用于使高密度脂蛋白的冠状病毒杀伤活性最大化的方法以及用于预防或治疗COVID-19的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于使高密度脂蛋白的冠状病毒杀伤活性最大化的方法以及用于预防或治疗COVID-19的药物组合物。

背景技术

截至2020年3月，COVID-19已传播到约114个国家。因此，世界卫生组织(WHO)宣布COVID-19进入全球大流行的状态。此后，截至2020年9月，全球已出现约3500万感染患者，其中约100万死亡，并且感染患者数和死亡人数持续增加。

COVID-19表现出诸如干咳、咳痰、呼吸困难等呼吸道症状并伴有发热，并可引起诸如急性呼吸困难综合征、心力衰竭和心律失常等并发症。在这种情况下，通过氧气疗法以及服用抗病毒药和抗生素进行保守治疗，但存在的问题是，由于其不能治愈冠状病毒，因此并未呈现足够的效果。

COVID-19主要通过咳嗽或打喷嚏引起的飞沫传播而感染，并且基本繁殖数(一名感染者在传染期内感染的平均人数)为2至2.5，已知其比流感更具传染性。此外，就COVID-19而言，即使是无症状感染者也能传播病毒，因此很难有效阻断病毒。

同时，冠状病毒(CoV)在系统发育上是指属于冠状病毒科的病毒，且正冠状病毒科亚组分为四个属：α-CoV、β-CoV、δ-CoV和γ-CoV。其中只有α-CoV和β-CoV感染哺乳动物，而δ-CoV和γ-CoV感染鸟类和某些哺乳动物。

到目前为止，可感染人类的冠状病毒(HCoV)有七种类型：α-CoV的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-CoV的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV，以及SARS-CoV-2(2019冠状病毒病(COVID-19)的病原体)。HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1引起人类普通感冒或胃肠道疾病，但SARS-CoV-2以及SARS-CoV和MERS-CoV引起严重的急性呼吸道传染病。

SARS-CoV-2在系统发育树中与SARS-CoV和MERS-CoV一起属于β-CoV，但它在分子系统发育方面与SARS-CoV明显不同，并且在很久以前就从MERS-CoV进化而来，约一半的核苷酸序列具有相似性，如在使用最大似然法的SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的进化分析(SARS-CoV、MERS-CoV-2和SARS-CoV-2的进化分析，最大似然法)中所示。

此外，SARS-CoV-2与SARS-CoV在结构和致病性上有一些相似之处，但在蛋白质结构上存在明显的结构差异，即刺突蛋白(S)，其应被认为是对于疫苗研发最重要的。SARS-CoV-2中弗林蛋白酶样切割位点(SLLR-ST)的存在促进了S蛋白的启动，从而进一步增加了SARS-CoV-2的传染性，此相较于SARS-CoV而言(非专利参考文献1，《SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的比较概述》，《医学感染》(Le Infezioni in Medicina)，2020年第2期第174-184页)。

更具体而言，在病毒排出过程中，MERS-CoV的S蛋白在RSVR↓SV处的切割由弗林蛋白酶介导，而SARS-CoV的S蛋白并未完全切割，因为SARS-CoV缺少弗林蛋白酶样切割位点(SLLR-ST)。在MERS-CoV中，S蛋白在保守序列AYT↓M处被靶细胞表达的蛋白酶(弹性蛋白酶、组织蛋白酶L或TMPRS)切割。另一方面，SARS-CoV-2的S蛋白在单个Arg↓切割位点1上游有12个额外的核苷酸，形成PRRAR↓SV序列，对应弗林蛋白酶样切割位点(SLLR-ST)。如上所述，SARS-CoV-2中弗林蛋白酶样切割位点(SLLR-ST)的存在促进了S蛋白的启动，此外，增强了SARS-CoV-2的传播性，此相较于SARS-CoV而言。也就是说，SARS-CoV-2与SARS-CoV之间存在明显的结构差异。

此外，SARS-CoV-2的RNA核苷酸序列与现有的SARS-CoV和MERS-CoV的RNA核苷酸序列有明显差异。例如，SARS-CoV-2的RNA核苷酸序列与现有SARS-CoV的RNA核苷酸序列相差17.7％。很明显，差异是如此显著，以至于现有的SARS-CoV治疗方法不能直接用于SARS-CoV-2的预防和治疗，而研制SARS-CoV-2的新疫苗绝对有必要。

另一方面，近期有报告称，COVID-19患者血液中的总胆固醇、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平普遍低于正常人，并且在HDL-胆固醇水平较低的患者中，COVID-19疾病的严重程度较高(王等人，《健康与疾病中的脂质》，2020年第19期第204页)。然而，另一份报告指出，当冠状病毒(SARS-Co-V-2)进入细胞时，它会与HDL胆固醇结合，并通过HDL受体SR-B-1进入细胞(《自然代谢》，2020年11月26日，https://www.nature.com/articles/s42255-020-00324-0)，因此，迄今为止，HDL在COVID-19感染中的功能和作用尚不清楚。此外，以上报告只是早期水平的基于血液各项指标观察COVID-19患者与正常人比较的报告，并且尚需以多种方式进行研究和开发，因为这些报告尚未揭示与COVID-19疾病有直接关系或随之作用。

在上述背景下，本发明人首先证实了通过超速离心从人血清中分离的天然HDL(高密度脂蛋白)对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤活性。此外，本发明人通过果糖处理从天然HDL生产糖化HDL，并检查了由于糖化引起的HDL结构和功能的变化，并且通过电子显微镜观察结果证实了天然HDL的结构和形状因糖化而改变，并且对氧磷酶的活性因糖化而受到抑制。本发明人还首次证实，由于HDL的糖化破坏了HDL的结构和功能，故对冠状病毒的杀伤能力也随之降低。因此，通过证实了基于本发明人公开的事实，可以提供包含HDL(高密度脂蛋白)作为活性成分的用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物、用于使HDL(高密度脂蛋白)的冠状病毒杀伤活性最大化的方法、以及用于开发用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物的筛选方法，本发明人已完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种对冠状病毒(SARS-Co-V-2)具有杀伤能力的用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物，一种用于使HDL(高密度脂蛋白)的冠状病毒杀伤活性最大化的方法，以及用于开发用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物的筛选方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物，其包含HDL(高密度脂蛋白)作为活性成分。

本发明还提供了一种用于使HDL(高密度脂蛋白)的冠状病毒杀伤活性最大化的方法，其使用了HDL(高密度脂蛋白)糖化抑制剂。

本发明还提供了一种HDL(高密度脂蛋白)糖化诱导模型，其是通过用选自由果糖、葡萄糖和半乳糖组成的组中的任何一种或两种或更多种糖化合物处理HDL(高密度脂蛋白)来制备。

本发明还提供了一种用于筛选用于预防或治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物的方法，其由以下步骤组成：

将HDL糖化诱导模型用作对照组，并将经候选药物处理的HDL糖化诱导模型用作实验组，通过比较糖化程度进行评价的步骤；以及

当与对照组相比，经候选药物处理的实验组的糖化程度较低时，判定所处理的候选药物对COVID-19有效的步骤。

此外，本发明提供了一种用于评价COVID-19的预后的信息提供方法，其由以下步骤组成：

将HDL糖化诱导模型用作对照组，并将从测试对象的血液样本中分离的HDL用作实验组，通过比较糖化程度进行评价的步骤；以及

当与对照组相比，从血液样本中分离的实验组HDL的糖化程度较低时，判定COVID-19的预后良好的步骤。

有益效果

据本发明人发现，未糖化的正常高密度脂蛋白(HDL)表现出优于糖化HDL的对冠状病毒(SARS-Cov-2)的杀伤活性，因此提供了包含未糖化的天然HDL作为活性成分的用于预防和治疗COVID-19的药物组合物。此外，本发明具备实用性，因为基于本发明人的发现，可以提供通过使用HDL糖化抑制剂使冠状病毒杀伤活性最大化的方法，并且可以提供通过评价候选药物的HDL糖基化抑制程度来筛选用于预防和治疗COVID-19的药物组合物的方法。

附图说明

图1是示出根据本发明的天然HDL和糖化HDL的电泳图谱的照片。

图2是示出天然HDL和糖化HDL的荧光分析结果的图。

图3是示出天然HDL和糖化HDL的结构的一组电子显微照片。

图4是示出天然HDL与糖化HDL的对氧磷酶活性比较的图。

图5A是示出正常巨噬细胞的照片，图5B是示出巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的照片，图5C是示出巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用受到天然HDL的共同处理抑制的照片，并且图5D是示出巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用受到糖化HDL的共同处理抑制的照片。

图6是将在正常对照细胞培养基、经乙酰化LDL处理的细胞培养基、经乙酰化LDL和天然HDL共同处理的细胞培养基以及经乙酰化LDL和糖化HDL共同处理的细胞培养基中检测到的氧化物质的量表示为MDA(丙二醛)的量的图。

图7是示出天然HDL和糖化HDL对非洲绿猴肾细胞活力的影响的图。

图8是示出根据本发明的天然HDL对比糖化HDL的冠状病毒杀伤作用的图。

具体实施方式

下文将详细描述本发明。

本发明提供了一种用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物，其包含HDL(高密度脂蛋白)作为活性成分。

所述HDL为未糖化的HDL并且具有杀伤冠状病毒(SARS-Co-V-2)的能力。所述HDL为未糖化的HDL，并且由于表现出HDL的正常功能而具有杀伤冠状病毒(SARS-Co-V-2)的能力，例如，借助HDL的对氧磷酶活性或阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性，所述HDL具有杀伤冠状病毒(SARS-Co-V-2)的能力。

本发明人比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的结构、功能和冠状病毒(SARS-Co-V-2)杀伤活性。结果是，证实了在HDL糖化诱导模型中HDL的正常结构和功能受损。具体而言，天然HDL表现出对冠状病毒(SARS-Co-V-2)优异的杀伤能力，由此证实，可以提供包含天然HDL作为活性成分的用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，通过超速离心从人血清中分离制备了天然HDL(高密度脂蛋白)，通过用果糖处理HDL制备HDL糖化诱导模型，并用电子显微镜分析天然HDL和HDL糖化诱导模型。结果是，证实了天然HDL具有直径为18-21nm的大粒度以及清晰的结构和轮廓，而糖化HDL由于果糖的糖化修饰和氧化应激而具有改变的颗粒结构，并且具有直径为13-16nm的小粒度以及模糊的结构和轮廓(参见图3)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的对氧磷酶活性。结果是，与天然HDL相比，糖化HDL表现出不到一半的对氧磷酶活性，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图4)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用(此为动脉粥样硬化的早期反应)的活性。结果是，与乙酰化LDL被单独处理时相比，天然HDL被共同处理时，对LDL的吞噬作用降低了60％以上，而与天然HDL被处理时相比，糖化HDL被共同处理时，吞噬作用增加了1.3倍，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图5)。

在本发明的一个实施方案中，通过硫代巴比妥酸反应定量法比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型在细胞培养基中产生的氧化物的量。结果是，当乙酰化LDL被处理时，检测到最高的MDA(丙二醛)，为3.8nM，而当天然HDL被共同处理时，检测到最低的MDA，为1.3nM，并且当糖化HDL被共同处理时，检测到MDA为2.8nM，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图6)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的细胞毒性。结果是，天然HDL表现出68-73％的细胞活力，而糖化HDL表现出40-49％的细胞活力，证实了HDL的细胞毒性因糖化而增加(参见图7)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力。结果是，天然HDL表现出62％的杀伤能力，而糖化HDL表现出17％的杀伤能力，证实了HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力因糖化而受损。此外，证实了天然HDL表现出的对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力是糖化HDL的3.6倍(参见图8)。

因此，未糖化的天然HDL(高密度脂蛋白)没有表现出HDL的结构和功能受损，而是表现出对冠状病毒(SARS-Co-V-2)优异的杀伤能力，由此可以提供包含天然HDL作为活性成分的用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物。

本发明还提供了一种用于使HDL(高密度脂蛋白)的冠状病毒杀伤活性最大化的方法，其使用了HDL(高密度脂蛋白)糖化抑制剂。

HDL糖化抑制剂通过抑制HDL的糖化，可以阻止由于HDL的结构和功能损伤而导致的HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力降低，并且通过抑制HDL的糖化，也可以使HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力最大化。

本发明还提供了一种HDL(高密度脂蛋白)糖化诱导模型，其是通过用选自由果糖、葡萄糖和半乳糖组成的组中的任何一种或两种或更多种糖化合物处理HDL(高密度脂蛋白)来制备。

可以以某一浓度或更高浓度的糖化合物进行处理以最大程度地饱和HDL糖化。此外，糖化合物处理可优选为果糖处理。

在本发明的一个实施方案中，通过超速离心从人血清中分离出HDL，并且通过用过量的果糖(5mM-250mM/1-10mg/ml HDL)处理经分离的HDL 72小时来制备HDL糖化诱导模型。经电泳证实，产生了HDL糖化诱导模型，并在糖化HDL中观察到分子量增加的apoA-I，并且证实了产生多聚化HDL，诸如二聚体至四聚体(参见图1)。此外，通过证实与天然HDL相比，HDL糖化诱导模型的荧光强度增加了7倍，证实成功产生了HDL糖化诱导模型(参见图2)。

本发明还提供了一种用于筛选用于预防或治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物的方法，其由以下步骤组成：

将HDL糖化诱导模型用作对照组，并将经候选药物处理的HDL糖化诱导模型用作实验组，通过比较糖化程度进行评价的步骤；以及

当与对照组相比，经候选药物处理的实验组的糖化程度较低时，判定所处理的候选药物对COVID-19有效的步骤。

通过比较糖化程度进行评价的步骤可以是通过检测和量化因糖化引起的荧光信号来比较并评价糖化程度。

在本发明的一个实施方案中，通过证实与天然HDL相比，HDL糖化诱导模型的荧光强度增加了7倍，定量测量并评价了与天然HDL相比HDL糖化诱导模型的糖化程度(参见图2)。

依据用候选药物治疗的实验组的糖化程度低于对照组时候选药物对COVID-19有效的判断，抑制天然HDL糖化的药物可视为阻止HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力受损的药物。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力。结果是，天然HDL表现出62％的杀伤能力，而糖化HDL表现出17％的杀伤能力，证实了HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力因糖化而受损。

因此，阻止因糖化令HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力受损并使杀伤能力最大化的HDL糖化抑制剂可被筛选作为用于预防或治疗2019冠状病毒感染(COVID-19)的有效成分。

通过比较HDL的糖化程度进行评价的步骤还可包括比较并评价HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性中的至少一种活性的步骤。

如果与HDL糖化诱导模型对照组相比，经候选药物处理的实验组的HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性中的至少一者较高，则可判定所处理的候选药物对2019冠状病毒感染(COVID-19)有效。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的对氧磷酶活性。结果是，糖化HDL表现出不到天然HDL一半的对氧磷酶活性，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图4)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性。结果是，与乙酰化LDL被单独处理时相比，天然HDL被共同处理时，对LDL的吞噬作用降低了60％以上，而与天然HDL被处理时相比，糖化HDL被共同处理时，吞噬作用增加了1.3倍，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图5)。

因此，阻止HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止由于糖化导致的巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性受损并使HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力最大化的HDL糖化抑制剂可被筛选作为用于预防或治疗2019冠状病毒感染(COVID-19)的有效成分。

此外，本发明提供了一种用于评价COVID-19的预后的信息提供方法，其由以下步骤组成：

将HDL糖化诱导模型用作对照组，并将从测试对象的血液样本中分离的HDL用作实验组，通过比较糖化程度进行评价的步骤；以及

当与对照组相比，从血液样本中分离的实验组HDL的糖化程度较低时，判定COVID-19的预后良好的步骤。

通过比较糖化程度进行评价的步骤可以是通过检测和量化因糖化引起的荧光信号来比较并评价糖化程度。

在本发明的一个实施方案中，通过证实与天然HDL相比，HDL糖化诱导模型的荧光强度增加了7倍，定量测量并评价了与天然HDL相比HDL糖化诱导模型的糖化程度(参见图2)。

当从血液样本中分离的实验组HDL的糖化程度低于HDL糖化诱导模型对照组时，判断COVID-19的预后良好。此基于以下判断：不存在由于糖化导致的HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力受损，并且天然HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力得以维持。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力。结果是，天然HDL表现出62％的杀伤能力，而糖化HDL表现出17％的杀伤能力，证实了HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力因糖化而受损。

因此，通过证实与对照组相比，HDL的糖化不存在或较少，可证实由于糖化导致的HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力受损不存在或较少，因此可以判断COVID-19的预后良好。

通过比较HDL的糖化程度进行评价的步骤还可包括比较并评价HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性中的至少一种活性的步骤。

如果与HDL糖化诱导模型对照组相比，从血液样本中分离的实验组HDL的HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性中的至少一者较高，则判定COVID-19的预后良好。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的对氧磷酶活性。结果是，糖化HDL表现出不到天然HDL一半的对氧磷酶活性，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图4)。

在本发明的一个实施方案中，比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性。结果是，与乙酰化LDL被单独处理时相比，天然HDL被共同处理时，对LDL的吞噬作用降低了60％以上，而与天然HDL被处理时相比，糖化HDL被共同处理时，吞噬作用增加了1.3倍，证实了HDL的功能因糖化而受损(参见图5)。

因此，通过证实与对照组相比，HDL的对氧磷酶活性和HDL阻止巨噬细胞对乙酰化LDL的吞噬作用的活性受损不存在或较少，可证实由于糖化导致的HDL对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力受损不存在或较少，因此可以判断COVID-19的预后良好。

在下文中，通过以下实施例和实验实施例对本发明进行了详细说明。

然而，以下实施例和实验实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的内容。

实施例1：天然HDL的制备

根据本发明人之前的论文(赵京炫、申东谷、白硕焕和金在龙的《与稳定性心绞痛患者相比，心肌梗死患者表现出脂蛋白特性和功能的改变》，《实验与分子医学》，2009年第41期第67-76页，数字对象唯一标识符：10.3858/emm.2009.41.2.009.)提出的方法，通过超速离心(100,000g)48-72小时从人血浆中分离出天然HDL。

实施例2：HDL糖化诱导模型的制备

通过用过量的果糖处理一些在实施例1中制备的源自人血清的HDL来制备HDL糖化诱导模型。

具体而言，使经纯化的HDL(1-10mg/mL)与5mM至250mM D-果糖[于200mM磷酸钾/0.02％叠氮化钠缓冲液(pH 7.4)中]在37℃下在含有5％CO

在糖化反应后，通过12％SDS-PAGE来比较并证实了HDL，其中根据蛋白质的分子量进行电泳分离。结果是，如图1所示，在糖化HDL中，观察到分子量增加的apoA-I，并证实存在一些多聚化HDL，诸如二聚体和四聚体。

另一方面，通过测量所产生的荧光物质在370nm(激发)和440nm(发射)处的荧光强度来确定HDL糖化诱导模型的糖化程度，且结果示于图2中。

如图2所示，经过72小时的果糖处理，HDL糖化诱导模型的荧光强度较天然HDL提高了约7倍，证实成功构建了HDL糖化诱导模型。

实验实施例1：由于糖化引起的HDL的结构变化评价

通过分析天然HDL与HDL糖化诱导模型之间的结构差异来评价由于糖化引起的HDL的结构变化。

具体而言，将天然HDL和HDL糖化诱导模型的蛋白质浓度调整至0.3mg/mL，用1％磷钨酸钠染色，并且使用透射电子显微镜(Hitachi HT-7800，40,000X)在80kV高电压下观察，且照片示于图3中。

如图3所示，证实了天然HDL具有直径为18-21nm的大粒度以及清晰的结构和轮廓，而糖化HDL具有直径为13-16nm的小粒度以及模糊的结构和轮廓。这些结果表明，由于果糖处理导致的糖化修饰和氧化应激引起apoA-I的切割和聚集，并改变了HDL的颗粒结构。

实验实施例2：由于糖化引起的HDL的功能变化评价

通过分析实施例1中制备的天然HDL与实施例2中制备的HDL糖化诱导模型之间的功能差异，评价由于糖化引起的HDL的功能变化。

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通过分析天然HDL与HDL糖化诱导模型之间的对氧磷酶活性差异，评价由于糖化引起的HDL的功能变化。

对氧磷酶是一种负责HDL的抗氧化功能的主要酶，其活性测量如下。使用乙基对氧磷作为底物，分别与天然HDL和HDL糖化诱导模型反应，通过测量在酶溶液(90mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)/3.6mM NaCl/2mM CaCl

如图4所示，证实了与天然HDL相比，糖化HDL表现出不到一半的对氧磷酶活性，表明HDL功能受损是由于糖化导致的。

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通过分析天然HDL与HDL糖化诱导模型对阻止乙酰化LDL引起的巨噬细胞吞噬作用(动脉粥样硬化的早期反应)的活性的差异，评价由于糖化引起的HDL的功能变化。

人单核细胞系THP-1细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC#TIB-202

在培养时，用乙酰化LDL处理分化的巨噬细胞以诱导吞噬作用，并同时处理天然HDL和糖化HDL以比较对巨噬细胞吞噬作用的阻止活性的程度。固定细胞后，通过油红O染色来比较吞噬作用的程度，且结果示于图5中。

如图5所示，证实了与乙酰化LDL被单独处理时相比，天然HDL被共同处理时，对LDL的吞噬作用降低了60％以上，而与天然HDL被处理时相比，糖化HDL被共同处理时，吞噬作用增加了1.3倍。

另一方面，通过硫代巴比妥酸反应定量法比较了细胞培养基中产生的氧化物的量。结果是，如图6所示，当乙酰化LDL被单独处理时，检测到最高的MDA(丙二醛)，为3.8nM，而当天然HDL被共同处理时，检测到最低的MDA，为1.3nM，并且当糖化HDL被共同处理时，检测到MDA为2.8nM。

如以上结果所示，发现糖化HDL阻止对乙酰化LDL的吞噬作用(此为动脉粥样硬化的早期反应)的活性显著降低，证实了HDL的功能因糖化而受损。

实验实施例3：细胞毒性的比较评价

通过评价天然HDL和HDL糖化诱导模型的细胞毒性，评价了糖化对HDL细胞毒性的影响。

具体而言，通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基溴化四唑)测量法比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型的细胞毒性。将非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1586)以5×10

细胞活力(％)＝测试OD/对照OD×100％

如图7所示，天然HDL表现出68-73％的细胞活力，而糖化HDL表现出40-49％的细胞活力，证实了HDL的细胞毒性因糖化而增加。

实验实施例4：冠状病毒杀伤活性评价

比较并评价了天然HDL和HDL糖化诱导模型对冠状病毒(SARS-Co-V-2)的杀伤能力。

将非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1586)以5×10

病毒抑制率(％)＝(测试OD-病毒OD)/(对照OD-病毒OD)×100％

结果是，当以60μg/mL处理时，天然HDL表现出62％的SARS CoV-2杀伤能力，而糖化HDL在相同条件下表现出17％的SARS CoV-2杀伤能力。这些结果表明，天然HDL对SARS CoV-2的杀伤能力是糖化HDL的3.6倍。

如图7和图8所示，当用天然HDL处理时，细胞毒性低，CC

根据以上结果，证实了可以提供未糖化的天然高密度脂蛋白(HDL)作为用于预防和治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的药物组合物。此外，据本发明人发现，这可以用来解释为什么与正常人相比，糖尿病和高血压患者(这些患者要担心HDL结构和功能受损)患COVID-19的风险和病死率更高。这可用于提供关于COVID-19预后的信息的方法，并且也可用作用于筛选用于预防或治疗COVID-19的药物组合物的方法。

工业适用性

据本发明人发现，未糖化的正常高密度脂蛋白(HDL)表现出优于糖化HDL的对冠状病毒(SARS-Cov-2)的杀伤活性，因此提供了包含未糖化的天然HDL作为活性成分的用于预防和治疗COVID-19的药物组合物。此外，本发明具备实用性，因为基于本发明人的发现，可以提供通过使用HDL糖化抑制剂使冠状病毒杀伤活性最大化的方法，并且可以提供通过评价候选药物的HDL糖基化抑制程度来筛选用于预防和治疗COVID-19的药物组合物的方法。