一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一种无法治愈的慢性间歇性炎症性疾病。在复发期间，症状从轻微到严重不等，并可能在缓解期间消失或减轻。临床表现为溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s Disease，CD)。UC的病理特征主要是从直肠向近端不同程度延伸的弥漫性粘膜炎症，主要涉及结肠黏膜浅表，CD则涉及整个胃肠道，会影响从口腔到肛门的胃肠道中的任何部位，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周，与UC相反，CD的疾病过程是透壁的，有穿透性疾病，瘘管，溃疡，脓肿和狭窄形成的可能性。目前，IBD已发展成为一种流行率迅速上升的世界性疾病，亟待解决。

IBD的病因复杂且不明，与多种致病因素有关，主要包括遗传因素和环境因素，如IBD易感基因NOD2、肠道菌群失调、免疫反应失调、肠道屏障损伤等。直到最近，诱导临床反应和维持临床缓解一直是临床实践和临床试验的主要目标。由于IBD患者需要接受长期治疗，患者生活质量差，治疗费用高。因此，需要进一步研究IBD的病理过程，以探索新的治疗策略。在药物递送领域，由于口服和全身给药代谢迅速，脱靶副作用严重，迫切需要有效的载体来实现靶向给药，以提高生物利用度，减少全身副作用。

现有技术中，IBD的治疗大多侧重于抑制过度的免疫反应以减少炎症。有关键研究表明，肠道屏障损伤先于IBD，其中屏障功能障碍促进肠管内容物进入，触发先天和适应性免疫细胞的激活。在疾病过程中，屏障功能持续被破坏，粘膜免疫系统失调，导致进行性组织损伤，最终导致临床IBD，这导致IBD被纳入“屏障器官疾病”的范畴。肠道上皮细胞及其紧密连接是构成肠道上皮屏障的关键组成部分，紧密连接主要有三个作用：(1)粘附，维持组织完整性；(2)形成屏障，控制离子、水、分子、细胞和病原体通过上皮层；(3)信号传导，接收和传输影响细胞行为和组织功能的信号；是肠道屏障中唯一具有选择性功能的动态屏障。屏障功能对维持肠道上皮稳态起关键作用，肠道屏障的破坏会导致肠道通透性增加，引起感染和炎症等病理性后果。

调控紧密连接蛋白恢复肠道上皮屏障功能有希望维持IBD的长期缓解和防止复发，是一种潜在的治疗手段。Claudins是紧密连接结构和功能的主要组成成分，IBD患者肠道屏障普遍受损，可以观察到紧密连接的失调，例如，在慢性结肠炎小鼠模型中观察到Claudin-1的表达降低，Claudin-2的表达增加。既往研究表明，PI3K/Akt信号通路参与了Claudin-1、Claudin-2等紧密连接蛋白的调控。

公开号为CN103315959A的中国专利文献公开了一种治疗炎症性肠病的口服结肠靶向制剂，该发明以5-氨基水杨酸为模型药物，以pH敏感型Eudragit S100为包衣材料，制成Eudragit S100包裹5-氨基水杨酸的纳米颗粒，其粒径为70～400nm，制得的纳米颗粒可以保护1，5-氨基水杨酸药物免受胃肠道消化液的破坏，直至到达pH＞7的结肠区域；公开号为CN108014093A的中国专利文献公开了一种用于治疗炎症性肠病的纳米制剂，由玉米蛋白纳米颗粒以及包覆在玉米蛋白纳米颗粒外的大肠杆菌外膜囊泡组成；玉米蛋白纳米颗粒内包裹有抗菌药物，抗菌药物为抗菌肽，该发明通过细菌外膜囊泡能够快速成功定值于宿主细胞，并将细菌外膜囊泡内包覆的粘附性生物高分子和抗菌组分一起释放出来，修复黏液层，抑制致病菌的生长，重建肠道微生态系统平衡。但是上述现有技术通过抗炎或抗菌的方式治疗炎症性肠病，但是没有修复破损的肠道屏障，导致肠腔内容物不断进入，粘膜免疫系统持续紊乱，病症无法得到根本改善。

因此，有必要开发一种能够促进肠道屏障修复、减轻炎症反应、对炎症性肠病治疗效果好的药物制剂。

发明内容

本发明提供了一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒，该脂质纳米粒利用活性氧响应性脂质材料和肠溶型包衣材料包载抗炎药或肠道屏障调控剂，具有活性氧响应性释药和结肠缓释的性能，能够促进肠道屏障修复、减轻炎症反应等。

具体采用的技术方案如下：

一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒，包括功能性药物、脂质材料和肠溶型包衣材料；所述的功能性药物为抗炎药物或肠道屏障调控剂，所述的抗炎药物包括醋酸地塞米松、5-氨基水杨酸盐或柳氮磺胺吡啶，所述的肠道屏障调控剂为PI3K抑制剂；所述的脂质材料为缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯，由α-生育酚、含缩硫酮键的双羧基交联单体和单甘酯反应得到；

所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒的载药量为4wt％～20wt％，肠溶型包衣材料增重为脂质材料的10wt％～100wt％。

本发明的活性氧响应性释药的脂质纳米粒中，缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯具有活性氧响应性，肠溶型包衣材料具有结肠定位释药功能，能够更好地应对炎症等病理环境中活性氧水平的变化，实现药物在结肠炎症部位的靶向治疗，提高药物疗效并减少副作用。

优选的，所述的肠溶型包衣材料为聚甲基丙烯酸酯。聚甲基丙烯酸酯是一种广泛用于口服制剂的肠溶包衣，可以保护脂质纳米粒免受胃酸的伤害，具有结肠定位释药功能，能够实现药物在结肠炎症部位的靶向治疗。

进一步优选的，所述的肠溶型包衣材料为Eudragit L100，Eudragit L100是一种阴离子聚合物，能够使脂质纳米粒表面呈现负电位，研究表明，炎症结肠中存在大量的正电荷蛋白，正负电荷的吸附提高了脂质纳米粒在靶部位的粘附性和停留时间，增强了载体的结肠靶向能力，从而增加了病灶部位局部药物浓度。

所述的PI3K抑制剂包括PI3K抑制剂LY294002、槲皮素、布帕尼西或阿培利司。

所述的单甘酯包括但不限于单硬脂酸甘油酯、甘油单油酸酯或单醋酸甘油酯等。

优选的，所述的缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯的制备方法为：

S01.丙酮和3-巯基丙酸在催化剂的作用下反应得到混合液，混合液经冰水浴析出产物，洗涤、干燥后得到含缩硫酮键的双羧基交联单体；

S02.利用活化剂活化含缩硫酮键的双羧基交联单体一端的羧基，加入α-生育酚，在催化剂的作用下发生第一步酯化反应，再加入活化剂活化含缩硫酮键的双羧基交联单体另一端的羧基，加入单甘酯，在催化剂作用下进行第二步酯化反应，反应结束后，冰水浴析出产物，离心得到沉淀，沉淀洗涤、提纯、冷冻干燥后得到所述的缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯。

进一步优选的，步骤S01中，所述的催化剂为三氟乙酸，反应条件为室温，8～24h。

进一步优选的，步骤S02中，所述的活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，所述的催化剂为4-二甲基氨基吡啶，含缩硫酮键的双羧基交联单体与两次活化剂的投料摩尔比为0.5～2：1:1。通过投料比的控制来保证先活化含缩硫酮键的双羧基交联单体一端的羧基，再活化另一端的羧基。

优选的，所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒的粒径为100～200nm，包封率≥90％。

本发明还提供了所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

S11.将所述的功能性药物和缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯溶解于有机溶剂中，得到有机相，所述的有机溶剂选用二甲亚砜、甲醇、乙醇或N,N-二甲基甲酰胺；

S12.将步骤S11的有机相在加热条件下注入到水相中，水浴搅拌，得到混合液；再将包衣液缓慢滴入混合液中，搅拌、离心后得到所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒；所述的包衣液为肠溶型包衣材料的有机溶液。

优选的，所述的功能性药物、缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯和肠溶型包衣材料的投料质量比为1：4-20：0.4-20。在此范围内所制备得到的产品脂质纳米粒载药量和包封率均良好。

本发明还提供了所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗炎症性肠病。

优选的，所述的药物包括两种所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒，一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒负载抗炎药物，一种活性氧响应性释药的脂质纳米粒负载肠道屏障调控剂。

实验证明，所述的活性氧响应性释药的脂质纳米粒具有活性氧响应性释药和结肠缓释的性能，当负载有抗炎药的该脂质纳米粒和负载有肠道屏障调控剂的该脂质纳米粒联合使用时，能够促进肠道屏障修复相关信号通路下调，紧密连接屏障蛋白表达水平上调，紧密连接通道蛋白下调，屏障功能恢复，减少结肠组织伤，修复肠道屏障，降低炎性因子的表达，抑制炎症，降低IBD复发生物标志物粪便钙卫蛋白的水平，促进肠道屏障修复、减轻炎症反应，有益于炎症性肠病的治疗。

进一步优选的，所述的药物的给药方式为口服用药。口服用药的患者依从性更高，且方便无创，更适合炎症性肠病等慢性疾病的治疗，

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明设计了具有活性氧响应性的口服脂质纳米给药系统，递送抗炎药或肠道屏障调控剂，能够针对性地应对炎症等病理环境中的活性氧水平变化释药，且具有结肠缓释的性能，能够提高药物疗效并减少副作用，促进肠道屏障修复，维持肠道上皮稳态，减轻炎症反应的同时阻止病程的进一步发展，提高治疗效果。

(2)当负载有抗炎药物的产品脂质纳米粒和负载有肠道屏障调控剂的产品脂质纳米粒协同发挥作用治疗炎症性肠病时，能够在治疗炎症的同时修复肠道屏障，关闭肠道外抗原入侵的大门，使得内部炎症环境由“热”转“冷”，恢复肠道稳态，实现IBD的预防、治疗和防复发。

附图说明

图1为实施例1中缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯的合成路线图。

图2为含缩硫酮键的双羧基交联单体的核磁氢谱图。

图3为缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯的核磁氢谱图。

图4为实施例2表3中四种脂质纳米粒的表征结果，其中，A为透射电镜图，B为粒径和分散系数分析图，C为电位分析图。

图5中的A为实施例3中Dex/LNPs在不同浓度H

图6为实施例4中脂质纳米粒的抗氧化能力测试结果图，A为荧光图，B为统计图。

图7中的A为实施例5中不同给药组处理对Caco-2细胞单层跨膜电阻的作用，B为不同给药组处理测得的FITC-Dextran跨膜渗透量，C-E为不同给药组处理的炎性细胞的TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

图8中的A为实施例6中不同给药组调控紧密连接蛋白的Western-blot条带，B为Claudin-1和Claudin-2的免疫荧光染色图，C为p-Akt蛋白含量半定量分析结果，D为Claudin-1蛋白含量半定量分析结果，E为Claudin-2蛋白含量半定量分析结果。

图9为实施例7中脂质纳米粒在小鼠体内24小时的分布情况图。

图10为实施例8中脂质纳米粒在模型小鼠中的疾病活动指数统计图。

图11为实施例8中脂质纳米粒在模型小鼠中的结肠长度。

图12为实施例8中脂质纳米粒在模型小鼠中的结肠H&E染色切片图。

图13为实施例8中脂质纳米粒在模型小鼠中的结肠组织炎性因子TNF-α，IL-6，IL-1β和小鼠粪便钙卫蛋白的含量统计图，其中，A为TNF-α，B为IL-6，C为IL-1β，D为小鼠粪便钙卫蛋白。

图中，*，**，***，****分别表示p值小于0.05，0.01，0.001，0.0001，ns代表组间无显著性差异。

具体实施方式

下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1：缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯的合成

缩硫酮键键合的α-生育酚和单甘酯的合成路线图如图1所示。

精密称取0.5g丙酮和0.457g 3-巯基丙酸于圆底烧瓶中，加入200μL TFA(三氟乙酸)，在氮气保护下室温搅拌12h，将混合物倒入冰水浴中析出产物，依次用冷水和冷己烷洗涤各3次，真空干燥得到白色粉末即为TK交联剂(含缩硫酮键的双羧基交联单体)，以氘代氯仿为溶剂进行核磁共振结构确证，结果如图2所示。

精密称取252mg TK交联剂和192mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)溶于10mL DMF中，45℃水浴搅拌30min活化TK交联剂一端的羧基，加入430mgα-T(α-生育酚)和122mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)，在氮气保护下45℃水浴搅拌12h进行第一步酯化反应，反应结束后再加入192mg EDC，45℃水浴搅拌30min，活化TK交联剂另一端的羧基，然后加入359mg单硬脂酸甘油酯(MG)和122mg DMAP，在氮气保护下45℃水浴搅拌12h进行第二步酯化反应,反应结束后将混合物倒入100mL冰水浴中析出产物，在10000rpm转速条件下离心10min得到沉淀，沉淀依次用稀盐酸和超纯水洗涤除杂，再用硅胶柱进一步提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(25:1，v:v)，冷冻干燥后得到最终纯化的产物缩硫酮键键合的α-生育酚和单硬脂酸甘油酯(记为α-T-TK-MG)，以氘代氯仿为溶剂进行核磁共振结构确证，结果如图3所示。

实施例2：活性氧响应性释药的脂质纳米粒的制备与表征

分别精密称取10mg实施例1制得的α-T-TK-MG以及不同质量的醋酸地塞米松、PI3K抑制剂LY294002溶于1mL无水乙醇中得到有机相，将有机相注入到10mL水中，60℃水浴搅拌5min，在室温下搅拌至冷却，分别得到含Dex/LNPs(载醋酸地塞米松的纳米粒)的混合液和含LY/LNPs(载LY294002的纳米粒)的混合液。

精密称取不同质量的Eudragit L100溶于1mL无水乙醇形成包衣液，将包衣液分别缓慢滴入上述混合液中，40℃水浴搅拌1h，即得脂质纳米粒L100/Dex/LNPs以及L100/LY/LNPs。

测试Dex/LNPs、LY/LNPs、L100/Dex/LNPs和L100/LY/LNPs的微观形貌、粒径和电位，采用高效液相色谱法测定其载药量和包封率，结果如表1-表3和图4中的A-C所示。

表1不同投药量的载药脂质纳米粒的粒径、载药量和包封率

表2不同包衣增重的载药脂质纳米粒的粒径、载药量和包封率

表3四种最佳比例载药脂质纳米粒的粒径、载药量和包封率

实施例3：脂质纳米粒的体外释放研究

以醋酸地塞米松(Dex)为待测对象，以人工胃液和含0.35％ SDS(十二烷基磺酸钠)的人工肠液为释放介质，确保药物的释放情况符合漏槽条件，并测定Dex在释放介质中的饱和溶解度。制备药物含量为1mg/mL的表3中L100/Dex/LNPs和Dex/LNPs纳米粒分散液，吸取1mL至透析袋(MWCO＝3.5kDa)，置于人工胃液中，37℃恒温水浴振荡(100rpm)，2h后将透析袋置于含有不同浓度H

实施例4：脂质纳米粒的抗氧化能力

取生长状态良好的Caco-2细胞，以每孔1×10

实施例5：载药脂质纳米粒的体外药效学评价

将Caco-2细胞按2×l0

将Caco-2细胞按1×l0

结果如图7中的A-E所示，其中A和B表明两种载药纳米粒协同治疗可以保护细胞单层的屏障功能，C-E表明两种载药纳米粒协同治疗可以实现良好的抗炎效果，二者优势结合，放大疗效。

实施例6：载药脂质纳米粒的体外药效机制研究

将实施例5中处理后的细胞用预冷的PBS洗涤2次，每次3min，每孔加入100μL细胞裂解液，冰上裂解30min，每10min吹打孔板，裂解下来的细胞悬液转移到离心管中冷冻离心(13000rpm，10min，4℃)，取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量，用Western blot实验检测紧密连接蛋白Claudin-1和Claudin-2的表达水平，进行定性和半定量分析。

将Caco-2细胞按1×l0

结果如图8中的A-E所示，表明两种载药纳米粒协同治疗通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而调节在肠道屏障中起重要作用的紧密连接蛋白Claudin-1和Claudin-2，协同保护肠道屏障。

实施例7：载药脂质纳米粒的体内分布

以C57BL/6小鼠为模型动物，配制3％(w/v)的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)溶液，C57BL/6小鼠自由饮用3％ DSS溶液一周，即得到结肠炎动物模型。精密称取10mgα-T-TK-MG溶于0.5mL无水乙醇，加入40μL近红外染料DiR/DMSO溶液(5mg/mL)，60℃水浴搅拌溶解，用溶剂扩散法制备得到DiR/LNPs，二次溶剂扩散法制备得到L100/DiR/LNPs(步骤与实施例2类似)。

将正常小鼠和结肠炎小鼠分别随机分成2组(n＝3)，实验前禁食12h。正常小鼠第1组灌胃给予0.5mL DiR/LNPs，第2组灌胃给予0.5mL L100/DiR/LNPs；结肠炎小鼠第1组灌胃给予0.5mL DiR/LNPs，第2组灌胃给予0.5mL L100/DiR/LNPs。依次于2，6，12，24h用水合氯醛(4％，w/v)麻醉，活体成像技术观察脂质纳米粒在体内的荧光信号分布。

图9表明肠溶衣包衣的纳米粒在结肠炎小鼠中的累积高于健康小鼠，在相同健康状况下，包衣纳米粒的累积高于未包衣纳米粒，说明包衣纳米粒能够很好地靶向结肠炎小鼠的结肠且具有较强的滞留能力。

实施例8：载药脂质纳米粒的体内药效学评价

将C57BL/6小鼠随机分成6组(n＝6)：Control组(饮用正常水)，PBS组(饮用3％DSS溶液)，L100/Dex/LNPs与L100/LY/LNPs的混合液组，L100/Dex/LNPs组，L100/LY/LNPs组和Dex与LY294002游离药混合溶液组，给药剂量为药物0.1mg/kg，进行给药对结肠炎小鼠实现及时治疗。治疗期间，记录小鼠的疾病活动指数变化，疾病活动指数DAI结合动物的体重下降百分率(小于1为0分，1-5为1分，5-10为2分，10-15为3分，大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0分，松散的大便为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)三种情况进行综合评分，将3项结果的总分除以3即得到DAI值。即DAI＝(体重指数+大便形状+出血情况)/3。治疗结束后，断颈处死小鼠，取小鼠的结肠，测量结肠的长度，用生理盐水小心冲洗肠段内容物，用4％多聚甲醛固定，取部分肠段用石蜡包埋，切片进行H&E染色和观察分析，再取部分肠段提取蛋白用Elisa法测定炎性因子TNF-α，IL-6，IL-1β含量。收集小鼠的粪便，提取蛋白，用Elisa法测定粪便钙卫蛋白含量。

结果如图10-13所示，图10表明两种载药包衣纳米粒的协同治疗能够最大限度地降低疾病活动指数，图11表明两种载药包衣纳米粒的协同治疗能够最好地抑制结肠萎缩，图12表明两种载药包衣纳米粒的协同治疗能够抑制上皮破坏、隐窝结构异常、杯状细胞耗损和免疫细胞浸润，减轻了结肠组织损伤，图13中的A-C表明两种载药包衣纳米粒的协同治疗能够起到抗炎效果，图13中的D为炎症性肠病复发的生物标志物小鼠粪便钙卫蛋白统计图，表明两种载药包衣纳米粒的协同治疗能够降低复发可能性。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。