一种花粉多糖组分3及其分离方法和应用

技术领域

本发明属于植物提取物分离技术领域，具体涉及一种花粉多糖组分3及其分离方法和应用。

背景技术

发明人之前的研究(专利CN 113133454B与专利CN113133455B)表明油菜花粉水提物可用于植物抗逆以及促进植物生长，其中包括了蔬菜或果树，例如娃娃菜、莴笋、生菜、上海青、小麦、辣椒、番茄、柑橘、猕猴桃、樱桃、梨、苹果等，同时，还对其中的成分进行了检测，含有糖类、蛋白质、氨基酸和脂类等多种成分。但具体活性成分还未见研究。

另外，文献“氨基酸与植物抗逆性关系的研究进展”(邢芳芳,高明夫,周传志,徐春英,范玲超.[J].黑龙江农业科学,2018(03):150-155)报道了氨基酸类物质也可用于植物抗逆。

在油菜花粉水提物中可能存在多种具有促进植物生长或抗逆作用物质的基础上，现目前，所属领域的技术人员无法得知哪种物质在促进植物生长或抗逆中起主导作用，因此必要对油菜花粉提取进行进一步的研究。

发明内容

多糖是由多个单糖分子脱水缩合而成的一类结构复杂的糖类物质，结构单位之间以糖苷键相连接，常见的糖苷键有ɑ-1,3糖苷键、β-1,6糖苷键、β-1,4糖苷键、ɑ-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键等。多糖广泛存在于动物、植物和微生物中，不同来源的多糖具有不同的生物活性。现有研究表明，植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖和降血脂等生物活性，又具有来源广、可降解、安全性高、易于修饰、环境亲和力高等特点，而被广泛应用于食品、医药、畜牧养殖及水产养殖等行业中。

同时，植物多糖是一类天然大分子聚合物，其结构较为复杂。目前对于花粉多糖的具体分子结构与其生理活性的构效关系研究较少，因此有必要对花粉多糖类化合物进行分离鉴定，为花粉多糖资源的未来开发研究提供可靠的理论和实验依据。

具体地，本发明对油菜花粉中的多糖进行了提取、分离和纯化，得到一种新花粉多糖，经测试，该花粉多糖在植物促长和抗逆方向均具有一定的效果。

具体地，本发明提供其中一种花粉多糖组分3，其主要重复结构单元如下：

主链

支链

本发明中，Ara代表阿拉伯糖；Gal代表半乳糖；f代表呋喃糖构型；p代表吡喃糖构型；T代表多糖分子末端(端基)。

其中，阿拉伯糖：半乳糖摩尔含量比等于0.328:0.399。

本发明的花粉多糖中除上述主要重复结构单元外，还含有以下痕量单糖：岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。

其中，岩藻糖：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸摩尔含量比等于0.006:0.095:0.328:0.399:0.024:0.027:0.010:0.096:0.014。

本发明中，花粉多糖的平均分子量为60～70KDa；

进一步地，花粉多糖的平均分子量为65～70KDa；

本发明中，花粉多糖的平均分子量在66～68KDa，例如66911.38Da。

本发明的花粉多糖其红外光谱至少包括下列吸收峰之一或一种以上：3426cm

花粉多糖组分3吸收带在3600-3200cm

本发明的目的还在于提供一种上述的花粉多糖的分离方法，包括以下内容：

(1)油菜花粉多糖提取物经大孔吸附树脂柱纯化，以水洗脱得到初步纯化的花粉多糖活性部位Fr-1；

(2)花粉多糖活性部位Fr-1通过离子交换层析柱，以0～0.05mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.05mol/L NaCl溶液组分，得到花粉多糖活性部位Fr-1-3；

(3)采用凝胶层析柱对花粉多糖活性部位Fr-1-3进一步纯化，其中碳酸氢铵水溶液作为洗脱液，得组分3，即本发明的花粉多糖。

上离子交换柱的花粉多糖活性部位Fr-1，其形式可以是大孔树脂的原洗脱液，也可以是原洗脱液的浓缩液，又或者是原洗脱液浓缩干燥后的复溶液等等。

上凝胶层析柱的花粉多糖活性部位Fr-1-3，其形式可以是离子交换柱的原洗脱液，也可以是原洗脱液的浓缩液，又或者是原洗脱液浓缩干燥后的复溶液等等。

所述浓缩干燥，所用方法包括但不限于：减压蒸发、常压蒸发、烘干、真空干燥、薄膜干燥、冻干等常规操作手段，这些手段可以单独使用，也可以联合使用。

步骤(1)所述油菜花粉多糖提取物是指通过常规方法获取的油菜花粉粗多糖。本发明所述常规方法包括但不限于水提以及水提后的初步纯化方式。

所述水提，包括但不限于加热提取、超声提取、微波提取等常规植物提取物提取方法。

同时，还可以根据不同情况，在提取前采用脱脂、脱色等方式进行除杂处理，例如采用脂溶性溶剂进行提取脱脂脱色，如乙醇、石油醚等。所述水提后的初步纯化方式，包括但不限于醇沉、壳聚糖除杂等不同方式。

本发明中，若选用水提醇沉法，则醇沉步骤中，在水提液(或水提液的浓缩液)中加入乙醇，直至乙醇浓度达到70-90％v/v，例如可以选择70％、71％、72％、73％、74％、75％......80％......85％......90％v/v等等。

在纯化方法中，还可以根据不同情况，选择性加入除蛋白、脱色、除小分子等辅助手段，便于后续多糖的富集工艺。例如可以使用除蛋白试剂，如酚、三氯乙酸、鞣酸等等；可以使用吸附剂脱色，例如纤维素、硅藻土、活性炭等；可以使用透析等方法除去小分子。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤(1)中所述油菜花粉多糖提取物是指油菜花粉水提醇沉后得到的花粉粗多糖。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤(1)中所述油菜花粉多糖提取物是指油菜花粉加热水提，壳聚糖除杂的花粉粗多糖。

在本发明的一些具体实施方案中，油菜花粉可经超微粉碎处理，以便于多糖的提取。

在本发明的一些具体实施方案中，油菜花粉的花粉多糖提取液可经真空冷冻干燥制成花粉粗多糖固体。

在本发明的技术方案中，步骤(1)中所用大孔树脂柱为非极性柱。

本发明中，大孔树脂柱包括但不限于DB-101大孔树脂柱、S-8大孔树脂柱，AB-8大孔树脂柱，HP-20大孔树脂柱；进一步，大孔树脂柱选自HP-20大孔树脂柱。

在本发明的技术方案中，步骤(2)中所用离子交换柱为阴离子交换柱，所述阴离子包括但不限于DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶、DEAE-葡萄糖凝胶等不同离子交换柱，进一步选自DEAE cellulose-52层析柱。

在本发明的技术方案中，步骤(3)中所用凝胶层析柱；所述凝胶层析柱包括但不限于葡聚糖凝胶(SephadexG)层析柱、聚丙烯酸凝胶ToyopearlHW层析柱等不同凝胶层析柱；进一步选自丙烯葡聚糖凝胶S-400HR层析柱、SephadexLH-20层析柱等。

在本发明的技术方案中，步骤(3)中，碳酸氢铵水溶液的浓度为0.1～0.3mol/L，优选0.2mol/L。

在本发明的一些具体实施方式中，步骤(1)中初步纯化的花粉多糖活性部位Fr-1，步骤(2)中的花粉多糖活性部位Fr-1-3均可经透析、冷冻干燥处理得固体备用；

进一步地，所述透析是指截留分子量至少为3500Da的物质。

在本发明的一些具体实施方式中，将步骤(3)含有组分3的洗脱液经减压浓缩、透析(3500Da)除盐、冷冻干燥，得到花粉粗多糖组分3的固体。

本发明中，经历浓缩步骤时，其浓缩程度是本领域技术人员可以根据洗脱时加入的洗脱液的量以及产品的最终需求来确定的。

在本发明的一些具体实施方式中，采用苯酚-硫酸法检测步骤(2)与步骤(3)中糖含量，检测其490nm处吸光值。

本发明的目的还在于花粉多糖组分3在制备植物抗逆产品中的应用。

本发明所述植物抗逆，包括抗高温、抗寒、抗旱、耐盐碱等。

本发明中，使用时将含有花粉多糖的产品施于植物叶面或植物根部。

本发明中花粉多糖的产品制成溶液使用时，主要活性成分的浓度可以根据实际需要进行选择。

例如花粉多糖组分3使用时的浓度可以选自0.01ppm～500ppm；可以选自0.01ppm～100ppm；可以选自0.01ppm～50ppm；还可以选自0.03ppm，......0.05ppm，......0.1ppm，......0.2ppm，......0.5ppm，......1.0ppm，......3.0ppm，......5.0ppm，......10ppm，......20ppm，......30ppm等等。

本发明的目的还在于花粉多糖组分3在制备促进植物生长产品中的应用。

本发明中所述植物包括但不限于经济作物、粮食作物，例如小白菜、娃娃菜、莴笋、生菜、上海青、小麦、辣椒、番茄、柑橘、猕猴桃、樱桃、梨、苹果、烟草等。

所述“经济作物”，种类繁多，包括但不限于纤维作物(如棉、麻等)、油料作物(如芝麻、花生等)、糖料作物(如甘蔗、甜菜等)、嗜好作物(烟草)、药用作物、染料作物、观赏作物、水果和其他经济作物等。

所述“粮食作物”，包括但不限于谷类作物(小麦，水稻，玉米)、薯类作物(包括甘薯、马铃薯等)及豆类作物(包括大豆、蚕豆、豌豆、绿豆等)等。

本发明还提供一种农用产品，所述产品的活性成分包括花粉多糖组分3。

本发明中，可将直接花粉多糖组分3作为单剂使用，为了使产品稳定、便于运输保存，也可加入辅料制成相应的剂型，辅料可以是本领域常规的辅料，例如，分散剂、润湿剂、粘结剂、乳化剂、稳定剂、溶剂、包埋剂等等。

另一方面，本发明所述花粉多糖组分3可以作为增效剂与叶面肥、水溶肥、复合肥、农药等产品复合使用。

本发明中所述产品的剂型包括但不限于乳油、悬浮剂、可湿性粉剂、粉剂、粒剂、水剂、母液、母粉等常规农产品制剂。

本发明的有益效果在于：

本发明发现了一种新的多糖并首次从油菜花粉中分离得到，该多糖可用于植物抗逆及促进植物生长。

本发明中所述“油菜”，为十字花科、芸薹属草本作物，常见的“油菜”包括但不限于白菜型油菜、甘蓝型油菜、黑芥型油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥等。本发明所述“花粉”取自上述“油菜”。

附图说明

图1：花粉粗多糖在DEAE cellulose-52阴离子交换柱上的梯度洗脱曲线；

图2：花粉多糖4个组分在S-400HR丙烯葡聚糖凝胶柱上的洗脱曲线；

图3：葡聚糖标准品分子量分布标准曲线；

图4：花粉多糖组分3的HPGPC测定色谱图；

图5：单糖混标及花粉多糖组分离子色谱仪检测色谱图(A:单糖混标；B:花粉多糖组分3；)其中，单糖混合物标准：1.鼠李糖(Rha)2.岩藻糖(Fuc)3.阿拉伯糖(Ara)4.木糖(Xyl)5.甘露糖(Man)6.葡萄糖(Glc)7.半乳糖(Gal)8.葡萄糖醛酸(GlcA)9.半乳糖醛酸(GalA)；溶剂峰：2.0min为氢氧化钠的峰，40min乙酸钠的峰。

图6：花粉多糖组分3甲基化分析总离子流图(TIC)；

图7：花粉多糖组分3所属各甲基化PMAAs质谱图；

图8：花粉多糖组分3的

图9：花粉多糖组分3的

图10：花粉多糖组分3的DEPT-135NMR谱；

图11：花粉多糖组分3的HSQC谱；

图12：花粉多糖组分3的COSY谱；

图13：花粉多糖组分3的TOCSY谱；

图14：花粉多糖组分3的HMBC谱；

图15：花粉多糖组分3紫外吸收光谱；

图16：花粉多糖组分3的红外吸收光谱。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，当然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明保护的范围。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1花粉多糖的提取

将油菜花粉超微粉碎成粉末，得到预处理后的花粉粉末。称取5.0g预处理的花粉粉末，后经乙醇去除游离单糖、石油醚脱脂脱色、后经乙醇脱脂、加热水提、醇沉，收集沉淀，并依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀。最后将洗涤过的沉淀用水复溶，–20℃预冻，真空冷冻干燥得热水提取的花粉粗多糖。

实施例2花粉多糖的提取

将油菜花粉与水混合，加热提取，过滤，向滤液中加入壳聚糖，保温静置，固液分离，所得液体即为花粉粗多糖提取液。提取液减压浓缩后，在–20℃预冻，真空冷冻干燥得花粉粗多糖。

实施例3花粉多糖的提取

将油菜花粉超微粉碎成粉末，得到预处理后的花粉粉末。称取5.0g预处理的花粉粉末，后经乙醇去除游离单糖、石油醚脱脂脱色、超声提取、醇沉，收集沉淀，并依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀。最后将洗涤过的沉淀用水复溶，–20℃预冻，真空冷冻干燥得热水提取的花粉粗多糖。

实施例4花粉多糖的分离纯化

步骤(1)HP-20大孔吸附树脂层析柱纯化：采用HP-20大孔吸附树脂层析柱(Φ4.0cm×40cm)对花粉粗多糖进行初步纯化，具体步骤如下：称取一定量花粉粗多糖，加入一定量水，配制10-20mg/mL花粉粗多糖溶液，单次上样量10mL。经HP-20大孔吸附树脂层析柱吸附3小时后，使用5倍柱体积水冲洗柱子，接样，得花粉多糖活性部位Fr-1，48℃下减压浓缩，透析(3500Da)，冷冻干燥备用。

步骤(2)DEAE cellulose-52层析柱分离纯化：再采用DEAE cellulose-52层析柱(Φ3.5cm×30cm)对经花粉多糖活性部位Fr-1进行分离纯化，具体步骤如下：①上样100mg花粉多糖活性部位Fr-1溶液；②洗脱，洗脱液依次为水、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4和0.5mol/LNaCl溶液，流速为1.2mL/min，每管收集6mL；③收集，采用苯酚-硫酸法隔管检测糖含量，用酶标仪检测其490nm处吸光值，以收集管数为横坐标，收集液吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线。收集各NaCl洗脱峰，合并相同组分，得到花粉多糖的各分级组分(花粉多糖活性部位Fr-1-1、花粉多糖活性部位Fr-1-2、花粉多糖活性部位Fr-1-3、花粉多糖活性部位Fr-1-4)，上述活性部位在48℃下减压浓缩、透析(3500Da)除盐、冷冻干燥，备用。

由图1可知，通过DEAE cellulose-52阴离子交换柱，以不同浓度NaCl溶液梯度洗脱花粉粗多糖，分离得到4个洗脱峰，分别为水洗脱组分(花粉多糖活性部位Fr-1-1)、0.025mol/LNaCl溶液洗脱组分(花粉多糖活性部位Fr-1-2)、0.05mol/LNaCl溶液洗脱组分(花粉多糖活性部位Fr-1-3)和0.25mol/LNaCl溶液洗脱组分(花粉多糖活性部位Fr-1-4)。分别收集各洗脱峰对应的洗脱液，经减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到花粉粗多糖的初步分级花粉多糖活性部位Fr-1-1、花粉多糖活性部位Fr-1-2、花粉多糖活性部位Fr-1-3、花粉多糖活性部位Fr-1-4的固体。

步骤(3)S-400HR丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化：最后采用丙烯葡聚糖凝胶S-400HR层析柱(Φ1.0cm×100cm)对花粉多糖的各分级组分进一步纯化，具体步骤如下：①上样各分级组分溶液，单次上样量20mg；②洗脱，以0.2mol/L碳酸氢铵为洗脱相，流速0.2mL/min，每管收集3mL，持续洗脱至无糖检出，每个组分洗脱液收集40管；③收集，苯酚-硫酸法隔管检测糖含量，用酶标仪检测其490nm处吸光值，绘制洗脱曲线，收集洗脱峰，合并相同组分，48℃下减压浓缩、透析(3500Da)除氨、冷冻干燥，得到各花粉多糖的纯化组分。

通过S-400HR丙烯葡聚糖凝胶层析柱，将DEAE cellulose-52阴离子交换柱分离得到的4个花粉多糖组分(花粉多糖活性部位Fr-1-1、花粉多糖活性部位Fr-1-2、花粉多糖活性部位Fr-1-3、花粉多糖活性部位Fr-1-4)进一步纯化，以0.2mol/L碳酸氢铵分别洗脱4个组分。由图2可知，4个组分经0.2mol/L碳酸氢铵洗脱后，均得到单一洗脱峰，分别将对应组分命名为组分1、组分2、组分3、组分4。分别收集洗脱峰对应的洗脱液(组分1组分：21～31管；组分2：20～26管；组分3：18～26管；组分4：20～23管)，经减压浓缩、透析和冷冻干燥，得到4个组分花粉多糖纯化组分。

花粉多糖纯化组分的纯度鉴定及其分子量测定

测定方法：花粉多糖各纯化组分的纯度鉴定及分子量测定采用高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)。测试条件为：Agilent 1260series高效液相色谱仪；示差折光检测器(RID)；Shodex OHpak SB-804HQ(7.8mm×300mm)凝胶色谱柱；流动相为0.1mol/LNa

标准曲线的绘制：将系列不同分子量(5900、9600、21100、47100、107000、200000、341400Da)的葡聚糖标准品解于0.1mol/LNa

花粉多糖纯化组分的纯度及分子量的测定：将10mg花粉多糖纯化样品溶解于2mL0.1mol/LNa

采用HPGPC法对花粉多糖纯化组分3的纯度和分子量进行测定，其结果如图4所示。由图4可以看出，花粉多糖纯化组分3的HPGPC色谱图中出现了单一对称峰，说明其纯度高。该结果与S-400HR丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化结果一致，进一步说明建立的花粉多糖分离纯化方法可行，可制备出纯度较高的花粉纯化多糖。根据前面建立的分子量标准曲线，计算组分3的平均分子量为66911.38Da。

实施例5花粉多糖的结构鉴定

1花粉多糖单糖组成测定结果

测定方法：采用离子色谱法(IC)测定花粉多糖样品的单糖组成。精密称量10mg多糖样品置于安瓿瓶中，进行酸水解。准确吸取酸水解溶液转移至试管中氮气吹干，加入5mL蒸馏水涡旋混匀，吸取50uL加入950uL蒸馏水，12000r/min离心5min，取上清液进行IC分析。同时取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标。依据花粉多糖水解样品在色谱中的出峰时间判断其单糖组成。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比，C(标准品)/A(标准品)＝C(样品)/A(样品)。C为浓度，A为峰面积。色谱条件：色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；流动相：A:H2O；B:15mM NaOH；C:15mM NaOH和100mM乙酸钠；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。如图5(A)所示，使用离子色谱仪成功分离、检测出16种标准单糖的色谱峰，其峰型规整、分离度高、可以很好的满足单糖组成分析中对常见单糖种类的同时检测。

表1花粉多糖组分3的单糖组成

如图5(B)所示为花粉多糖组分3单糖组成分析离子色谱图，在图5(B)中检测出半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，说明花粉多糖组分3属于酸性糖。从图中可以得出花粉多糖组分3主要含有阿拉伯糖和半乳糖。通过相关色谱峰面积计算可得花粉多糖组分3中岩藻糖：鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸等于0.006:0.095:0.328:0.399:0.024:0.027:0.010:0.096:0.014(表1)。

2.花粉多糖甲基化和核磁共振结果分析

为研究花粉多糖各组分的空间结构，对花粉多糖组分3进行核磁共振NMR分析，测定了各组分的

2.1花粉多糖组分3的甲基化测定结果

为研究花粉多糖组分3的一级结构，采用改进后的Needs法对花粉多糖组分3进行甲基化处理。

完全甲基化的花粉多糖组分3，经水解、还原、衍生化等步骤的处理，转化为部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAAs)，通过GC-MS分析，可以得到花粉多糖组分3甲基化分析的总离子流图，如图6所示。将图中甲基化糖基峰对应的质谱图(图7)与标准谱库检索进行相关的比对(标准谱库：The CCRC Spectral Database for PMAAs https://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)，确定部分甲基化糖基的类型，同时根据色谱峰的峰面积计算相对摩尔比，并结合单糖组成测定结果，可以为花粉多糖组分3重复单元结构的推测提供必要的结构信息。

表2花粉多糖组分3甲基化分析结果

2,3-Me

因花粉多糖组分3主要含阿拉伯糖和半乳糖，而鼠李糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖和甘露糖含量过低，甲基化分析只检测出阿拉伯糖和半乳糖的PMAAs，而鼠李糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖和甘露糖的PMAAs并未检出。但由于鼠李糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖和甘露糖含量很低，并不影响花粉多糖组分3主要糖苷键连接形式的分析判断。用GC-MS检测的总离子流图，从图7中主要筛选搜集到5种甲基化衍生的糖基离子片段。

如表2所示，花粉多糖组分3甲基化分析样品中主要含有5种糖基离子片段，分别来源于半乳糖和阿拉伯糖。其中半乳糖主要以→3,6)-Galp-(1→和→3)-Galp-(1→连接方式存在，阿拉伯糖主要以→3,5)-Araf-(1→和→5)-Araf-(1→形式存在。根据花粉多糖组分3的糖残基糖苷键连接方式并结合花粉多糖结构的特性，可以初步推断，花粉多糖组分3主链可能是通过→3,6)-Galp-(1→和→3)-Galp-(1→连接而成连接其他糖苷键；支链主要可能是由→3,5)-Araf-(1→和→5)-Araf-(1→组成。

2.2花粉多糖组分3的核磁共振NMR测定结果

表3花粉多糖组分3中单糖残基

如图8、9、10所示花粉多糖组分3的

根据甲基化分析，结合相关核磁结果分析，可以确定花粉多糖组分3是由半乳糖通过β-D-1,3,6-Galp和β-D-1,3-Galp相连接构成主链，连接的支链基团支链主要由α-L-1,3,5-Araf和α-L-1,5-Araf构成，花粉多糖组分3的主要重复结构单元如下：

主链

支链

3其他结构测定结果

3.1紫外光谱测定结果

如图15所示，花粉多糖组分3在可见光区域内均无任何特征吸收峰，其主要原因是在花粉多糖分子结构中缺少相对应的发色基团，这同时也是多糖组分难以快速定性及定量检测的主要原因。在紫外光区，在280nm和260nm处均未发现吸收峰，这说明花粉多糖组分3是单纯的多糖，其纯度高。

3.2红外光谱测定结果

图16为植物多糖类物质典型红外光谱图，花粉多糖组分3吸收带在3600-3200cm

实施例6花粉多糖组分3的促进烟草生长作用

实验样品：

花粉多糖组分3用纯水配制为多糖浓度为10mg/ml的母液后按照实验设计用水稀释使用。

1、实验设计：

表4药剂浓度设计

2、实验方法：

处理药剂按照表4配制后，对烟草幼苗叶片进行均匀喷施，每个处理6次重复，每个重复1株，以药液不滴落为宜，防止药剂进入土壤影响实验结果，培养期间设置条件为：温度28℃，光照2000lux，14h/10h(日/夜)，湿度65％。分别于药前和药后7天用植物表型分析系统记录烟草的RGB AREA_MM参数值(叶面积/mm

叶面积增长率(％)＝(叶面积终-叶面积初)×100％/叶面积初

3、实验结果：

药后7天不同处理组叶面积增长率如表5，从实验结果可以看出，花粉多糖组分3在0.03～30ppm浓度范围内均对烟草均具有促长效果，其中最佳促长浓度为0.3ppm，有明显促进烟草生长作用。

表5不同处理组烟草促长测定结果

实施例7花粉多糖组分3的促进小白菜生长作用

1、实验样品：

花粉多糖组分3用纯水配制为多糖浓度为10mg/ml的母液后按照实验设计用水稀释使用，清水。

2、实验设计：

表6药剂浓度设计

3、实验方法：

挑选长势一致的小白菜幼苗(3～4片叶)，处理药剂按照表6配制后，对小白菜幼苗进行灌根处理，每个处理6次重复，每个重复1株，每株灌药量为80ml，放置在25℃的植物培养室中培养，光照强度设置为3000lux，14h/10h(日/夜)，湿度65％，培养期间水肥管理水平保持一致。药后7天测定叶长、叶宽、地上部鲜重和SPAD值。

4、实验结果：

药后7天不同处理组测定结果如表7，从实验结果可以看出，花粉多糖组分3在0.03～30ppm浓度范围对小白菜均有促生长效果，其中最佳促长浓度为0.3ppm，优于对照组。

表7药后7天不同处理组小白菜促长测定结果

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实施例8花粉多糖组分3的抗低温实验

1、实验样品：

花粉多糖组分3用纯水配制为多糖浓度为10mg/ml的母液后按照实验设计用水稀释使用，清水。

2、实验设计：

表8药剂浓度设计

3、实验方法：

处理药剂按照表8配制后，对烟草幼苗叶片进行均匀喷施，每个处理6次重复，每个重复1株，以药液不滴落为宜，防止药剂进入土壤影响实验结果，缓苗1天后进行冷害(4℃)处理24h后在28℃条件下进行恢复，分别于药前、低温处理24h和恢复24h后用植物表型仪记录烟草的叶绿素荧光QY-max参数值和Fv/Fm-lss参数值。

4、实验结果：

QY-max表示植物理论最大光合能力，其降低率越小表示植物的抗低温效果越好。Fv/Fm-lss表示PSⅡ的最大光量子产量，与QY-max类似，其降低率越小表示植物的抗低温效果越好。从表9中可以看到，低温处理24h后各处理组QY-max和Fv/Fm-lss荧光值明显出现降低，但使用花粉多糖组分3的处理组QY-max和Fv/Fm-lss荧光值降低程度更低，说明植株的生长状态较清水对照好，抗低温能力更强。低温处理24h后，花粉多糖组分3在0.03～30ppm浓度范围内均可提升烟草抗寒性，其中最佳抗低温浓度为0.03ppm。常温恢复24h后，如表10所示，各处理组QY-max和Fv/Fm-lss荧光值开始回升，说明在低温下受到损害的各植株生长状态在恢复，花粉多糖组分3在0.03～30ppm浓度范围内均可促进冷害植物回复，其中0.03ppm浓度下的组分3能够明显促进植株生长状态的恢复。

表9低温处理24h测定结果

表10常温恢复24h测定结果

实施例9花粉多糖组分3的抗高温实验

1、实验样品：

花粉多糖组分3用纯水配制为多糖浓度为10mg/ml的母液后按照实验设计用水稀释使用，清水。

2、实验设计：

表11药剂浓度设计

3、实验方法：

挑选生长状态一致的烟草幼苗(3叶期)，处理药剂按照表11配制后，对烟草幼苗叶片进行均匀喷施处理药剂按照表11配制后，对烟草幼苗叶片进行均匀喷施，每个处理6次重复，每个重复1株，以药液不滴落为宜，防止药剂进入土壤影响实验结果，缓苗1天后在40℃高温下处理48h，分别于药前、高温处理48h后用植物表型仪记录烟草的叶绿素荧光QY-max参数值和Fv/Fm-lss参数值，并在高温处理48h后取样测定丙二醛含量。

4、实验结果：

QY-max表示植物理论最大光合能力，其降低率越小表示植物的抗高温效果越好。Fv/Fm-lss表示PSⅡ的最大光量子产量，与QY-max类似，其降低率越小表示植物的抗高温效果越好。非光化学淬灭系数NPQ-lss，反映了植物热耗散过剩光能为热的能力，反映植物的光保护能力，当植物受到胁迫时植物吸收的光能不再被用于光合作用，而是直接转化为热能耗散掉，从而避免植物遭到伤害，此时植物NPQ-lss会升高，因此在高温胁迫时NPQ-lss值越低表示植物受到的伤害越小，抗高温效果越好。而丙二醛含量与植物逆境伤害有着密切关系，在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，产生具有细胞毒性的丙二醛(MDA))，因此在高温条件下MDA含量越低表示植物受到的伤害越小，抗高温效果越好。

从表12中可以看到，高温处理48h后各处理组QY-max和Fv/Fm-lss荧光值明显出现降低，NPQ-lss荧光值明显升高，但使用花粉多糖的各处理组QY-max和Fv/Fm-lss荧光值降低程度和NPQ-lss荧光值升高程度更小，说明植株的生长状态较清水对照好，抗高温能力更强，高温处理48h后，花粉多糖组分3在0.03～30ppm浓度范围内均可提升烟草抗高温能力，其中最佳抗高温浓度为0.03ppm。各处理组MDA含量测定结果如表13所示，使用花粉多糖的各处理组与对照组相比能够减少植物体内MDA的产生，从而减少植物的受伤害程度。与上述各荧光参数反应一致，花粉多糖组分3在0.03ppm浓度下处理组植物体内MDA含量最少。

表12不同处理组荧光参数测定结果

表13不同处理组MDA含量测定结果

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