一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法及其在反刍动物氧化应激方面的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法及其在反刍动物氧化应激方面的应用。

背景技术

刺梨(Rosa roxburghii)为蔷薇科蔷薇属植物，贵州为其主要集中地区，资源区域特色性强。截至2021年，贵州省全省刺梨种植面积达210万亩，生产经营企业70余家，刺梨系列产品销售收入111亿元，是贵州十二大农业特色优势产业之一。目前对于刺梨果利用，主要以榨汁为主，榨汁率约50％，每年约有45万吨的刺梨渣副产物产生。研究表明，刺梨果渣含有丰富的营养物质，具有抗氧化、降血糖等功效，有很高的价值，但不易储存，产生的刺梨果渣若不及时进行烘干保存，刺梨果渣很快就发霉腐烂，浪费资源且污染环境，但烘干将大大增加处理成本，因此急需一种低成本的处理方式以解决刺梨果渣因保存不易或成本高造成其使用范围受限的问题。

酵素因富含益生菌、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶和多酚、黄酮、氨基酸、有机酸等生物活性成分而在食品、农用饲料等领域受到广泛关注。大量研究表明，酵素具有抗氧化、调节肠道菌群、抑菌等功效。相关研究表明，酵素经发酵后不仅能大量保留发酵基质原有的营养物质，而且能促进多酚、黄酮等次级产物的形成，具有促进新陈代谢、抗氧化等生理功能。

活性氧通常会引起动物的氧化应激，使动物处于亚健康状态，从而影响动物生长。先前的研究表明，在反刍动物日粮中应用外源抗氧化剂，如酚类化合物、花青素、儿茶素、碧萝卜素、虾青素和类黄酮类化合物是缓解氧化应激的有效策略。然而，这些外源抗氧化剂作为饲料添加剂的应用可能受到提取过程中产量低、缺乏原材料和提取成本高的限制，因此，寻找易得、低价的外源抗氧化剂迫切需要。

现有技术为了对刺梨果渣进行二次利用，提高其商业价值，已经有些相关研究利用物理方式、化学方式以及发酵方式处理刺梨。

公开号为CN107183732B的一种微生物发酵提高刺梨果渣综合品质的方法，该发明直接采用刺梨果渣作为原料，接入短乳杆菌CICC.6239和嗜酸乳杆菌GIM.1.208菌种液体种子培养基。发酵后其三萜、水溶性膳食纤维的含量大幅提升，多酚活性组分含量提高。但该发酵方式所得发酵物其组织状态以及抗氧成分含量提高效果不显著。

公开号为CN110419696A的一种刺梨发酵营养液及其应用，该发明接入乳酸菌和酵母菌进行复配发酵培养，发酵后的产物滤液中Vc和SOD含量高且稳定性好，不易褐变。但此方法只利用了刺梨果渣发酵后的滤液，并没有对刺梨果渣进行综合利用。

本发明采用微生物添加对刚榨汁的刺梨果渣进行厌氧发酵，发酵后的刺梨果渣对降低牛羊等反刍动物氧化应激起到积极作用，可缓解动物的氧化应激反应，使动物健康生长，此外，通过该发酵技术还实现了刺梨果渣的长期储存，发酵后的刺梨果渣无异味、发霉等现象出现，而且刺梨果渣中活性成分及营养成分得以保留在初始状态。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法及其在生物饲料中的应用，该方法制备工艺简单、低成本、能有效提高鲜刺梨果渣的保存时间，同时发酵后的刺梨果渣其抗氧化能力显著提升，其在动物饲粮中的应用对降低牛羊等反刍动物氧化应激反应起到积极作用。

本发明拟解决的技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法，包括如下步骤：

1)将新鲜的刺梨果渣进行渣与籽的分离，获得无籽的刺梨果渣；

2)将植物乳酸杆菌发酵液与步骤1)得到的刺梨渣混合均匀，混合均匀后的刺梨果渣装入不透光的密封袋，压实，封袋后发酵即得发酵刺梨渣。

优选为，步骤2)中，所述的植物乳酸杆菌发酵液由保藏编号为ACCC11016的植物乳杆菌扩培制成。

优选为，步骤2)中，所述植物乳酸杆菌发酵液的用量为5×10

优选为，步骤2)中，封袋后发酵时间≥30天，发酵温度为25～37℃。

进一步优选为，发酵温度为25～32℃。

进一步优选为，所述植物乳酸杆菌发酵液扩培步骤具体为：将装有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的冷冻干燥安瓿用无菌的镊子敲开安瓿管顶端，然后用无菌吸管加0.3ml无菌水于安瓿管内，使冻干菌种块溶化呈悬浮状，最后用无菌吸管取0.1ml悬浮液于已制备好的MRS培养基斜面上进行厌氧培养，涂匀，培养温度为33～37℃，待菌种生长后将其取出接种到MRS液体培养基，33～36℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2～3天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得植物乳酸杆菌发酵液；其中发酵液中植物乳杆菌的数量通过使用光度计实现1×10

将本发明制备所得的植物乳酸杆菌发酵刺梨渣作为外源抗氧化剂应用于缓解牛、羔等反刍动物氧化应激反应，所述植物乳杆菌发酵刺梨果渣在反刍动物的全日混合饲粮中的添加比例为5-15％。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供了一种利用植物乳杆菌发酵保存刺梨果渣的方法，该方法刺梨果渣发酵过程不需要高温灭菌，发酵过程中不需要加水或放水，成品不用干燥处理，制备工艺简单，生产成本低，发酵的刺梨渣成品保质期在一年以上。

2.本发明的发酵工艺在保留刺梨渣原有营养基质的基础上，提高了刺梨渣中氧化酶的活性，酚类物质比例显著增加，刺梨渣总抗氧化活性有效增强。本发明抗氧化应激实验结果表明，将本发明发酵后的刺梨渣应用在动物饲粮中，能显著提高羔羊免疫能力，有效改善羔羊抗氧化指标，可以缓解羔羊的氧化应激反应。

3.本发明刺梨果渣不经过高温杀菌，有效保留了其中挥发性的风味物质及活性成分，同时，利用植物乳酸菌进行发酵，在不破坏原料营养成分的基础上大大延长了原料保存期限，同时发挥了植物乳酸菌在调节肠道菌群，增强免疫力的作用，本发明的实验结果表明乳酸菌对刺梨果渣发酵具有积极影响；

4.本发明通过密封袋发酵，可持续高效发酵刺梨果渣。发酵后果渣总抗氧化能力活性均高于对照组，果渣的营养价值显著提高，且发酵过程有效抑制了霉菌等致腐微生物的产生，解决了鲜刺梨渣易腐败的问题。

5.本发明经感官评价和化学成分变化实验研究结果表明，本发明的发酵后的刺梨果渣长期保存其气味、颜色与结构保留在原始的状态，感官评价结果良好；发酵后的果渣中水溶性碳水化合物、粗蛋白、非蛋白氮、氨含量无影响，总酚比例有所增加，能很好地保留其原有和发酵所产生的营养基质。

附图说明

图1为添加植物乳杆菌保存60天后的刺梨果渣薄层色谱图(图中第一个点clf为保存60天后的刺梨果渣，cl为刚榨汁后得到的新鲜刺梨渣)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：

一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法，包括如下步骤：

1)将新鲜的刺梨果渣进行渣与籽的分离，获得无籽的刺梨果渣；

2)将用量为5×10

实施例2：

一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法，包括如下步骤：

1)将新鲜的刺梨果渣进行渣与籽的分离，获得无籽的刺梨果渣；

2)将用量为1.25×10

实施例3：

一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法，包括如下步骤：

1)将新鲜的刺梨果渣进行渣与籽的分离，获得无籽的刺梨果渣；

2)将用量为2.5×10

实施例4：

一种利用植物乳杆菌发酵刺梨果渣的方法，包括如下步骤：

1)将新鲜的刺梨果渣进行渣与籽的分离，获得无籽的刺梨果渣；

2)将保藏编号为ACCC11016的植物乳杆菌扩培成植物乳酸杆菌发酵液，按用量为2.5×10

实施例5：

实施例1-4的植物乳酸杆菌发酵液按下述方法扩培得到：

将装有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的冷冻干燥安瓿用无菌的镊子敲开安瓿管顶端，然后用无菌吸管加0.3ml无菌水于安瓿管内，使冻干菌种块溶化呈悬浮状，最后用无菌吸管取0.1ml悬浮液于已制备好的MRS培养基斜面上进行厌氧培养，涂匀，培养温度为33-37℃，待菌种生长后将其取出接种到MRS液体培养基，33-36℃恒温培养箱进行一次复壮培养，培养2-3天后，取1ml培养液转接到新的MRS培养基进行二次扩培，活化好的菌株离心获得菌体，用无菌生理盐水清洗三次，收集菌体，菌体用无菌水制成菌悬液，即可获得发酵液。其中发酵液中植物乳杆菌的数量通过使用光度计实现1×10

实验例：

发明人对本发明的菌种添加量和技术效果进行了大量的实验研究，部分摘录如下：

1、发酵刺梨果渣的实验设计

1.1实验方法

按表1将相应设计量的植物乳杆菌添分别加到三组新鲜刺梨果渣中，混匀，装入不透光的密封袋，压实，封袋后，控制发酵温度为25-37℃之间，发酵30天以上。对发酵保存60天的刺梨渣的总抗氧化能力、抗氧化酶活性物质，刺梨渣中的植物乳杆菌、酵母、霉菌和化学成分变化的情况进行测定，并对发酵后保存的刺梨果渣进行感官评分。

表1菌种添加量设计

1.2实验结果

试验结果见表2-5和图1。

发酵保存60天后刺梨果渣抗氧化能力测定结果见表2：

表2发酵保存60天后刺梨果渣抗氧化能力测定结果

由表2可知，所有添加植物乳杆菌组的总抗氧化能力(T-AOC)活性均高于CK(P<0.01)。随着接种量的增加，第3组(1.25×10

发酵保存60天后刺梨果渣中植物乳杆菌、酵母及霉菌的测定结果见表3：

表3发酵保存60天后的刺梨果渣中植物乳杆菌、酵母及霉菌情况

由表3可知，当菌种添加量为2.5×10

发酵保存60天后刺梨果渣的感官评价结果见表4：

表4发酵保存60天后的刺梨果渣感官评价

由表4可知，当菌种添加量为2.5×10

不同植物乳杆菌添量对发酵刺梨果渣的化学成分变化见表5和图1：

表5：不同植物乳杆菌添量对发酵刺梨果渣的化学成分变化

由表5可知，不同接种量的植物乳杆菌对刺梨渣水溶性碳水化合物、粗蛋白、非蛋白氮、氨没有影响，但与对照组相比，用植物乳杆菌发酵后总酚比例有所增加(P<0.01)。而酚类物质是蔬菜和水果中发现的天然抗氧化剂，其特点是清除自由基，从而降低氧化应激水平。

由图1可知，保存后的刺梨果渣小分子活性成分没有发生改变。

2、动物抗氧化应激实验

2.1实验方法

2022年10月发明人利用本发明的方法制备所得发酵刺梨渣进行了动物抗氧化应急实验。选择15只体重接近(不超过平均体重的正负5％)，健康状况良好断奶羔羊，实验随机分为3组，试验组A：基础日粮；试验组B：基础日粮+10％Group2组中的刺梨果渣，试验组C：基础日粮+10％Group 3组中的刺梨果渣，每组的基础日粮成分相同，管理水平一致，试验期14天。

实验结束后进行颈静脉采血，测定免疫指标和抗氧化指标。

2.2实验结果

实验结果见表6和表7。

表6实验结束后不同组别的羔羊免疫球蛋白情况表

表7实验结束后不同组别的羔羊血液抗氧化能力指标

由表6和表7实验结果可知，基础日粮中添加植物乳杆菌发酵保存后的刺梨果渣，羔羊血液中的IgG、IgM、IgA以及T-AOC、GSH-Px、SOD，指标显著高于对照组，表明本发明的植物乳杆菌发酵保存后的刺梨果渣有显著提高羔羊免疫以及改善羔羊抗氧化指标的作用，可以缓解羔羊的氧化应激。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。