一种通用型黏膜疫苗载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学和疫苗技术领域，特别涉及一种通用型黏膜疫苗载体及其制备方法。

背景技术

呼吸道疾病是影响全球动物养殖业的主要健康威胁，尤其在猪等经济动物中。诸如猪肺炎支原体、猪蓝耳病毒、猪流感病毒等病原体所引起的呼吸道疾病对畜牧业造成了重大经济损失。这些病原体主要通过呼吸道黏膜侵入宿主，因此，黏膜免疫应答在抵御这些病原体中起着至关重要的作用。

传统的疫苗接种方法多数通过肌肉注射进行，主要激活体液免疫反应。然而，这种方法在激活黏膜免疫应答方面效果有限，尤其是在针对呼吸道黏膜屏障的病原体时。肌肉注射疫苗通常不能有效地激活肺部黏膜的免疫应答，导致免疫保护效果不理想。此外，现有的黏膜疫苗在递送效率、靶向性、安全性和稳定性方面存在挑战，特别是在穿透呼吸道黏膜屏障、有效激活肺泡巨噬细胞等方面，现有技术仍有待改进。

呼吸道黏膜是多种呼吸道病原物侵入宿主的主要途径，也是抵抗感染的第一道防线。因此，开发能够有效激活呼吸道黏膜免疫应答的疫苗具有重要的意义。理想的黏膜疫苗应该能够在不破坏黏膜屏障的前提下，激活肺泡巨噬细胞和其他免疫细胞，从而提供有效的保护。针对呼吸道感染的黏膜疫苗研发是当前兽医免疫学和疫苗学领域的研究热点。人们正在探索新的黏膜疫苗递送系统，以提高疫苗对呼吸道黏膜免疫系统的激活效率。这包括开发新型的黏膜佐剂、递送载体以及靶向技术，以提高疫苗的有效性和安全性。

现有技术中，黏膜疫苗缺乏既能有效穿透黏膜屏障又能针对性地激活肺部免疫细胞的载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用型黏膜疫苗载体，既能有效穿透黏膜屏障又能针对性地激活肺部免疫细胞的载体，产生较高的黏膜抗体水平和较好的保护效果。

本发明的另一目的是提供通用型黏膜疫苗载体的制备方法，该方法简单，易于操作，成本低。

本发明还提供所述通用型黏膜疫苗载体的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种通用型黏膜疫苗载体，包括Poly(I:C)和细胞膜上表达了肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的细胞膜。

在本发明中，所述肺表面活性蛋白A编码基因如SEQ ID NO:1中第1-525位碱基所示，所述成孔蛋白编码基因如SEQ ID NO:1中第526-1050位碱基所示。

在本发明中，所述Poly(I:C)和细胞膜上表达了肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的细胞膜的质量比为1.5-2.5:1。

本发明还提供所述通用型黏膜疫苗载体的制备方法，包括如下步骤：将细胞膜上表达有肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的细胞膜与Poly(I:C)混合，经电转化后，得到所述通用型黏膜疫苗载体。

在本发明中，细胞膜上表达有肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的构建方法如下：将肺表面活性蛋白A和成孔蛋白编码基因插入载体中，然后通过脂质体转染试剂转染至肺泡巨噬细胞；或者将肺表面活性蛋白A和成孔蛋白通过连接肽相连形成融合蛋白，将该融合蛋白的编码基因插入载体中，然后通过脂质体转染试剂转染至肺泡巨噬细胞。

在本发明中，所述肺表面活性蛋白A编码基因如SEQ ID NO:1中第1-525位碱基所示，所述成孔蛋白编码基因如SEQ ID NO:1中第526-1050位碱基所示。

在本发明中，所述细胞膜上表达有肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的细胞膜与Poly(I:C)的质量比为1:1.5-2.5。

在本发明中，将所述表达有肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的肺泡巨噬细胞的细胞膜采用脂质体挤出仪挤压，制备成粒径为100-200nm的人工外囊泡后再与Poly(I:C)混合，并进行电转化。

本发明还提供所述通用型黏膜疫苗载体在制备兽医疫苗中的应用。

在本发明中，所述兽用疫苗为猪肺炎支原体疫苗或猪伪狂犬病毒疫苗；将含有10-30μg的Poly(I:C)的通用型黏膜疫苗载体与10

本发明中的载体通过特定的生物工程技术进行改造，细胞膜表面展示表面活性剂蛋白A(SP-A)的CRD结构域和成孔蛋白LLO，改造的细胞膜利用挤压的方式形成人工外囊泡，进一步负载黏膜佐剂Poly(I:C)。本发明通用型黏膜疫苗载体，既能有效穿透黏膜屏障又能针对性地激活肺部免疫细胞的载体，产生较高的黏膜抗体水平和较好的保护效果。本发明黏膜疫苗载体能有效结合猪肺炎支原体和伪狂病毒。黏膜疫苗载体联合猪肺炎支原体疫苗滴鼻免疫后能有效诱导抗原特异性黏膜抗体IgA，同时免疫后还能减轻攻毒引起的肺部病变，表明黏膜疫苗载体能够增强猪肺炎支原体的黏膜免疫应答，与疫苗联合后能有效预防动物支原体感染。优于该黏膜疫苗载体表面的表面活性剂蛋白A，能够结合多种呼吸道病原，由此，该黏膜疫苗载体可适用于多种呼吸道病原物的疫苗。

附图说明

图1肺表面活性蛋白A和成孔蛋白的融合蛋白在肺泡巨噬细胞膜表面表达的免疫印迹图，免疫印迹图的左侧标记了检测的目标蛋白，免疫印迹图的上方的标记了转染至细胞的质粒。

图2黏膜疫苗载体与猪肺炎支原体结合的透射电镜图(箭头指向的是黏膜疫苗载体)。

图3黏膜疫苗载体与伪狂犬病毒结合的透射电镜图(箭头指向的是黏膜疫苗载体)。

图4各疫苗免疫后肺泡灌洗液中抗原特异性sIgA的水平，其中Mhp是猪肺炎支原体疫苗组，Poly(I:C)+Mhp是猪肺炎支原体-Poly(I:C)疫苗组，载体+Mhp是黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组。

图5黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗免疫后对支原体感染的保护作用，其中Mhp是猪肺炎支原体疫苗组，载体+Mhp是黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组。

具体实施方式

实施例1通用型黏膜疫苗载体的制备

通用型黏膜疫苗载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建含肺表面活性蛋白A特征序列和成孔蛋白特征序列的融合质粒

设计两个蛋白，分别为肺表面活性蛋白A(SP-A)和成孔蛋白(LLO)，该两个蛋白的一端为定位肽，以帮助表达的蛋白定位在细胞膜上，肺表面活性蛋白A蛋白带有HA标签，成孔蛋白带有Flag标签。将肺表面活性蛋白A与成孔蛋白相连形成融合蛋白，其编码基因为SEQ IN NO:1所示的序列，其中肺表面活性蛋白A编码基因的序列如SEQ ID NO:1中第1-525位碱基所示，成孔蛋白的序列如SEQ ID NO:1中第526-1050位碱基所示。将SEQ ID NO:1所示的序列插入pTT5载体中EcoR1和HindIII酶切位点之间，得到融合质粒。

(2)传代的鼠肺泡巨噬细胞MH-S贴壁生长至80％汇合，利用脂质体转染试剂Lipofectamine 3000将步骤(1)构建的融合质粒转染至鼠肺泡巨噬细胞MH-S内，转染过程中，融合质粒使用量为5ug，细胞使用量为1×10

(3)将转染了融合质粒的鼠肺泡巨噬细胞的细胞膜用去离子水重悬，调整膜浓度为2mg/ml，使用脂质体挤出仪挤压过孔径为1000nm的膜10次，然后过孔径为100nm的膜10次，最终制备得到粒径约为130nm的人工外囊泡。

(4)将人工外囊泡利用电转的方式装载佐剂Poly(I:C)，具体方法如下：配制浓度为2mg/ml的Poly(I:C)水溶液(Poly(I:C)购自Invivogen公司，货号为tlrl-pic)。将本实施例步骤(3)制备的2mg/ml的人工外囊泡与2mg/ml的Poly(I:C)水溶液按照体积比1:2混合，加入电转杯中进行电转化，电转参数设置为电压250V；电转杯电极间距4mm，电转时间29ms，制备得到黏膜疫苗载体。

实施例2黏膜疫苗载体与猪肺炎支原体结合实验

本实施例中黏膜疫苗载体来源于实施例1。

将含20μg的Poly(I:C)的黏膜疫苗载体与10

实施例3黏膜疫苗载体与伪狂犬病毒结合实验

本实施例中黏膜疫苗载体来源于实施例1。

将含20μg的Poly(I:C)的黏膜疫苗载体与40μg伪狂犬病毒(PRV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCCNO.6604)混合均匀，放置1小时后，110000g离心70分钟，收集沉淀，并用50μl浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液重悬，利用透射电子显微镜检测黏膜疫苗载体与猪肺炎支原体的结合情况，结果(图3)显示，黏膜疫苗载体能与伪狂犬病毒有效结合。

实施例4黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗免疫后对抗原特异性黏膜抗体IgA的激活作用

猪肺炎支原体疫苗：是滴度为10

猪肺炎支原体-Poly(I:C)疫苗(记为Poly(I:C)+Mhp)：将滴度为10

黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗(记为载体+Mhp)：将滴度为10

将BALB/c小鼠分为四个组别，分别为对照组、猪肺炎支原体疫苗组(记为Mhp组)、猪肺炎支原体-Poly(I:C)疫苗组(记为Poly(I:C)+Mhp组)、黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组(记为载体+Mhp组)，每组3只。第一次免疫，对照组小鼠接种50μl PBS溶液/只，其他各组小鼠接种与其组名对应的疫苗，按照滴鼻的方式进行免疫，免疫体积为50μl/只，第一次免疫14天后进行第二次免疫，免疫方式和剂量同第一次。二免后14天收集各组的肺泡灌洗液，检测其中抗原特异性sIgA的水平(检测方法参考文献：FengZhi-xin,Shao Guo-qing,Liu Mao-jun,et al.Developmentandvalidation ofa SIgA-ELISAforthe detectionofMycoplasma hyopneumoniae infection[J].VetMicrobiol,2010,143(2-4):410-416.)。结果如图4，可以看到，黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组(载体+Mhp组)的中sIgA的水平与猪肺炎支原体疫苗组(Mhp)和猪肺炎支原体-Poly(I:C)疫苗组(Poly(I:C)+Mhp组)相比显著增多，提示黏膜疫苗载体联合猪肺炎支原体抗原能够有效诱导抗原特异性的黏膜反应。

实施例5黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗体内预防支原体感染实验

猪肺炎支原体疫苗：是滴度为10

黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗(记为载体+Mhp)：实施例4制备。

BALB/c小鼠分为三个组别，分别为攻毒组、猪肺炎支原体疫苗组(Mhp)和黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组(载体+Mhp组)，每组3只。第一次免疫，攻毒组小鼠不接种，其他各组小鼠接种与其组名对应的疫苗，按照滴鼻的方式进行免疫，免疫体积为50μl/只，第一次免疫14天后进行第二次免疫，免疫方式和剂量同第一次。二免后14天，攻毒组、猪肺炎支原体疫苗(Mhp)组和黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组(载体+Mhp组)均用猪肺炎支原体强毒株NJ株进行滴鼻感染，攻毒剂量为10

结果如图5，与攻毒组和猪肺炎支原体疫苗(Mhp)组相比，黏膜疫苗载体-猪肺炎支原体疫苗组(载体+Mhp组)小鼠能明显少淋巴细胞的浸润，减少肺部病变，评分为1.3，显著低于猪肺炎支原体疫苗(Mhp)组的评分(5.3)，表明黏膜疫苗载体联合猪肺炎支原体能够有效预防支原体感染。