一种评估胆管癌预后的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种评估胆管癌预后的生物标志物及其应用。

背景技术

胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一种恶性程度极高的上皮细胞恶性肿瘤，可以发生在胆道或肝内的任何部位，根据原发性解剖亚型可分为肝内CCA(iCCA)、肝门部CCA(pCCA)和远端CCA(dCCA)；而根据其分化特征，CCA既可以起源于胆管内壁的上皮细胞，也可以从肝细胞或胆管周围腺体发展而来，这些在很大程度上导致CCA异质性明显。在过去几十年中，胆管癌的发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势，而且由于胆管癌发病隐匿，早期诊断困难，在被诊断时通常已是晚期，并出现了广泛的侵袭和转移，虽然对于胆管癌的诊断和治疗方法不断更新，但患者预后在过去十几年中并未显著改善，5年生存率仅为7％-20％，其总体疗效极差。因此，临床上亟待探索出相关生物标记物，这对于提高胆管癌的总体疗效将具有重大的临床意义。

从组织病理学上来看CCA的典型特征是细胞和基质构成了其大部，而且基质的起源可以在胆管修复过程中的再生微环境中找到证据，因此肿瘤微环境在胆管癌中的重要性是不容低估的。CCA的基质由肿瘤相关的内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-Associated Fibroblasts,CAF)和一系列复杂的炎症细胞组成，同时还包括广泛的细胞外基质(ECM)蛋白网络。TME可以通过新合成的基质细胞蛋白(包括细胞粘合素C、骨桥蛋白等)的沉积，以及由CAF、肿瘤相关巨噬细胞和CCA细胞大量释放的基质金属蛋白酶的强烈降解而持续重塑，TME内的细胞相互作用正是受到这种重塑的影响，使不同细胞元件之间的相互通信和旁分泌因子的交换成为可能。同时由于这些重塑的变化，TME增强了CCA细胞的侵袭转移等过程。这些研究表明TME中的成分可以直接或间接与CCA上皮相互作用，其中CAF及其分泌蛋白的作用极为重要。

CAF是一类具有间充质起源的纺锤形细胞的异质性群体，其占据TME细胞库的很大一部分，能与肿瘤细胞(特别是侵袭性肿瘤)发生动态串扰。CAF主要是通过旁分泌可溶性因子的信号传导来支持肿瘤进展和表型转换，其与细胞之间的这种信息交流促进细胞可塑性和肿瘤转移、肿瘤细胞干性的维持、重编程和细胞外基质的重塑等。众多研究表明在胆管癌中CAF的丰度与CCA肿瘤生长和低生存率呈明显的正相关。CAF可以由不同来源的纤维细胞通过转分化和活化而来，这种活化过程会导致代谢的重编程，从而改变CCA的增殖、运动以及细胞外基质蛋白等组分的分泌，其分泌的信号分子已被证实可以通过增强增殖、存活、趋化性和血管生成来促进CCA的进展。此外，CAF还被证明可以通过短程或直接以细胞-细胞形态发生信号转导(如NOTCH3和Hedgehog通路)的形式来促进CCA的进展。在胆管癌中CAF还可以通过分泌免疫调节因子来支持M2巨噬细胞和减少NK细胞活化来调节先天免疫，也可以通过分泌蛋白来促进调节性T细胞和辅助性T细胞的活化，并使树突状细胞和细胞毒性T细胞失活。在体外实验中研究者还发现CAF可以分泌VEGF-A和VEGF-C使得在易受CCA细胞内渗影响的血管结构中募集和组装淋巴内皮细胞。更为重要的是，有研究在CCA大鼠模型中已经证实选择性靶向促进肿瘤微环境中CAF的凋亡可以明显提高宿主的生存率。这些研究充分说明阐明CAF分泌蛋白-胆管癌相互作用网络中的关键途径可以为胆管癌的预后评估和治疗干预提供新的思路和方法。有研究表明CST1(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN，Cystatin SN)可以由CAF分泌至肿瘤微环境中发挥其生物学作用。CST1是由CST1基因所编码的分泌肽，其中由5个氨基酸残基组成的胱抑素结构域可以与半胱氨酸蛋白酶的活性位点结合，从而抑制半胱氨酸蛋白酶的水解活性，其广泛分布在人体体液和组织中，在人体多种肿瘤的发生发展、药物耐药中起着关键性的调控作用。目前还暂未出现将CST1作为评估胆管癌预后的生物标志物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种评估胆管癌预后的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现胆汁中的CST1可以作为评估胆管癌预后的生物标志物，本发明为评估胆管癌预后提供了新的标志物，这对于胆管癌患者预后的判断和个体化治疗的选择具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种评估胆管癌预后的生物标志物，所述生物标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。

进一步地，所述生物标志物在胆管癌患者胆汁中的浓度升高，则预示所述胆管癌患者预后差。

本发明还提供检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN在胆汁中浓度的试剂在制备评估胆管癌预后的产品中的应用。

进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。

本发明还提供一种评估胆管癌预后的产品，包括检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN在胆汁中浓度的试剂。

进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。

进一步地，所述产品通过酶联免疫吸附法检测所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN在胆汁中的浓度。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过检测胆管癌患者胆汁中CST1的浓度来评估胆管癌患者的预后，结果显示，胆汁中CST1的浓度越高，患者的总体生存率越低。因此，本发明研究发现胆汁中的CST1可以作为评估胆管癌预后的生物标志物，本发明为评估胆管癌预后提供了新的标志物，这对于胆管癌患者预后的判断和个体化治疗的选择具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为胆管癌患者肿瘤组织(CCA)样品和癌旁组织(Non-CCA)样本的单细胞测序降维和聚类分析结果；其中红色代表CST1，框线内代表CAF细胞群；

图2为胆管癌(CCA)和非癌患者(Non-CCA)胆汁中CST1的表达差异图；

图3为CST1高表达组(High-CST1)和CST1低表达组(Low-CST1)患者的生存分析结果；

图4为CST1预测胆管癌患者预后的受试者工作特征曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

(1)通过对胆管癌患者肿瘤组织样品和非癌组织样本进行单细胞转录组测序数据对比分析，发现胆管癌中的CST1水平相对较高，追踪其细胞来源，发现其主要是来源于CAF细胞，结果见图1。

(2)临床收集胆管癌及胆石症的胆汁各30例，使用Human Cystatin SN ELISA Kit(SIGMA,RAB1036)检测其CST1浓度，分析其差异性，结果见图2。结果显示，胆管癌患者胆汁的CST1浓度显著高于非癌患者胆汁。

检测CST1浓度的具体操作步骤如下：

从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，孔中加标准品和标本稀释液，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育90分钟；提前20分钟准备生物素化抗体工作液，洗板5次，空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μL/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵育60分钟；提前20分钟准备酶结合物工作液，避光室温放置，洗板5次，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μL/孔)，用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟，洗板5次；加入显色底物(TMB)100μL/孔，避光36℃孵育15分钟；加入终止液100μL/孔，混匀后立即用酶标仪检测OD值，计算每个标准品的平均净OD(平均净OD＝平均测定OD-平均NSB OD)。

(3)将胆管癌患者胆汁中CST1浓度依据中位值分为CST1高表达组(High-CST1)和CST1低表达组(Low-CST1)，即当CST1浓度≥5ng/mL时，定义为CST1高表达组；当CST1浓度＜5ng/mL时，定义为CST1低表达组。分析胆汁中CST1水平与患者总生存期(Overallsurvival，OS)之间的关系(所有患者都经过了手术治疗)，结果见图3。结果显示，胆汁中CST1水平越高，患者的总生存期越短；CST1低表达组患者的总生存期明显长于CST1高表达组患者。

(4)CST1对胆管癌患者预后的预测价值：

CST1对胆管癌患者预后的预测价值以预后受试者工作特征曲线体现，结果见图4，其中AUC＝0.903。结果显示，CST1对胆管癌的预后具有较高的预测价值。

具体地，利用上述方法进行胆管癌预后评估的方法为：

S1：提取胆管癌患者胆汁，进行样品实验前处理(利用磷酸盐缓冲液按一定比例进行稀释)；

S2：检测胆汁中CST1的浓度；

S3：根据胆汁中CST1的浓度评估胆管癌患者的预后情况。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。