一种杏仁抗氧化肽的制备方法

技术领域

本发明涉及抗氧化肽制备技术领域。具体地说是一种杏仁抗氧化肽的制备方法。

背景技术

机体衰老和大多数慢性疾病均与自由基引起的氧化应激有关，当机体抗氧化防御系统无法满足需求时，需补充外源抗氧化剂，尤其是食源性抗氧化多肽具有营养低毒，安全易得，生物利用率高、代谢产物稳定和功能专一等优点。杏仁作为我国传统的药食两用资源，其蛋白质含量丰富，但目前对杏仁的利用主要在于杏仁油和苦杏仁苷上，其蛋白质的利用价值并不高，因此以杏仁为原料，开发其中具有抗氧化功能的肽段是提高其蛋白质利用价值的重要途径之一。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种杏仁抗氧化肽的制备方法，以解决现有杏仁蛋白利用价值不高的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种杏仁抗氧化肽的制备方法，采用木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白；在酶反应体系中，底物为苦杏仁蛋白；酶解反应时的反应条件为：酶解温度为20～70℃，酶解时间为0.5～5h，木瓜蛋白酶的酶活为10000～80000U/g，底物浓度为10～45mg/mL，酶解pH为6～8。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶解反应时的反应条件为：酶解温度为40～70℃，酶解时间为3～5h，酶活为20000～80000U/g，底物浓度为35～45mg/mL，酶解pH为6.5～7.5。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶解温度为60℃。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶解时间为220min。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶活为20000U/g。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，底物浓度为40mg/mL。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶解pH为6.5。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，酶解温度为60℃，酶解时间为220min，酶活为20000U/g，底物浓度为40mg/mL，酶解pH为6.5。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，苦杏仁蛋白的提取方法为：

将脱脂苦杏仁粉过80目筛后，按照料液比1：20加入到饱和氯化钠溶液中，用1mol/L NaOH溶液调pH至9.0得到混合分散液；

将混合分散液置于超声频率为20kHz，超声功率200W，超声温度50℃的超声条件下超声30min进行浸提，浸提结束后离心分离取上清液，即为蛋白粗提液；

将蛋白粗提液用1mol/L HCl调节至其pH为4.4.并按照体积比1:2加入饱和度为60％的(NH

将苦杏仁蛋白沉淀洗涤至其洗涤液呈中性后，按照料液比为1:10用蒸馏水复溶后，用0.05mol/L且pH7.0的磷酸缓冲液调节其pH为7.0，然后用相对分子截留量为3000～5000的透析袋进行透析处理，透析结束后，将透析袋内组分冷冻干燥即得到苦杏仁蛋白。

上述杏仁抗氧化肽的制备方法，脱脂苦杏仁的含油量小于或等于1.5wt％。

本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

本发明采用木瓜蛋白酶对苦杏仁蛋白进行水解，并通过控制酶解反应时酶解温度、酶解时间、酶解pH、底物浓度及酶活，来控制苦杏仁蛋白水解，使得苦杏仁蛋白水解后能够生成抗氧化活性较好的苦杏仁蛋白肽段，该肽段可用抗氧化，从而有效提高苦杏仁蛋白的利用价值。

本发明以含油量小于或等于1.5wt％的脱脂杏仁为原料，采用碱溶酸沉法联合与等电点-盐析相结合的方法提取脱脂苦杏仁中的苦杏仁蛋白，能够获得品质好且纯度高的杏仁蛋白，该苦杏仁蛋白经木瓜蛋白酶在特定水解条件下水解后能够获得抗氧化活性较高的苦杏仁抗氧化肽。

附图说明

图1本发明实施例温度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响曲线图；

图2本发明实施例时间对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响曲线图；

图3本发明实施例酶活对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响曲线图；

图4本发明实施例底物浓度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白影响曲线图；

图5本发明实施例pH对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响曲线图；

图6a本发明实施例酶解温度和时间交互作用对ABTS

图6b本发明实施例酶解温度和时间交互作用对ABTS

图7a本发明实施例酶解温度和酶活交互作用对ABTS

图7b本发明实施例酶解温度和酶活交互作用对ABTS

图8a本发明实施例酶解温度和pH交互作用对ABTS

图8b本发明实施例酶解温度和pH交互作用对ABTS

图9a本发明实施例酶解时间和pH交互作用对ABTS

图9b本发明实施例酶解时间和pH交互作用对ABTS

图10a本发明实施例酶活和底物浓度交互作用对ABTS

图10b本发明实施例酶活和底物浓度交互作用对ABTS

图11a本发明实施例酶活和pH交互作用对ABTS

图11b本发明实施例酶活和pH交互作用对ABTS

具体实施方式

1、用木瓜蛋白酶水解苦杏仁蛋白

本实施例所使用的苦杏仁蛋白为实验室自制，采用碱溶酸沉法联合与等电点-盐析相结合的方法提取脱脂苦杏仁中的苦杏仁蛋白，具体方法为：

将脱脂苦杏仁粉过80目筛后，按照料液比1：20加入到饱和氯化钠溶液中，用1mol/L NaOH溶液调pH至9.0得到混合分散液；

将混合分散液置于超声频率为20kHz，超声功率200W，超声温度50℃的超声条件下超声30min进行浸提，浸提结束后离心分离取上清液，即为蛋白粗提液；离心用低温高速离心机的转速为5000rpm，离心时间为20min；

将蛋白粗提液用1mol/L HCl调节至其pH为4.4.并按照体积比1:2加入饱和度为60％的(NH

将苦杏仁蛋白沉淀洗涤至其洗涤液呈中性后，按照料液比为1:10用蒸馏水复溶后，用0.05mol/L且pH7.0的磷酸缓冲液调节其pH为7.0，然后用相对分子截留量为3000～5000的透析袋进行透析处理，透析结束后，将透析袋内组分冷冻干燥即得到苦杏仁蛋白；

1.1木瓜蛋白酶的单因素试验

单因素试验时，将苦杏仁蛋白置于木瓜蛋白酶反应液中进行酶解反应的反应条件如下：酶解温度为50℃，酶解时间为4h，木瓜蛋白酶的酶活(U)为20000U/g，底物浓度为30mg/mL；酶解反应的pH为7.0。

1.1.1温度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

由图1和表1可知，在60℃的水浴锅中酶解苦杏仁蛋白的清除率最高，为45.42％±0.54，其中20℃-60℃酶解苦杏仁蛋白的清除率随温度升高而升高，温度超过60℃后，自由基清除率降低。与温度升高让蛋白质分子、酶分子空间结构出现伸展所致，碰撞机率也将大幅增加，酶促反应也进一步加快，高温是引起蛋白酶热变性的主要原因，让生物活性降低及丧失。实验最佳酶解温度是55-60℃。

表1温度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

1.1.2酶解时间对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

由表2和图2可知，随着酶解时间的增加其清除率越高，实际酶解时产生活性肽序列处于持续变化状态，是引起各个时期抗氧化活性肽含量不同的主要原因，而2h-4h抑制率快速增加，在4h时，清除率为41.31％±0.88，而4h-5h只有极小的增长，因前期酶和底物结构充分出现水解反应，水解至4小时之后，反应就会处于饱和，短肽水解将会暂停，为节约资源，所以最佳时间为4h-5h。

表2酶解时间对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

1.1.3酶活力对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

由表3和图3看出酶活力越大抗氧化活性的清除率越好，其原因可能是酶活力越大和苦杏仁蛋白的接触越充分，酶促反应速率越高。

表3

1.1.4底物浓度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

通过表4和图4看出底物浓度5mg/mL-35mg/mL的清除率逐渐升高，而35mg/mL-45mg/mL时，升高的速度逐渐变缓。因为在一定浓度范围内，底物浓度的增长能够增大杏仁蛋白分子与木瓜蛋白酶碰撞机率，使杏仁蛋白被迅速酶解成小分子短肽或者游离氨基酸，然而酶量添加到相应程度，作用底物处于饱和状态，过量蛋白酶分子对中间产物向反应终产物转化起到相应的抑制作用，抗氧化活性肽类将逐步减少，出现过量蛋白酶生成短肽水解成氨基酸，让抗氧化活性大幅下降。底物浓度应在35mg/mL-45mg/mL之间。

表4底物浓度对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

1.1.5pH对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

从表5和图5可看出pH为7.0时木瓜蛋白酶对苦杏仁蛋白酶解最佳，清除率为47.28％±0.43，而pH大于7以后，清除率下降明显。这是因为每一种蛋白酶都有其最适的pH范围，pH不仅能够影响酶与底物蛋白的结合与催化，还能够影响反应体系中蛋白酶和底物的解离状态。因此，pH 7.0为木瓜蛋白酶的最适pH，消除率最高。

表5pH对木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白的影响

1.2响应面优化酶解工艺

1.2.1响应面实验设计

根据单因素实验结果，设计A-酶解温度、B-酶解时间、C-酶活、D-底物浓度和E-酶解pH等5个因素，每个因素3个水平的响应面优化实验设计表如表6所示。

表6 5因素3水平响应曲面分析实验设计表

1.2.2响应面设计及结果

响应面优化法的实验设计及ABTS

表7响应曲面优化ABTS

利用Design expert 10.0数据分析软件完成试验数据多元回归拟合分析，设酶解温度、酶解时间、酶活、底物浓度、酶解pH分别为A、B、C、D、E，ABTS

Y

完成模型与回归系数回归分析(表8)，此回归模型P＜0.0001(极显著)，失拟项P＝0.2832＞0.05(不显著)，由此能够看出模型拟合程度效果较为理想，能够很好的预测回归方程；此模型能够解释的数据达94.31％，由此能够看出模型实际值和预测值差异较小，方程具有较好的可靠性。

对相关数据资料展开分析后可知，一次项酶解温度、酶解时间、酶活、底物浓度、酶解pH对ABTS

表8 ABTS

1.2.3各因素交互作用

进一步结合回归方程可知，考察响应面曲面图与等高线图形状，酶解时间、分析酶解温度、酶活与底物浓度、酶解pH对ABTS

酶解温度和酶解时间的交互作用对ABTS

酶解温度和酶活的交互作用对ABTS

酶解温度和酶解pH的交互作用对ABTS

酶解pH和酶解时间的交互作用对ABTS

底物浓度和酶活的交互作用对ABTS

酶活和酶解pH的交互作用对ABTS

1.2.4验证实验结果

进一步结合回归方程模型可知预测最佳条件：酶解温度62.633℃、酶解时间为3.711h、酶活为22804.106U、底物浓度为41.567mg/mL，酶解pH为6.532，将该条件修正为酶解温度为60℃、酶解时间为220min、酶活为20000U、底物浓度为40mg/mL，酶解pH为6.5，在此最优条件下经3次平行试验实际ABTS

2、分离纯化及抗氧化活性

响应面最优条件下，利用木瓜蛋白酶对苦杏仁蛋白进行水解得到的杏仁抗氧化肽依次经经过截留分子量为3KDa超滤膜处理后得到分子量＜3KDa组分和分子量≥3Kda组分；通过测定两个组分的ABTS