发明提供的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2分离于老窖泥中，为窖泥土著菌，将其用于白酒发酵或窖泥养护等，易于与窖泥原有微生物共生共存，对原有微生态的影响较小，其施用对环境是无害的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为乳酸利用菌R-2的革兰氏染色结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。

实施例涉及到的培养基配方及试剂组分如下：

营养肉汤培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂17g/L，p H＝7.0；121℃灭菌20min。

R2培养基：(NH

实施例1

乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2的分离、筛选和鉴定

一、采用富集培养法从窖泥中分离具有乳酸利用能力的菌株，具体而言，从湖北某浓香型优质老窖泥中取样，加入到含有乳酸5g/L的R2培养基中富集培养，经过多次分离纯化，得到本发明的菌株，记为乳酸利用菌R-2。

二、观察菌株形态特征，具体如下：将纯化的菌接种于营养肉汤培养基过夜活化，划线于营养肉汤固体培养基，在30℃条件下倒置培养3d。观察菌落的表面形态，乳酸利用菌R-2的菌落呈圆形、不透明乳黄色，突出于培养基表面，菌落边缘有一圈半透明刺突状，菌落平均直径2-3mm。另外，选取单菌落进行革兰氏染色，观察菌体的显微形态，参见图1，菌体革兰氏阳性，呈直杆状，无荚膜。

三、生理生化特征：采用伏普(VP)实验、接触酶、氧化酶等方法对筛选到的乳酸利用菌R-2进行生化特征测定，其接触酶、氧化酶和过氧化氢酶反应阳性，VP反应阴性，能水解明胶，发酵果糖产酸，与赖氨酸芽孢杆菌模式种的生理生化具有相同特征。

四、16S rRNA基因序列测序：采用通用引物1492R和27F扩增菌株的16s rRNA基因序列，经测序，其由1455bp碱基组成，其序列信息如下所示：

tgcttggcggcgtgctatacatgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcacctkgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccsgaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtycacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacrggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattygaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctytgacaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgttgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgattttagttgccatcattaagttgggcactttaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttttcagttcggattgtaggctgcaacttgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaccccacgagagtttgtaacccccgaagtcggtggggtaaccttttggagccagccgcctaaggtgacagatgc(见SEQ ID NO：1)。

将SEQ ID NO：1与GenBank文库中已有序列进行同源比对分析，发现乳酸利用菌R-2与Lysinibacillus sp.各株之间序列相似性超过99％，证明乳酸利用菌R-2与Lysinibacillus sp.属于同一进化分支。

基于形态特征、培养特征、生理生化分析、16S rRNA基因序列多项分析，将本发明新分离的乳酸利用菌R-2归属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)。

Lysinibacillus sp.R-2在含有乳酸5g/L的营养肉汤培养基中连续传代50代以上，其培养特征及菌落形态等均无明显变化，乳酸利用能力在25％-60％之间，菌株的生物学性状稳定。

实施例2

乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2的培养

将纯化后的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2以1％接种量接种于R2培养基中，分别置于不同温度条件下和不同pH条件下进行培养，培养48h后，分别取样测定菌种浓度OD

表1不同温度下菌种浓度

表2不同pH下菌种浓度

由表1-2可知，乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2在25-37℃的温度范围和3.0-8.0的pH范围内生长良好，优选生长温度为30-35℃，生长pH为4.0-7.0。本发明的菌株具有宽泛的培养条件，且能够耐受更低的pH值，在pH5.0以下也能迅速生长，能够适应白酒发酵高乳酸、低pH的环境。

实施例3

乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2的乳酸利用实验

将纯化后的乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2转接于无菌营养肉汤斜面培养基中，在28-32℃培养48-52h，即为一级试管斜面种子。将一级种子接种于100mL营养肉汤液体培养基，接种量为5％，30℃、180r/min培养12h，之后将活化的一级种子液分别接种于装有200mL R2培养基的三角瓶中，接种量为5％，之后加入一定量的乳酸，30℃条件下加20mL液体石蜡液封后静置培养5d，期间每隔24h取样测定乳酸含量，结果见表3。

表3乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2乳酸利用能力

由表3可知，随着时间延长，乳酸含量快速降低，可见本发明的菌株Lysinibacillus sp.R-2具有优良的乳酸利用能力，到第5d时，乳酸利用率达到83％以上。

进一步通过单因素实验，分别在不同温度、不同接种量、不同pH条件下进行培养，进一步验证菌株乳酸利用能力，乳酸利用率最高时的培养条件为pH6.5、温度35℃、接种量3-5％。表4示出了培养条件为pH6.5、温度35℃，不同接种量下菌株对乳酸的利用情况。

表4乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2在不同接种量下的乳酸利用情况

实施例4

含有乳酸利用菌Lysinibacillus sp.R-2的菌剂养护窖池

将对数生长期的乳酸利用菌制成强化菌剂，喷洒于窖池内部，每口窖池按照糟醅质量百分比的3％比例喷洒，强化菌剂合格后应尽快使用，防止活力衰退。

常规浓香型大曲酒发酵工艺中，粮醅入窖时加入占糟醅总质量3-5％强化菌剂，按常规方法发酵，糟醅中的乳酸含量较对照窖池(未加入本发明的乳酸利用菌制成的强化菌剂)可降低40-80％，优级酒率提高30％。