使用AAV2变体和阿柏西普治疗AMD

本申请是申请日为2017年6月16日、申请号为201780050283.2、发明名称为“使用AAV2变体和阿柏西普治疗AMD”的中国发明专利申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求2016年06月16日提交的美国临时申请号62/351,234的权益，其公开内容通过引用整体并入本申请。

背景技术

阿柏西普(Aflibercept)是一种重组融合蛋白，其充当血管内皮生长因子亚型A和B(VEGF-A和VEGF-B)和胎盘生长因子(PIGF)的诱饵受体。通过与这些配体结合，阿柏西普能够阻止这些配体与血管内皮生长因子受体(VEGFR)VEGFR-1和VEGFR-2结合，以抑制新生血管形成并降低血管通透性。阿柏西普由与IgG1的Fc片段融合的VEGFR-1的结构域2和VEGFR-2的结构域3构成。阿柏西普以商品名

发明内容

尽管

本公开涉及通过玻璃体内或视网膜下施用药物组合物在灵长类或人类受试者中预防或治疗新生血管性(湿性)年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、在DME患者中的糖尿病性视网膜病变(DR)、视网膜静脉阻塞以及相关的眼部疾病或病况的药物组合物和方法，所述药物组合物包含药学有效量的载体或病毒颗粒(例如，rAAV)，所述载体或病毒颗粒包含编码阿柏西普、其功能性片段或变体的核酸。

在一些方面中，本申请公开了一种治疗眼部病况或疾病的方法，所述方法包括：通过玻璃体内注射向有需要的灵长类受试者的眼部施用单位剂量的药物组合物，其中所述药物组合物包含：(a)rAAV2变体，所述rAAV2变体包含插入衣壳蛋白VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP，以及编码多肽的核酸序列，所述多肽与阿柏西普、其功能性片段或变体具有至少80％同源性，以及(b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，所述眼部病况或疾病是新生血管性(湿性)年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)或者与DME相关的糖尿病性视网膜病变。在一些情况下，所述眼部病况或疾病是脉络膜新生血管形成或湿性AMD。在一些情况下，所述单位剂量包括1E12至1E13的载体基因组。在一些情况下，所述单位剂量包括2E12至6E12的载体基因组。在一些情况下，所述单位剂量包括不超过100μL的体积。在一些情况下，所述单位剂量包括不超过50μL的体积。在一些情况下，所述受试者是非人灵长类。在一些情况下，所述受试者是人。在一些情况下，所述受试者对阿柏西普产生应答。在一些情况下，所述受试者已使用阿柏西普预治疗。在一些情况下，所述通过玻璃体内注射施用在至少2年内进行不超过1次。在一些情况下，所述通过玻璃体内注射施用在至少5年内进行不超过1次。在一些情况下，所述通过玻璃体内注射施用是一次性施用。在一些情况下，所述药物组合物是混悬液或冷藏的混悬液。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用步骤之前搅拌所述混悬液以确保所述混悬液均匀分布。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用步骤前将所述药物组合物加温至室温。

在其他方面中，一种药物组合物，所述药物组合物包含混悬液，所述混悬液进一步包含：rAAV2变体，所述rAAV2变体包含插入衣壳蛋白VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP，以及编码多肽的核酸序列，所述多肽与阿柏西普、其功能性片段或变体具有至少80％同源性。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。在一些情况下，所述组合物的单位剂量包括1E12至1E13的载体基因组。在一些情况下，所述药物组合物的单位剂量包括2E12至6E12的载体基因组。在一些情况下，一种试剂盒，所述试剂盒包括混悬药物组合物和用于稀释所述药物组合物的溶液。在一些情况下，所述药物组合物包含不超过1mL。在一些情况下，所述药物组合物包含不超过0.5-1.0mL。在一些情况下，所述药物组合物包含小于或等于0.5mL。在一些情况下，在所述试剂盒中的所述溶液包含缓冲剂、盐、醇、表面活性剂或其任何组合。在一些情况下，所述试剂盒包括注射器。

在其他方面中，一种治疗眼部病况或疾病的方法，所述方法包括：搅拌冷藏的混悬液，所述混悬液包含：rAAV2变体，所述rAAV2变体包含插入衣壳蛋白VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP，以及编码多肽的核酸序列，所述多肽与阿柏西普、其功能性片段或变体具有至少80％同源性；以及通过玻璃体内注射向人类受试者的眼部施用一定体积的所述冷藏的混悬液。在一些情况下，所述受试者的特征为已使用阿柏西普预治疗。在一些情况下，所述受试者对阿柏西普产生应答。在一些情况下，所述冷藏的混悬液包含不超过1mL的所述溶液。在一些情况下，所述冷藏的混悬液包含不超过0.5mL。在一些情况下，向所述受试者施用的所述体积不超过50μL。在一些情况下，向所述受试者施用的所述体积不超过100μL。在一些情况下，所述体积包括1E12至1E13的载体基因组的单位剂量。在一些情况下，所述体积包括2E12至6E12的载体基因组的单位剂量。在一些情况下，所述施用步骤在至少2年内进行不超过1次。在一些情况下，所述施用步骤是一次性注射。在一些情况下，所述方法还包括在施用所述组合物之前，测定所述受试者对阿柏西普的应答。在一些情况下，所述混悬液包含药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，所述赋形剂包括表面活性剂或稳定剂。在一些情况下，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基二甲基氧化胺、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨醇酐、辛苯酚聚醚(octoxynol)、Brij、普朗尼克(pluronic)和聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyl caster oil)。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括苯酚、甘露醇、山梨醇或氯化钠。在一些情况下，所述眼部病况或疾病是新生血管性(湿性)年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)或者与DME相关的糖尿病性视网膜病变。在一些情况下，所述眼部病况或疾病是脉络膜新生血管形成或湿性AMD。在一些情况下，所述方法还包括在施用前将所述混悬液加温至室温。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请特别地和单独地指明通过引用并入。

附图说明

本发明的新特征在所附权利要求中特别地示出。通过参考阐述说明性实施方式的下述详细描述，其中利用本发明的原理，及其附图，将获得对本发明的特征和优点更好的理解：

图1示出了在未处理情况下通过激光照射诱导CNV损伤后的灵长类(非洲绿猴)眼部的示例性眼底图像。通过单激光应用，诱导9个损伤，除了中心斑点以外的所有斑点均使用750mW、50μm、100ms的激光照射，中心斑点使用400mW处理。在激光照射后立即进行彩色眼底照相以记录激光损伤。

图2示出了在使用仅含有缓冲剂的载体对照或AAV2.7m8-阿柏西普玻璃体内(IVT)注射后第70天的荧光血管造影的示例性眼底图像。使用AAV2.7m8-阿柏西普处理的猴与仅注射载体对照的猴相比显示出更少的IV级损伤和更低级别的损伤。

图3示出了与仅含有缓冲剂的载体对照相比，用作阳性对照的

图4示出了玻璃体内注射后第14天(浅灰色柱子)和第28天(深灰色柱子)，使用载体对照、AAV2.7m8-阿柏西普或AAV2.7m8-sVEGFR-1玻璃体内注射处理的猴中IV级CNV损伤的百分比。在第14天和第28天时，与使用载体对照处理的猴相比，使用玻璃体内AAV2.7m8-阿柏西普注射处理的猴显示出IV级损伤的量显著减少，这与图3中所示的阳性对照的结果类似。与载体对照相比，使用AAV2.7m8-sVEGFR-1玻璃体内注射处理未显示出IV级损伤的任何显著减少。

图5示出了阿柏西普的核酸序列。

图6示出了可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1或sVEGFR-1)的核酸序列。sVEGFR-1是VEGF受体1的剪接变体。

具体实施方式

下面参考用于说明的示例应用来描述若干方面。应当理解的是，阐述了很多具体细节、关系和方法以提供对本申请所述特征的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地意识到，可以在没有一个或多个具体细节或使用其他方法的情况下实施本申请所述的特征。本申请所述的特征不受所示动作或事件顺序的限制，因为一些动作可以以不同顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。而且，并非所有所示动作或事件都是根据本申请所述的特征实施方法所需要的。

本公开涉及治疗或预防眼部疾病或病症的药物组合物和方法，其包括通过向灵长类(例如，猴或人)的眼部玻璃体内注射而施用基因疗法、载体或构建体，所述基因疗法、载体或构建体包含编码阿柏西普、其功能性片段或变体的核酸序列(例如，cDNA)。在玻璃体内注射包含阿柏西普、其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法、载体或构建体后，核酸序列在体内表达，例如在视网膜细胞中，以产生产生治疗作用的阿柏西普融合蛋白、或其功能性片段或变体。

在一些实施方式中，将包含阿柏西普的基因疗法、载体或构建体用于在灵长类或人类受试者中治疗或预防一种或多种眼部疾病或病况，包括但不限于新生血管性(湿性)年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、和/或在DME患者中的糖尿病性视网膜病变(DR)、视网膜静脉阻塞或者涉及新生血管形成的任何其他相关的眼部疾病或病况(例如，脉络膜新生血管形成(CNV))。在一些实施方式中，本申请所述的方法用于治疗对阿柏西普(例如，

在一些实施方式中，通过玻璃体内或视网膜下施用适于基因疗法的药物组合物，例如具有变体或经修饰的衣壳蛋白VP1(例如，7m8衣壳变体)的重组腺相关病毒(rAAV)，所述药物组合物包含编码蛋白或多肽的核酸序列，所述蛋白或多肽与阿柏西普、或其功能性片段或变体具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。这样的同源性可以是基于阿柏西普的核酸序列、氨基酸序列、空间构象或蛋白结构。

阿柏西普的蛋白序列是公众可以从DrugBank数据库(登录号DB08885)获得的。在一些实施方式中，阿柏西普指编码融合蛋白的核酸序列，如美国专利公开号2014/0371438中所披露的(图5)。

与蛋白注射相比，基因疗法的一个优点是基因疗法提供了延长的或持续的治疗剂(例如，阿柏西普)释放，以及在一些实施方式中，不需要多次或重复注射。这种延长的或持续的阿柏西普释放是编码阿柏西普融合蛋白的核酸序列的递送所造成，所述核酸序列在体内表达以提供治疗作用。在一些实施方式中，由递送到视网膜细胞中的异源核酸对阿柏西普的表达可以持续至少1年，超过1年，至少2、3、4、5、10年或更多年。

在一些实施方式中，rAAV可以包含衣壳变体蛋白，其增加其对眼中的靶细胞或靶组织(例如，视网膜细胞)的感染性，允许更有效递送编码治疗性转基因(如阿柏西普融合蛋白或者其功能性蛋白或变体)的核酸序列至靶细胞或靶组织，在那里治疗性转基因可以表达一段时间(例如，至少1、1.5、2、3、4、5、10年或更多年)。如本申请所公开的基因疗法可以靶向感兴趣的特定组织或细胞类型(例如，感光细胞)，这可以有助于最小化脱靶效应，或提供治疗性转基因(如阿柏西普)的更高靶向性的体内递送。

通过基因疗法在体内延长或持续递送阿柏西普，与目前采用的标准疗法(例如，蛋白注射剂或基于非基因疗法的治疗)相比，能够在一段时间内以更少剂量施用包含编码阿柏西普、其功能性片段、突变体或变体的核酸序列的药物组合物。在一些实施方式中，包含编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法的施用的剂量的总数量是在至少1.5年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或者至少10年内不超过1个单位剂量。在一些实施方式中，在患者一生中仅施用一次或一回包含编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法。在一些实施方式中，一次性施用包含编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法可以在患者中产生持续超过1年或者超过2、3、4、5、6、7、8、9或10年的治疗作用。在一些实施方式中，在至少2年或更多年内，在至少3年或更多年内，在至少4年或更多年内，在至少5年或更多年内，在至少6年或更多年内，在至少7年或更多年内，在至少8年或更多年内，在至少9年或更多年内或者在至少10年或更多年内给予患者不超过一次包含编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法。在一些实施方式中，向在接受本申请公开的基因疗法之前对阿柏西普具有应答或接受

在一些实施方式中，一次性施用包含编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的基因疗法使患者接受

本公开的术语仅用于描述特定情况的目的，并且并非旨在限制本公开的组合物、方法和组分。

除非另有说明，本申请所述的本公开的组合物和方法可以使用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、免疫化学和眼科技术的常规技术和描述，其在本领域从业人员的技能范围内。这样的常规技术包括用于观察和分析视网膜、或受试者的视力、克隆和增殖重组病毒、药物组合物的配置，以及生物化学纯化和免疫化学的方法。通过参考本申请的实施例可以获得适合技术的具体说明。然而，当然也可以使用等同的常规程序。这样的常规技术和描述可见于标准实验室手册如Green等，编著，Genome Analysis:A LaboratoryManual Series(Vols.I-IV)(1999)；Weiner等，编著，Genetic Variation:ALaboratoryManual(2007)；Dieffenbach,Dveksler,编著，PCR Primer:ALaboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:AMolecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2002)(其均来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Stryer,L.,Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,N.Y.(1995)；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach”IRL Press,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry,第3版,W.H.Freeman Pub.,NewYork(2000)；以及Berg等，Biochemistry,第5版,W.H.Freeman Pub.,New York(2002)，其均出于所有目的通过引用整体并入本申请。

在一些实施方式中，本申请公开了药物制剂，所述药物制剂包含：(a)适于基因疗法的重组腺相关病毒(rAAV2)病毒粒子，其包含：(i)变体AAV2衣壳蛋白，其中所述变体AAV2衣壳蛋白包含在位置587至588之间的LGETTRP插入物，并且其中所述变体衣壳蛋白赋予相对于包含相应的非变体AAV2衣壳蛋白的AAV病毒粒子对眼部细胞的感染性的增加；和(ii)编码阿柏西普、其功能性片段或变体的异源核酸序列；以及(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所编码的基因产物是与阿柏西普具有至少80％、85％、90％、95％或99％同源性的融合蛋白或多肽。

本申请还公开了治疗已适应或批准使用阿柏西普治疗的眼部病况或疾病的方法，所述方法包括通过玻璃体内注射向受试者的眼部施用适于基因疗法的药物制剂，即体内递送如本申请所述的编码阿柏西普的核酸序列。

本申请还公开了药物组合物，其包含编码与阿柏西普具有至少80％、85％、90％、95％或99％同源性的融合蛋白或多肽的基因疗法或载体，所述药物组合物可以冻干或以混悬液形式提供。在一些实施方式中，药物组合物的冻干形式或混悬液提供在具有分别用于复溶药物组合物或用于稀释的缓冲剂的试剂盒中。

本申请还公开了药物组合物，其包含编码与阿柏西普具有至少80％、85％、90％、95％或99％同源性的融合蛋白或多肽的基因疗法或载体，所述药物组合物作为冷藏混悬液提供。在一些实施方式中，药物组合物的冷藏混悬液提供在具有用于稀释药物组合物的缓冲剂的试剂盒中。

本申请还公开了适于用于减少脉络膜新生血管形成的基因疗法的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)变体AAV2衣壳蛋白，所述变体AAV2衣壳蛋白包含插入在AAV2的氨基酸位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP的肽插入物，其中所述肽插入物赋予相对于包含相应的非变体或未经修饰的AAV2衣壳蛋白的AAV病毒粒子对眼部细胞的感染性的增加；(b)编码多肽或治疗性转基因的异源核酸序列，所述多肽或治疗性转基因与阿柏西普、或其功能性片段或变体具有至少80％同源性。

本申请还公开了治疗眼部病况或疾病的方法，所述方法包括向人类受试者的眼部施用如本申请所述的适于基因疗法和体内递送用于表达阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列的rAAV病毒粒子；其中所述人类受试者此前已被诊断患有与新生血管形成相关的眼部病况。在一些实施方式中，向对阿柏西普具有应答或使用

在一些实施方式中，本申请公开了方法和药物制剂，所述方法和药物制剂包含：(a)适于基因疗法的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(i)变体AAV衣壳蛋白，所述变体AAV衣壳蛋白包含在对应于AAV2中衣壳蛋白VP1的氨基酸570-611的位置处的选自LGETTRP、NETITRP、KAGQANN、KDPKTTN、KDTDTTR、RAGGSVG、AVDTTKF和STGKVPN的氨基酸插入物，并且其中所述变体衣壳蛋白赋予相对于包含相应的非变体AAV2衣壳蛋白的AAV病毒粒子对眼部细胞(例如，感光细胞或视网膜色素上皮细胞)的感染性的增加；和(ii)编码阿柏西普的异源核酸序列；以及(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所编码的基因产物是与阿柏西普、或其功能性片段或变体具有至少80％同源性的融合蛋白或多肽。在一些实施方式中，药学上可接受的赋形剂包括表面活性剂(例如，非离子表面活性剂、普朗尼克、泊洛沙姆或聚山梨醇酯)，其阻止本申请所公开的药物组合物中的聚集。

除非另有定义，否则本申请所使用的所有技术术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本申请所使用的术语仅用于描述特定情况的目的并且并非旨在是限制性的。如在本申请中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”还旨在包括复数形式。此外，对于在详细说明书和/或权利要求书中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的程度，这样的术语旨在以与术语“包含(comprising)”类似的方式是包含性的(inclusive)。如本申请所使用的术语“包含(comprising)”与“包括(including)”或“含有(containing)”同义，并且是包含性的或开放式的。

除非另有说明，否则本申请中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。如在本申请中所使用的，术语“约”某个数字是指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”某个范围是指该范围减去其最低值的10％和加上其最高值的10％。

术语“受试者”、“患者”或“个体”指灵长类，包括非人灵长类，如猴，例如非洲绿猴和恒河猴，以及人。在优选的实施方式中，受试者是人类或人类患者。

如在本申请中所使用的，术语“处理/治疗(treat)”、“处理/治疗(treating)”、“处理/治疗(treatment)”、“改善(ameliorate)”或“改善(ameliorating)”以及其他语法等同物包括减轻、减少或改善疾病或病况的症状，预防另外的症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况，例如阻止疾病或病况的发展、缓解疾病或病况、引起疾病或病况的消退、缓解由疾病或病况引起的病况，或停止疾病或病况的症状，并旨在包括预防。该术语还包括实现治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处是指根除或改善所治疗的潜在疾病。此外，治疗性益处通过根除或改善与潜在疾病相关的一种或多种生理症状而实现，使得在患者中观察到改善，尽管在一些实施方式中，患者仍患有该潜在疾病。对于预防性益处，向处于发生特定疾病的风险的患者或者向报告疾病的一种或多种生理症状的患者施用药物组合物，即使尚未做出对该疾病的诊断。

术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等，如在本申请中所使用的，可以指用于使得能够将治疗或药物组合物递送至生物作用的期望部位的方法。这些方法包括向眼部玻璃体内或视网膜下注射。

术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学上的有效量”，如在本申请中所使用的，可以指所施用的足量的至少一种药物组合物或化合物，其将在某种程度上缓解所治疗的疾病或病况的一种或多种症状。

术语“药学上可接受的”，如在本申请中所使用的，可以指物质，如载体或稀释剂，其不消除本申请所公开的化合物的生物活性或性质，并且是相对无毒的(即，当向个体施用该物质时，其既不引起不期望的生物学效应，也不以有害的方式与含有其的组合物中的任何组分发生相互作用)。

术语“药物组合物”或简称为“组合物”，如在本申请中所使用的，可以指生物活性化合物，其任选地与至少一种药学上可接受的化学成分(例如但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、混悬剂、增稠剂、赋形剂等)混合。

如在本申请中所使用的，“AAV”载体或“rAAV载体”指腺相关病毒(AAV)载体或重组AAV(rAAV)载体，其包含非AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸，如编码治疗性转基因(例如，阿柏西普)的核酸序列)，通常是用于细胞的基因转化的感兴趣的序列。通常，异源多核苷酸的翼侧是至少一个，通常是两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒两者。rAAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常是通过野生型AAV的所有衣壳蛋白)和多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，野生型AAV基因组之外的多核苷酸，如待向哺乳动物细胞递送的转基因)，则其通常称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，生产rAAV颗粒必然包括生产rAAV载体，因为这样的载体包含在rAAV颗粒内。

术语“包装”如在本申请中所使用的可以指指一系列细胞内事件，其可导致rAAV颗粒的组装和衣壳化。

AAV“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本申请中称为AAV“包装基因”。

术语“多肽”可以包括天然存在的和非天然存在的蛋白(例如，融合蛋白)两者、肽、片段、突变体、衍生物及其类似物。多肽可以是单体、二聚体、三聚体或多聚体。此外，多肽可以包含多个不同结构域，其各自具有一种或多种不同的活性。为避免引发疑虑，“多肽”可以是超过2个氨基酸的任何长度。

如在本申请中所使用的，“多肽变体”或简称为“变体”指其序列含有氨基酸修饰的多肽。在一些情况下，修饰可以是与参照蛋白或多肽(如天然或野生型蛋白)的氨基酸序列相比一个或多个氨基酸的插入、复制、缺失、重排或置换。变体可以具有一个或多个氨基酸点置换，其中在某个位置的单个氨基酸已经变成另一个氨基酸，一个或多个插入和/或缺失，其中在参照蛋白的序列中分别插入或缺失一个或多个氨基酸，和/或氨基酸序列在氨基或羧基末端的任一端或两端的截短。与参照蛋白或未经修饰的蛋白相比，变体可以具有相同或不同的生物学活性。

在一些实施方式中，变体可以与其对应的参照蛋白具有例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的总体序列同源性。在一些实施方式中，变体可以与野生型蛋白具有至少约90％的总体序列同源性。在一些实施方式中，变体显示出至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％的总体序列同一性。

如在本申请中所使用的，“重组体”可以指生物分子，例如基因或蛋白，其(1)已从其天然存在的环境中移除，(2)不与在自然界中所述基因在其中被发现的多核苷酸的全部或部分相关联，(3)与其在自然界中不与之连接的多核苷酸可操作地连接，或者(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可以用于指克隆的DNA分离物，化学合成的多核苷酸类似物，或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这样的核酸编码的蛋白和/或mRNA。因此，例如，由微生物合成的蛋白是重组的，例如，如果其是由细胞中存在的重组基因合成的mRNA合成的。

“可操作地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operablylinked)”或“缀合的(coupled)”可以指遗传元件的并置，其中所述元件处于允许其以预期的方式操作的关系中。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可以与编码区可操作地连接。在启动子与编码区之间可以存在间插残基，只要其功能性关系保持即可。

术语“表达载体”或“表达构建体”或“盒(cassette)”或“质粒”或简称为“载体”可以包括任何类型的遗传构建体，包括AAV或rAAV载体，其含有编码基因产物的核酸或多核苷酸，在其中核酸编码序列的部分或全部能够被转录并且适于基因疗法。转录物可以翻译成蛋白。在一些情况下，其可以部分翻译或者不翻译。在某些方面中，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物两者。在其他方面中，表达仅包括编码感兴趣的基因的核酸的转录。表达载体还可以包含与编码区可操作地连接，以促进蛋白在靶细胞中表达的控制元件。有时可以将控制元件与同其可操作地连接以用于表达的一个或多个基因的组合称为“表达盒”，大量的这些是本领域已知的和可获得的，或者可以由本领域可获得的组件容易地构建。

术语“异源的”可以指遗传型不同于与之比较的其余实体的实体。例如，通过基因工程技术引入到来自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸可以是异源多核苷酸。从其天然编码序列中移除并与未天然发现其与之连接的编码序列可操作地连接的启动子可以是异源启动子。

如在本申请中所使用的，“7m8”指7聚氨基酸序列LGETTRP。

“7m8变体”指rAAV，其可以具有任何血清型，其中氨基酸序列LGETTRP插入衣壳蛋白的溶剂暴露的GH环中。

当将7m8插入rAAV2中时(也称为AAV2.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV2衣壳蛋白的GH环中，例如AAV2衣壳蛋白VP1的位置587和588之间。当将7m8插入rAAV1中时(也称为AAV1.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV1衣壳蛋白的GH环中，例如AAV1衣壳蛋白的氨基酸590和591之间。当将7m8插入rAAV5中时(也称为AAV5.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV5衣壳蛋白的GH环中，例如AAV5衣壳蛋白的氨基酸575和576之间。当将7m8插入rAAV6中时(也称为AAV6.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV6衣壳蛋白的GH环中，例如AAV6衣壳蛋白的氨基酸590和591之间。当将7m8插入rAAV7中时(也称为AAV7.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV7衣壳蛋白的GH环中，例如AAV7衣壳蛋白的氨基酸589和590之间。当将7m8插入rAAV8中时(也称为AAV8.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV8衣壳蛋白的GH环中，例如AAV8衣壳蛋白的氨基酸590和591之间。当将7m8插入rAAV9中时(也称为AAV9.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV9衣壳蛋白的GH环中，例如AAV9衣壳蛋白的氨基酸588和589之间。当将7m8插入rAAV10中时(也称为AAV10.7m8)，7聚氨基酸序列LGETTRP插入AAV10衣壳蛋白的GH环中，例如AAV10衣壳蛋白的氨基酸589和590之间。

本申请中使用的章节标题仅用于组织目的并且不应将其解释为是对所描述的主题内容的限制。

载体

在一些实施方式中，本公开的药物组合物和方法提供了将编码阿柏西普、或其功能性片段或变体的核酸序列(例如，cDNA序列)向有需要的人类受试者或患者(例如，诊断为AMD、RVO、DME的患者)的视网膜细胞的递送。使用递送系统(如rAAV或病毒载体)将治疗性转基因的核酸向患者递送也称为基因疗法。

在一些实施方式中，可以使用任何合适的“载体”(也称为“基因递送”或“基因转移载体”)进行阿柏西普核酸序列的递送。载体(例如，rAAV)、递送载体、基因递送载体或基因转移载体可以包含含有待递送至靶细胞(例如，视网膜细胞，包括光感受器、视网膜神经节细胞、Müller细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞)的多核苷酸的任何合适的大分子或分子复合物。在一些情况下，靶细胞可以是核酸分子或基因被递送到的任何细胞。待递送的多核苷酸可以包含治疗性转基因(如阿柏西普转基因)的编码序列。

本公开的组合物和方法提供了用于将阿柏西普核酸序列递送至非人灵长类或人类受试者的眼或视网膜细胞中的任何合适的方法。在一些情况下，核酸分子、多核苷酸或基因疗法的递送被配置成或适应于玻璃体内注射到非人灵长类或人类受试者的眼中。

在一些实施方式中，合适的载体包括但不限于病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒(AAV)，和逆转录病毒(retroviruses)、逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒、脂质体、含脂质的复合物、纳米颗粒，以及能够向视网膜细胞递送多核苷酸的其他大分子复合物。在一些实施方式中，病毒载体包含与多核苷酸可操作地连接的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子或组成型启动子。

在一些实施方式中，载体包括重组病毒载体，其包含一个或多个核酸分子。如在本申请中所述的，核酸指多核苷酸。核酸和多核苷酸可以互换使用。在一些实施方式中，核酸包括DNA或RNA。在一些情况下，核酸包括用于表达阿柏西普的DNA(例如，cDNA)或RNA。在一些实施方式中，RNA可以包括感兴趣的基因(例如，阿柏西普)的转录物、内含子、非翻译区(UTR)、终止序列等。在其他实施方式中，DNA可以包括但不限于序列如启动子序列、感兴趣的基因(例如，阿柏西普)、UTR、终止序列等。在一些情况下，可以使用DNA和RNA的组合。

在一些实施方式中，本公开提供了作为用于在受试者中递送和表达阿柏西普的载体的重组病毒，如重组腺相关病毒(rAAV)。

在一些实施方式中，可以对任何合适的病毒载体进行工程化或优化，用于与本公开的组合物和方法一起使用。例如，可以改变来源于腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)的重组病毒载体，使得其在人类或灵长类受试者中是复制缺陷性的。在一些实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的方法获得杂合病毒载体系统并将其用于向视网膜细胞递送编码阿柏西普的核酸。在一些实施方式中，病毒递送系统或基因疗法可以将包含阿柏西普基因的核酸序列整合至靶细胞的基因组(例如，视网膜细胞的基因组)中，导致基因随时间稳定基因表达。在一些实施方式中，阿柏西普基因未整合至靶细胞的基因组中，并且由引入靶细胞中的质粒或载体表达。

在一些实施方式中，用于将阿柏西普的核酸序列递送至视网膜细胞的合适的病毒载体是AAV或rAAV，其是小的无包膜单链DNA病毒。rAAV是非致病性人细小病毒并且可以将其制成在复制方面依赖于辅助病毒(包括腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和CMV)。暴露于野生型(wt)AAV不与任何人类病理相关，或者未知暴露于野生型(wt)AAV引起任何人类病理，并且在一般人群中是常见的，这使得AAV或rAAV成为用于基因疗法的合适的递送系统。用于递送治疗性转基因(例如，阿柏西普)的基因疗法的AAV和rAAV可以具有任何血清型。在一些实施方式中，本公开的药物组合物和方法提供任何合适的AAV血清型的用途，所述AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、AAV-DJ及其任何杂合或嵌合AAV。在一些实施方式中，所使用的血清型是基于病毒的趋性，或对感兴趣的靶细胞的感染性。在一些实施方式中，AAV2或rAAV2用于通过玻璃体内或视网膜下注射将编码阿柏西普的核酸序列递送至受试者的眼或视网膜细胞中。在一些实施方式中，rAAV2.7m8用于将阿柏西普的核酸序列递送至受试者的视网膜细胞中。

在一些实施方式中，将含有对靶细胞(例如，视网膜细胞)的感染性增加的变体衣壳蛋白的AAV或rAAV病毒、颗粒或病毒粒子用于增加视网膜细胞的转导或用于增加基因递送对受试者中的视网膜细胞的靶向。在一些实施方式中，rAAV病毒粒子包含在AAV衣壳蛋白的衣壳蛋白GH环/环IV中的氨基酸修饰。在一些情况下，修饰位点是AAV衣壳蛋白GH环/环IV的溶剂可及部分。对于AAV衣壳的GH环/环IV的描述，参见，例如，van Vliet等，(2006)Mol.Ther.14:809；Padron等，(2005)J.Virol.79:5047；和Shen等，(2007)Mol.Ther.15:1955。多种AAV衣壳变体是已知的，包括7m8变体。在一些实施方式中，rAAV病毒粒子包含变体AAV衣壳蛋白，其相对于对应的母体AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白的GH环中含有5个氨基酸至11个氨基酸(例如，7个氨基酸序列)的插入物，并且其中与含有相应母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对视网膜细胞的感染性相比，变体衣壳蛋白赋予对视网膜细胞增加的感染性。在一些实施方式中，可以将下述氨基酸序列中的任一种插入衣壳蛋白的GH环中：LGETTRP(7m8)、NETITRP、KAGQANN、KDPKTTN、KDTDTTR、RAGGSVG、AVDTTKF和STGKVPN。在一些实施方式中，将氨基酸序列LGETTRP(7m8)、NETITRP、KAGQANN、KDPKTTN、KDTDTTR、RAGGSVG、AVDTTKF和STGKVPN中的任一种插入rAAV中VP1衣壳蛋白的溶剂暴露的GH环中。在一些实施方式中，将含有阿柏西普的rAAV.7m8用于基因疗法。

在一些实施方式中，可以将下述氨基酸序列中的任一种：NETITRP、KAGQANN、KDPKTTN、KDTDTTR、RAGGSVG、AVDTTKF和STGKVPN，插入到下述位置处以产生用于基因疗法的rAAV变体：AAV2衣壳蛋白的位置587和588之间；AAV1衣壳蛋白的氨基酸590和591之间；AAV5衣壳蛋白的氨基酸575和576之间；AAV6衣壳蛋白的氨基酸590和591之间；AAV7衣壳蛋白的氨基酸589和590之间；AAV8衣壳蛋白的氨基酸590至591之间；AAV9衣壳蛋白的氨基酸588和589之间；或者AAV10衣壳蛋白的氨基酸589和590之间。

在一些实施方式中，编码基因产物(如阿柏西普)的核酸可以在启动基因转录的启动子的转录控制下。在一些实施方式中，启动子是“强”或组成型活性启动子(例如，CMV启动子)。在一些实施方式中，将连接蛋白36启动子用于驱动治疗性转基因(例如，阿柏西普)的表达。在一些实施方式中，可以将组织特异性启动子用于在特定组织或细胞(如视网膜细胞)中实现转录，以降低对非靶向的细胞的潜在毒性或不期望的作用。在一些实施方式中，用于产生rAAV病毒的重组病毒和/或质粒可以包含其他转录或调控元件，如poly A(多聚腺苷酸化)序列、非翻译区(UTR)、3’UTR或终止序列。在一些实施方式中，使用内部核糖体进入位点(IRES)或允许共表达两种或更多种蛋白质或产生多基因的相似元件，或多顺反子mRNA，可以从载体或质粒表达超过一种基因。

在一些实施方式中，用于产生rAAV病毒的rAAV和/或质粒包含下述核酸元件：第一ITR序列；启动子序列；内含子序列；第一UTR序列；编码阿柏西普的序列；第二UTR序列；polyA序列；和第二ITR序列。在一些实施方式中，在这些核酸元件的每一个之间使用接头序列。在一些实施方式中，编码阿柏西普的序列包含编码阿柏西普融合蛋白或其功能性片段的序列。

在一些实施方式中，作为载体基因组测量本公开的病毒载体。在一些情况下，本公开的重组病毒的单位剂量包括1×10

在一些实施方式中，选择较低的量或范围的载体基因组用于单位剂量以避免聚集。在一些实施方式中，选择较高的量或范围的载体基因组用于单位剂量，使得可以使用更小体积用于注射。较小的注射体积(例如，小于50、40、30、20、10或5μL)可以有助于减少眼压的变化和与玻璃体内注射相关的其他不良反应。在一些实施方式中，较高的rAAV浓度还有助于确保治疗性转基因向靶细胞的有效递送。

在一些情况下，本公开的重组病毒是约1E10、约1.5E10、约2E10、约2.5E10、约3E10、约3.5E10、约4E10、约4.5E10、约5E10、约5.5E10、约6E10、约6.5E10、约7E10、约7.5E10、约8E10、约8.5E10、约9E10、约9.5E10、约10E10、约1E11、约1.5E11、约2E11、约2.5E11、约3E11、约3.5E11、约4E11、约4.5E11、约5E11、约5.5E11、约6E11、约6.5E11、约7E11、约7.5E11、约8E11、约8.5E11、约9E11、约9.5E11、约10E11、约1E12、约1.3E12、约1.5E12、约2E12、约2.1E12、约2.3E12、约2.5E12、约2.7E12、约2.9E12、约3E12、约3.1E12、约3.3E12、约3.5E12、约3.7E12、约3.9E12、约4E12、约4.1E12、约4.3E12、约4.5E12、约4.7E12、约4.9E12、约5E12、约5.1E12、约5.3E12、约5.5E12、约5.7E12、约5.9E12、约6E12、约6.1E12、约6.3E12、约6.5E12、约6.7E12、约6.9E12、约7E12、约7.1E12、约7.3E12、约7.5E12、约7.7E12、约7.9E12、约8E12、约8.1E12、约8.3E12、约8.5E12、约8.7E12、约8.9E12、约9E12、约9.1E12、约9.3E12、约9.5E12、约9.7E12、约9.9E12、约10E12、约10.1E12、约10.3E12、约10.5E12、约10.7E12、约10.9E12、约11E12、约11.5E12、约12E12、约12.5E12、约13E12、约13.5E12、约14E12、约14.5E12、约15E12、约15.5E12、约16E12、约16.5E12、约17E12、约17.5E12、约18E12、约18.5E12、约19E12、约19.5E12、约20E12、约20.5E12、约30E12、约30.5E12、约40E12、约40.5E12、约50E12、约50.5E12、约60E12、约60.5E12、约70E12、约70.5E12、约80E12、约80.5E12、约90E12、约95E12或者约100E12，其中E是底数10的乘方的简写，并且xEy指x乘以底数10的y次方/幂。

在一些实施方式中，本公开的药物组合物包含至少5E11、至少5.5E11、至少6E11、至少6.5E11、至少7E11、至少7.5E11、至少8E11、至少8.5E11、至少9E11、至少9.5E11、至少10E11、至少1E12、至少1.3E12、至少1.5E12、至少2E12、至少2.1E12、至少2.3E12、至少2.5E12、至少2.7E12、至少2.9E12、至少3E12、至少3.1E12、至少3.3E12、至少3.5E12、至少3.7E12、至少3.9E12、至少4E12、至少4.1E12、至少4.3E12、至少4.5E12、至少4.7E12、至少4.9E12、至少5E12、至少5.1E12、至少5.3E12、至少5.5E12、至少5.7E12、至少5.9E12、至少6E12、至少6.1E12、至少6.3E12、至少6.5E12、至少6.7E12、至少6.9E12、至少7E12、至少7.1E12、至少7.3E12、至少7.5E12、至少7.7E12、至少7.9E12、至少8E12、至少8.1E12、至少8.3E12、至少8.5E12、至少8.7E12、至少8.9E12、至少9E12、至少9.1E12、至少9.3E12、至少9.5E12、至少9.7E12、至少9.9E12、至少10E12、至少10.1E12、至少10.3E12、至少10.5E12、至少10.7E12、至少10.9E12、至少11E12、至少11.5E12、至少12E12、至少12.5E12、至少13E12、至少13.5E12、至少14E12、至少14.5E12、至少15E12、至少15.5E12、至少16E12、至少16.5E12、至少17E12、至少17.5E12、至少18E12、至少18.5E12、至少19E12、至少19.5E12、至少20E12、至少20.5E12、至少30E12、至少30.5E12、至少40E12、至少40.5E12、至少50E12、至少50.5E12、至少60E12、至少60.5E12、至少70E12、至少70.5E12、至少80E12、至少80.5E12、至少90E12、至少95E12或者至少100E12的载体基因组的重组病毒，其中E是底数10的乘方的简写，并且xEy指x乘以底数10的y次方/幂。

在一些实施方式中，单位剂量包含2E12至6E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包含约1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12或9.5E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包含1E12至1.5E12、1.5E12至2E12、2E12至2.5E12、2.5E12至3.0E12、3.0E12至3.5E12、3.5E12至4.0E12、4.0E12至4.5E12、4.5E12至5.0E12、5.0E12至5.5E12、5.5E12至6.0E12、6.0E12至6.5E12、6.5E12至7.0E12、7.0E12至7.5E12、7.5E12至8.0E12、8.0E12至8.5E12、8.5E12至9.0E12、9.0E12至9.5E12或者9.5E12至10E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包含至少1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12或9.5E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包含不超过1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12或9.5E12的载体基因组。

在一些实施方式中，使用感染复数(MOI)测量本公开的病毒载体。在一些情况下，MOI指载体或病毒基因组与可以向其递送核酸的细胞的比率或乘积。在一些情况下，MOI是1×10

在一些实施方式中，可以在不使用病毒(即，使用非病毒载体)的情况下递送核酸，并且可以测量为核酸的量。通常，可以将任何合适的量的核酸与本公开的药物组合物和方法一起使用。在一些情况下，核酸是至少1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或者5g。在一些情况下，核酸可以是至多约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或者5g。

在一些实施方式中，可以使用自身互补的载体(sc)。使用自身互补的AAV载体可以绕开对病毒第二链DNA(viral second-strand)合成的需求并且可以导致转基因蛋白更高的表达速率，如Wu,Hum Gene Ther.2007,18(2):171-82所提供的，其通过引用并入本申请。

在一些方面中，可以产生多种AAV载体，以允许选择用于与阿柏西普转基因一起使用的最佳血清型和启动子。

在一些情况下，载体可以是靶向性载体，特别是靶向性rAAV(例如，AAV2.7m8)，其显示出对特定细胞更高的感染性，如视网膜细胞、或光感受器、视网膜神经节细胞、Müller细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。用于本公开的病毒载体可以包括在受试者中显示出低毒性和/或低免疫原性并且在受试者(例如，人类患者)中表达治疗有效量的阿柏西普蛋白的那些。

本申请公开了用于使用含有7m8变体衣壳蛋白或rAAV2.7m8和在非人灵长类或人类受试者中编码阿柏西普的核酸序列的rAAV，将编码阿柏西普的核酸递送至受试者的靶视网膜细胞中的药物组合物和方法。在一些情况下，通过基因疗法递送阿柏西普可用于至少部分地改善或预防本申请公开的眼部疾病或病况。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，rAAV变体(例如，7m8变体)的视网膜细胞感染性的增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，视网膜细胞感染性的增加为5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％或者5％至10％。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，rAAV变体的视网膜细胞感染性的增加为至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或者至少2倍。在一些实施方式中，与包含对应的母体AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，感染性的增加为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或者至少10倍。在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，感染性的增加为至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或者至少100倍。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，视网膜细胞感染性的增加为10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍或者10倍至15倍。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，视网膜细胞感染性的增加为2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或者2倍至3倍。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子穿过受试者眼部的ILM的能力相比，本申请所述的衣壳蛋白的氨基酸修饰可以赋予穿过灵长类或人类受试者眼部的内界膜(ILM)的能力的增加。在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在一些实施方式中，与母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白相比，穿过ILM的能力的增加为5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％或者5％至10％。

在一些实施方式中，与包含对应的母体AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或者至少2倍。在一些实施方式中，与包含对应的母体AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或者至少10倍。在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或者至少100倍。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍或者10倍至15倍。

在一些实施方式中，与包含对应的母体或未经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力的增加为2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或者2倍至3倍。

阿柏西普

在一些实施方式中，将基因疗法用于递送治疗性转基因，所述治疗性转基因包含编码阿柏西普或当向非人灵长类或人类受试者的眼部或眼部的玻璃体施用时表达阿柏西普的核酸序列。在一些实施方式中，含有本申请所述的衣壳变体(例如，AAV2.7m8)的rAAV包含编码阿柏西普的异源核酸序列，用于在向受试者玻璃体内或视网膜下注射后，将阿柏西普基因的序列递送至视网膜细胞中。在一些实施方式中，将包含阿柏西普基因的rAAV配制用于基因疗法和玻璃体内注射。在一些实施方式中，阿柏西普基因指其功能性片段或变体。在一些实施方式中，阿柏西普的核酸序列来源于其氨基酸序列。在一些实施方式中，对阿柏西普的核酸序列进行密码子优化，以改善其在受试者中的表达。

可以使用本领域已知的任何方法实现密码子优化。密码子优化指通过用在宿主细胞中更高频使用或最高频使用的密码子替代天然序列的至少一个密码子(例如，大约或者超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100或更多个密码子)而改变核酸序列，同时保持天然氨基酸序列，以增强基因在感兴趣的靶细胞或宿主细胞(例如，人视网膜细胞)中的表达的过程。密码子使用表是易于获得的，包括例如http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table的GenScript密码子使用频率表工具；http://www.kazusa.or.jp/codon/的密码子使用数据库；以及Nakamura,Y.等，“Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year 2000”Nucl.AcidsRes.28:292(2000)。

阿柏西普是115kDa的融合蛋白，其可以是糖基化的。阿柏西普包含与人VEGFR-1和VEGFR-2的胞外VEGF受体序列融合的IgG骨架，并且通过以与其天然或内源性受体相比更高的亲和性结合VEGF-A，与可溶性诱饵受体相类似的发挥功能。参见例如，StewartMW.Aflibercept(VEGF Trap-eye):the newest anti-VEGFdrug.Br.J.Ophthalmol.2012Sep；96(9):1157-8。阿柏西普对VEGF的高亲和性干扰或破坏天然或内源性VEGF受体随后的结合和激活。VEGF活性降低可以导致血管生成减少和血管通透性降低。阿柏西普对胎盘生长因子PIGF和VEGF-B的抑制也可以有助于治疗血管生成病况。PIGF已经与血管生成相关联并且可以在多种病况中提高，如湿性AMD。VEGF-B过表达可以与血液-视网膜屏障的破坏和视网膜血管生成相关联。因此，VEGF-A、VEGF-B和PIGF的抑制可以均有助于阿柏西普的效力。

本申请所公开的基因产物由阿柏西普、其功能性片段、突变体、或变体构成。阿柏西普的氨基酸序列是本领域已知的：C

阿柏西普的核酸序列(SEQ ID NO:2)如图5中所示。在一些实施方式中，对阿柏西普的核酸序列进行密码子优化用于在灵长类或人类受试者中表达。已在文献例如Kanda A,Noda K,Saito W,Ishida S.Aflibercept Traps Galectin-1,an Angiogenic FactorAssociated with Diabetic Retinopathy.Scientific Reports 5:17946(2015)中对与阿柏西普的氨基酸序列对应的合成基因的构建进行了描述(描述了“由IDT(Coralville,IA)产生VEGF-Trap

如在本申请中所使用的，“阿柏西普”指与上文列出的阿柏西普的氨基酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或者100％同源性的多肽或蛋白序列，或者其功能性片段或变体或突变体。同源性指两个序列之间的比对的残基的保守％，所述序列包括但不限于功能性片段，包含插入、缺失、置换、假片段、假基因的序列，剪接变体或人工优化的序列。

在一些情况下，阿柏西普的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的阿柏西普氨基酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同源性。在一些实施方式中，将本申请公开的基因疗法或rAAV中使用的核酸序列与上文所示阿柏西普氨基酸序列的对应cDNA序列进行比较，显示阿柏西普的核酸序列(例如，SEQ ID NO:2)之间至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的序列同源性。在一些情况下，阿柏西普是与阿柏西普具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的空间同源性(例如，在其二级、三级和四级结构或构象方面)。在一些情况下，本申请所公开的药物组合物和方法中的阿柏西普与在标准护理中使用的阿柏西普具有至多80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的空间同源性(例如，在二级、三级和四级结构或构象方面)。

在一些情况下，如包括在基于如包含本申请所公开的衣壳变体(例如，7m8变体)的rAAV的基因疗法中的阿柏西普基因产物或阿柏西普转基因编码与SEQ ID NO:1的上述氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性的蛋白、融合蛋白或多肽，或阿柏西普的对应cDNA序列之间(例如，在基因疗法中使用的阿柏西普序列的cDNA与SEQ ID NO：2相比)具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同源性。在一些实施方式中，本申请公开的方法和药物组合物包含阿柏西普的功能性片段或者其变体或突变体。在一些实施方式中，对阿柏西普的核酸序列进行修饰或密码子优化以增强其在体内的活性、表达、稳定性和/或溶解性。

在一些实施方式中，将AAV2.7m8用作用于阿柏西普的基因疗法或递送系统。AAV2.7m8-阿柏西普指包含在rAAV2的衣壳蛋白VP1中的位置587和588之间的7m8插入物和编码阿柏西普的核酸序列的rAAV2。

药物组合物

在一些实施方式中，药物组合物是含有一种或多种活性成分(例如，包含编码阿柏西普融合蛋白或者其片段或变体的核酸序列的AAV2.7m8)和一种或多种赋形剂、载体、稳定剂或填充剂(bulking agent)的制剂，所述制剂适于通过玻璃体内或视网膜下注射向人类患者施用以达到期望的治疗性或预防性作用。

在一些实施方式中，包含rAAV或AAV2.7m8和编码阿柏西普融合蛋白或者其片段或变体的核酸序列的药物组合物作为复溶的均相溶液提供。在一些实施方式中，溶液可以是混悬液。在一些实施方式中，溶液是等渗的。在其他实施方式中，包含rAAV或AAV2.7m8和编码阿柏西普融合蛋白或者其片段或变体的核酸序列的药物组合物以冻干形式提供，并且在向患者施用前复溶。在一些实施方式中，如本申请所公开的治疗或预防眼部疾病或病况的方法包括首先在缓冲液中复溶、溶解或增溶冻干药物组合物，所述冻干药物组合物包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码阿柏西普融合蛋白或者其功能性片段或变体的核酸序列。在一些实施方式中，这样的冻干药物组合物还可以包含冷冻保护剂、表面活性剂、盐、稳定剂或其任何组合。在一些实施方式中，提供含有药物组合物的均相溶液作为预充式注射器。

在一些实施方式中，提供本申请公开的药物组合物作为混悬液。在一些实施方式中，混悬液是溶液。在一些实施方式中，混悬液是冷藏的。在一些实施方式中，如本申请所公开的治疗或预防眼部疾病或病况的方法包括在向患者施用或玻璃体内注射之间将冷藏的混悬液加温至室温和/或搅拌所述混悬液以确保均匀分布。在一些实施方式中，在向患者施用前对混悬液进行稀释。在一些实施方式中，这样的药物组合物包含表面活性剂、盐、稳定剂或其任何组合。在一些实施方式中，提供含有药物组合物的混悬液作为预充式注射器。

在一些实施方式中，提供本申请所述的基因疗法或药物组合物作为混悬液或冷藏混悬液。在一些实施方式中，混悬液包含药学上可接受的赋形剂，例如表面活性剂、甘油、非离子表面活性剂、缓冲剂、乙二醇、盐及其任何组合。在一些实施方式中，使用盐酸和氢氧化钠调节溶液的pH。在一些实施方式中，冷藏的缓冲液处于中性pH，或6.5至7.5的pH。在一些实施方式中，冷藏的缓冲液的pH略偏碱性(例如，pH约7.5、8、8.2、8.4、8.5或9)。在一些实施方式中，混悬液或溶液的pH略偏酸性(例如，pH约6.5、6.3、6.1、6、5.5或5)。在一些实施方式中，混悬液是溶液。在一些实施方式中，混悬液包含胶束。在一些实施方式中，施用前对混悬液进行搅拌和/或加温至室温。

在一些实施方式中，提供包含含有rAAV(例如，AAV2.7m8)和阿柏西普核酸序列的药物组合物的基因疗法作为试剂盒，所述试剂盒包含冻干的或冷冻干燥的本申请所公开的药物组合物(例如，在小瓶中的一个单位剂量)以及用于溶解、稀释和/或复溶所述冻干的药物组合物的溶液。在一些实施方式中，用于复溶或稀释的溶液可以作为预充式注射器提供。在一些实施方式中，试剂盒包含含有rAAV(例如，AAV2.7m8)的冷冻干燥的或冻干的药物组合物以及用于将所述药物组合物复溶至期望浓度或体积的溶液。在一些实施方式中，试剂盒包含有助于防止本申请公开的药物组合物复溶时聚集的缓冲剂。在一些实施方式中，在预充式注射器中提供药物组合物。在一些实施方式中，试剂盒包含双室注射器或容器，其中室之一含有用于溶解或稀释药物组合物的缓冲剂。在一些实施方式中，试剂盒包含用于注射的注射器。在一些实施方式中，在施用前将复溶的溶液过滤。在一些实施方式中，试剂盒包含用于向患者施用前将复溶的药物组合物过滤的滤器或过滤注射器。

在一些实施方式中，为了贮存稳定性和操作便利性，可以将包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码阿柏西普融合蛋白的核酸序列的药物组合物配制成在向受试者施用前可以使用盐水、缓冲剂或水复溶的冻干的、冷冻干燥的或真空干燥的粉剂。或者，可以将药物组合物配制成水溶液，如混悬液或均相溶液。药物组合物可以含有包含编码阿柏西普的核酸序列的rAAV病毒粒子或颗粒。在一些实施方式中，可以使用不同病毒或递送系统(例如，基于纳米粒子或脂质的复合物)递送编码阿柏西普的核酸序列。可以使用各种赋形剂，如磷酸盐、PBS或Tris缓冲剂、乙二醇、甘油、盐水、表面活性剂(例如，普朗尼克或聚山梨醇酯)或其任何组合使药物组合物稳定。此外，冷冻保护剂(如醇)可以用作冻干的冷冻或干燥条件下的稳定剂。在一些实施方式中，提供基因疗法作为混悬液或冷藏的混悬液。

在一些实施方式中，包含如本申请所公开的阿柏西普基因疗法的冻干药物组合物的混悬液或复溶形式的体积为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μL。在一些实施方式中，包含如本申请所公开的阿柏西普基因疗法的药物组合物的混悬液的体积为0.1至0.5mL、0.1至0.2mL、0.3至0.5mL、0.5-1.0mL、0.5-0.7mL、0.6至0.8mL、0.8至1mL、0.9至1.1mL、1.0至1.2mL或者1.0至1.5mL。在其他实施方式中，体积不超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5mL。

在一些实施方式中，对本申请公开的药物组合物进行设计、工程化或使其适于通过玻璃体内或视网膜下注射向灵长类(例如，非人灵长类和人类受试者)施用。在一些实施方式中，将包含含有编码阿柏西普的核酸序列的rAAV病毒粒子的药物组合物配制成用于向受试者的眼部进行玻璃体内注射。在一些实施方式中，将药物组合物配制成或复溶为允许玻璃体内注射不超过大约或不超过2、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL的体积的浓度。在一些实施方式中，药物组合物的单位剂量包含不超过大约或不超过2、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μL的体积。在一些实施方式中，本申请公开的治疗方法包括玻璃体内注射约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150μL体积的含有rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码阿柏西普的核酸序列的溶液。

在一些情况下，含有本申请所述的阿柏西普转基因的核酸序列的AAV2.7m8病毒粒子可以是基因疗法药物组合物的组分。在一些实施方式中，可以使用包含如本申请所述的7m8变体衣壳蛋白的任何血清型的rAAV病毒粒子制备冷冻干燥的或冻干的药物组合物或其混悬液。在一些实施方式中，将基因疗法配制成冷藏的混悬液。在一些实施方式中，rAAV病毒粒子是rAAV2。在一些实施方式中，药物组合物的冻干物或混悬液包含rAAV2，所述rAAV2具有7m8变体衣壳蛋白和编码阿柏西普、其功能性片段或变体的DNA序列。在一些实施方式中，混悬液是冷藏的。

在一些实施方式中，本申请公开的药物组合物适于基因疗法或适于将阿柏西普作为治疗剂在人类患者或非人灵长类中进行玻璃体内递送。在一些实施方式中，药物组合物的单位剂量包含1×10

在一些情况下，本公开的药物组合物的单位剂量可以测量为pfu(噬斑形成单位)。在一些情况下，本公开的药物组合物的单位剂量的pfu可以是约1×10

在一些情况下，本公开的病毒载体可以测量为载体基因组(vg)。在一些情况下，本公开的药物组合物的单位剂量可以是1×10

在一些实施方式中，本公开的药物组合物的单位剂量是1×10

在一些实施方式中，本公开的rAAV的单位剂量是2.1×10

在一些实施方式中，本公开的rAAV的单位剂量是1×10

在一些实施方式中，将较低浓度(例如，载体基因组)用于单位剂量以防止聚集，聚集可以在较高浓度下发生。在一些实施方式中，选择较高浓度(例如，较高的载体基因组)用于单位剂量以增加基因疗法的有效性，或者在一次注射或一次性施用基因疗法中最大化递送阿柏西普转基因。在一些实施方式中，本申请公开的药物组合物的更高的浓度允许更小的注射体积，这可以减少与玻璃体内注射相关的不良反应，例如眼压升高、炎症、刺激或疼痛。

在一些情况下，本公开的药物组合物的单位剂量可以使用感染复数(MOI)测量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与可以向其递送核酸的细胞的比率或乘积。在一些情况下，MOI可以是1×10

适合于眼部使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液、混悬液或分散液的无菌粉剂。对于玻璃体内施用而言，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、磷酸盐缓冲液(PBS)和/或等渗剂，例如甘油。在所有情况下，药物组合物必须是无菌的并且应该是流动的，其程度为容易的可注射性(syringability)或可注射性(injectability)存在。其在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须对抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。在一些实施方式中，药物组合物可以包含等渗剂，如盐或甘油。在一些实施方式中，将表面活性剂或稳定剂加入药物组合物以防止聚集。

在一些情况下，赋形剂可以是载体。载体可以是含有例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其任何组合的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，吐温

在一些实施方式中，可用于本公开的药物组合物可以包装在试剂盒中以促进本公开的应用。在一些方面中，本发明的方法提供了包含本公开的重组核酸(例如，含有阿柏西普的核酸序列的rAAV或rAAV2.7m8)的试剂盒。在一些方面中，本发明的方法提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的重组病毒的冻干形式和用于在向患者施用前复溶所述病毒的溶液。在一些实施方式中，试剂盒包含：本申请中提供的重组病毒，以及以治疗有效量的重组病毒向受试者的眼部或视网膜细胞施用的说明书。在一些方面中，试剂盒包含用于施用重组病毒的药学上可接受的盐或溶液。任选地，试剂盒还可以包含标签或单独的插页的形式的合适的操作参数的说明书。例如，试剂盒可以具有标准说明书，告知医师或实验室技师制备单位剂量的重组病毒和/或复溶冻干的组合物。在一些实施方式中，任选地，试剂盒还包含用于施用的装置，如注射器、过滤针、延伸管、套管或视网膜下注射器。

在一些实施方式中，药物组合物作为混悬液或冷藏的混悬液提供。在一些实施方式中，混悬液或冷藏的混悬液在试剂盒中提供，所述试剂盒可以包含注射器或用于稀释的缓冲液。在一些实施方式中，混悬液或冷藏的混悬液作为预充式注射器提供。

在一些实施方式中，任何合适的方法可用于用于如本申请所述的药物组合物的重组病毒(例如，rAAV)的生化纯化。可以从细胞直接或从含有细胞的培养基收获重组AAV病毒。在冻干或配制成混悬剂之前，可以使用各种生化方法纯化病毒，如凝胶过滤、过滤、色谱、亲和纯化、梯度超速离心或体积排阻方法。

适应症

在一些情况下，如本申请所述的包含7m8变体的任何血清型的rAAV病毒粒子(例如，rAAV2.7m8)或其药物组合物可以至少部分地改善与眼部的新生血管形成相关的，或与CNV相关的眼部病况或疾病。在一些实施方式中，将包含衣壳变体蛋白的rAAV病毒粒子用于将阿柏西普、其功能性片段或变体递送至人类受试者的眼部。

阿柏西普融合蛋白已获批的适应症包括新生血管性(湿性)年龄相关的黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿(RVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)和在DME患者中的糖尿病视网膜病变(DR)。在一些情况下，可以将本申请所公开的方法和药物组合物用于预防或治疗已批准或适应使用阿柏西普的眼部病况或疾病。在一些实施方式中，将基因疗法(例如，基于AAV2.7m8的基因疗法)用于治疗或预防对阿柏西普具有应答的眼部病况或疾病，包括但不限于CNV、湿性AMD、干性AMD、DME、RVO、RVO后的黄斑水肿以及在DME患者中的糖尿病视网膜病变。在一些实施方式中，将rAAV基因疗法用于治疗或预防特征在于新生血管形成或CNV的任何眼部病况或病症。在另一个方面中，本公开提供了本申请提供的药物组合物，用于治疗疾病如AMD、DME、RVO、血管生成相关的疾病、癌症、自身免疫学疾病、感染性疾病生物体等。

在一些实施方式中，眼部病况可以是糖尿病性黄斑水肿。糖尿病性黄斑水肿(DME)是由于液体从黄斑内的血管中渗漏导致的糖尿病中的视网膜的肿胀。黄斑是视网膜的中心部分，是富含视锥细胞的小区域，视锥细胞是检测颜色的专门的神经末梢，日间视力依赖于此。随着黄斑水肿的发展，在中央视野的中间或仅在一侧出现模糊。由糖尿病性黄斑水肿导致的视力丧失可以在数月内发展并且使得无法清楚地聚焦。DME的常见症状是视力模糊、飞蚊症、复视，并且如果不加以治疗，最终失明。在一些实施方式中，将如本申请所公开的方法和药物组合物用于治疗DME。

在一些实施方式中，眼部病况可以是视网膜静脉阻塞。视网膜静脉阻塞是携带血液远离视网膜的小静脉的阻塞。视网膜是在内眼后部处的组织层，其将光图像转化为神经信号并将其发送到脑部。视网膜静脉阻塞最常由动脉硬化(动脉粥样硬化)和血凝块形成引起。视网膜中较小静脉(分支静脉或BRVO)的阻塞经常发生在已经由动脉粥样硬化增厚或硬化的视网膜动脉交叉且对视网膜静脉施加压力的地方。视网膜静脉阻塞的症状可以包括单眼全部或部分突然模糊或视力丧失。在一些实施方式中，将如本申请所公开的方法和药物组合物用于治疗视网膜静脉阻塞。

在一些实施方式中，眼部病况可以是脉络膜新生血管形成(CNV)，也称为湿性AMD。脉络膜新生血管形成可涉及源自脉络膜的新血管生长穿过Bruch膜的破裂到视网膜下色素上皮(sub-RPE)或视网膜下空间中，这可以是视力丧失的主要原因。CNV可以导致中央视力的突然恶化，在数周内明显。其他症状可以包括颜色干扰和视物变形(其中直线出现波浪状的失真)。新血管的出血可以加速CNV的症状的发作。CNV还可以包括眼部后的压力感。在一些实施方式中，将如本申请所公开的方法和药物组合物用于治疗CNV或与新生血管形成相关的眼部病况。

AMD的晚期“湿性”形式(新生血管性或渗出性)不太常见，但可以频繁造成患者中央视力的快速且经常大量丧失。在湿性形式的AMD中，脉络膜新生血管形成并且发展成可在视网膜色素上皮下方并穿过其生长的血管网络。由于这伴随着血浆渗漏和/或出血到视网膜下空间中，因此如果这在黄斑中发生，则可以出现严重的中央视力突然丧失。术语“AMD”，如果没有另外的说明，可以是干性AMD或湿性AMD。本公开考虑治疗或预防AMD、湿性AMD和/或干性AMD。在一些实施方式中，将如本申请所公开的方法和药物组合物用于治疗AMD。

在一些实施方式中，将如本申请所公开的方法和药物组合物用于预防或治疗在体内对阿柏西普具有应答的眼部疾病或病况。

在一些实施方式中，与载体或缓冲液对照相比，本申请所公开的方法和药物组合物(即，包含阿柏西普、其功能性片段或变体的AAV基因疗法)导致新生血管形成或CNV减少(如根据彩色眼底照相通过CNV形成后IV级损伤的百分比测量的)至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

在一些实施方式中，本申请所公开的方法和药物组合物(即，包含阿柏西普、其功能性片段或变体的AAV基因疗法)导致新生血管形成或CNV的减少(如根据彩色眼底照相通过CNV形成后IV级损伤的百分比测量的)与阿柏西普或基于阿柏西普的非基因疗法相当。在一些实施方式中，与给予基于阿柏西普的非基因疗法或阿柏西普的蛋白溶液相比，给予包含阿柏西普的基因疗法产生的CNV减少或治疗作用持续更长时间。在一些实施方式中，单次玻璃体内注射后，阿柏西普基因疗法的治疗作用持续至少1年、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些实施方式中，本申请所公开的药物组合物抑制或螯合内源性VEGF和/或PIGF。

使用方法

在一些实施方式中，本公开提供了用于治疗病理性血管生成相关的眼部疾病的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的人类受试者施用药学有效量的本申请提供的药物组合物。在一些实施方式中，所述疾病选自：眼部新生血管疾病，包括年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿及其任何组合。

在一些实施方式中，将包含含有变体衣壳蛋白的rAAV(例如，rAAV.7m8)和编码阿柏西普的核酸序列的药物组合物用于治疗或预防AMD，包括干性AMD和湿性AMD。在一些实施方式中，将包含含有变体衣壳蛋白的rAAV(例如，rAAV.7m8)和编码阿柏西普的核酸序列的药物组合物用于治疗或预防CNV，或减少IV级CNV损伤。在一些实施方式中，将包含含有变体衣壳蛋白的rAAV(例如，rAAV.7m8)和编码阿柏西普的核酸序列的药物组合物用于治疗或预防AMD、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、RVO、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿、在DME患者中的DR及其任何组合的任一种。

在一些实施方式中，治疗AMD、DME、RVO或DR的方法包括在向患者施用包含阿柏西普的核酸序列的基因疗法之前使用

在一些实施方式中，本申请公开的阿柏西普基因疗法是一次性施用。在一些实施方式中，在患者接受单位剂量的本申请公开的阿柏西普基因疗法后，患者不需要使用任何其他基于阿柏西普的疗法。

在一些情况下，经历与

此外，通过不需要重复注射，基因疗法解决了与需要重复注射的疗法相关的患者依从性和坚持性方面的挑战，因为不依从性(例如，当患者忘记或错过一次或多次事先安排的注射时)可以导致视力丧失和眼部疾病或病况的恶化。对需要重复或频繁前往医疗机构进行给药的治疗方案的不依从性和不坚持性的比例在受AMD影响最大的老年患者中更高。因此，通过基因疗法将阿柏西普递送至患者的眼部(例如，通过一次性玻璃体内注射)可以为患者提供更方便的治疗选项，并且通过解决不依从性和不坚持性的问题改善患者的结局。

在一些实施方式中，使用方法包括使用被认为是当前的标准治疗方法的药物(例如，阿柏西普蛋白注射剂、雷珠单抗注射剂或贝伐单抗注射剂)对人类患者或受试者进行预治疗，确定患者对阿柏西普的应答，并且向对阿柏西普具有应答的患者施用本申请所述的阿柏西普基因疗法。确定患者对阿柏西普的应答可以包括但不限于血液检测、免疫测定、离体实验，或者向患者施用阿柏西普蛋白注射剂并测定患者对阿柏西普的应答。

在一些实施方式中，本申请所述的阿柏西普基因疗法的使用方法包括根据药品标签复溶冻干形式的本申请所述的药物组合物(即，包含阿柏西普核酸序列的rAAV2.7m8)，以及向受试者或人类患者施用所述复溶的阿柏西普基因疗法。在一些实施方式中，提供阿柏西普基因疗法作为混悬液。在一些实施方式中，在施用前搅拌所述混悬液。在一些实施方式中，混悬液是冷藏的。在一些实施方式中，在施用前，将冷藏的混悬液加温至室温。在一些实施方式中，这样的人类患者已使用阿柏西普注射剂或其他蛋白药物注射剂(例如，雷珠单抗注射剂或贝伐单抗注射剂)预治疗。在一些实施方式中，这样的患者在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年接受rAAV2.7m8-阿柏西普基因疗法的不超过一次注射或施用；或者在超过2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年接受rAAV2.7m8-阿柏西普基因疗法的不超过一次注射或施用。

在一些实施方式中，本申请还公开了预防或治疗眼部病况或疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体(例如，患有对阿柏西普具有应答的眼部病况或疾病的个体)施用有效量的如本申请所述的包含编码阿柏西普的核酸序列的rAAV病毒粒子或其药物组合物。在一些实施方式中，可以通过眼内注射、通过玻璃体内注射、通过视网膜下注射或通过向个体的眼中施用的任何其他方便的方式或途径施用rAAV2.7m8-阿柏西普病毒粒子。其他方便的施用方式或途径包括例如静脉内、局部、滴眼等。在一些实施方式中，本申请所公开的方法和药物组合物涉及通过玻璃体内注射施用。

在一些实施方式中，提供本申请所述的基因疗法或药物组合物作为冷藏的混悬液。在一些实施方式中，冷藏的混悬液包含药学上可接受的赋形剂，例如表面活性剂、甘油、非离子表面活性剂、缓冲剂、乙二醇、盐及其任何组合。在一些实施方式中，使用盐酸和氢氧化钠调节溶液的pH。在一些实施方式中，混悬液处于中性pH，或者处于6.5至7.5的pH。在一些实施方式中，混悬液的pH略偏碱性(例如，pH约7.5、8、8.2、8.4、8.5或9)。在一些实施方式中，混悬液或溶液的pH略偏酸性(例如，pH约6.5、6.3、6.1、6、5.5或5)。在一些实施方式中，混悬液是溶液。在一些实施方式中，冷藏的混悬液包含胶束。在一些实施方式中，在施用前搅拌冷藏的混悬液。在一些实施方式中，将冷藏的混悬液贮存在35F至46F(2C至8C)的温度下。在一些实施方式中，在向患者施用前，将冷藏的混悬液加温至室温。

如本申请所述的“治疗有效量”可以是可以通过临床试验确定的相对较宽的范围。对于直接注射至眼部或玻璃体内注射而言，治疗有效剂量可以是大约10

在一些实施方式中，本公开的7m8-阿柏西普的单位剂量是1×10

在一些实施方式中，本申请所公开的药物组合物的治疗有效量包括2E12至6E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包括约1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12或9.5E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包括1E12至1.5E12、1.5E12至2E12、2E12至2.5E12、2.5E12至3.0E12、3.0E12至3.5E12、3.5E12至4.0E12、4.0E12至4.5E12、4.5E12至5.0E12、5.0E12至5.5E12、5.5E12至6.0E12、6.0E12至6.5E12、6.5E12至7.0E12、7.0E12至7.5E12、7.5E12至8.0E12、8.0E12至8.5E12、8.5E12至9.0E12、9.0E12至9.5E12或者9.5E12至10E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包括至少1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12或者9.5E12的载体基因组。在一些实施方式中，单位剂量包括不超过1E12、1.5E12、2E12、2.5E12、3E12、3.5E12、4E12、4.5E12、5E12、5.5E12、6E12、6.5E12、7E12、7.5E12、8E12、8.5E12、9E12、9.5E12或10E12的载体基因组。

在一些实施方式中，在2至5年或者5至10年时间段内注射至人类患者或受试者的7m8-阿柏西普的总量不超过10

在一些实施方式中，rAAV.7m8-阿柏西普病毒粒子或其药物组合物可以作为单剂量或一次性剂量施用。在一些实施方式中，可以使用超过一次的施用以在各种间隔的持续时间内达到期望水平的基因表达，例如在至少2年或者至少3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年内不超过一次。在一些实施方式中，7m8-阿柏西普的玻璃体内注射使患者接受阿柏西普蛋白注射的需要消除至少1年、1.5年或者至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30年或者更多年。

实施例

实施例1：rAAV2.7m8-阿柏西普在猴中的有效性评价

已经假定，通过基因疗法将治疗性转基因(或有效载荷)递送至靶细胞或组织在很大程度上依赖于AAV衣壳蛋白及其在将AAV病毒靶向至灵长类或人类受试者中的相关细胞或靶细胞中的作用。还已报告，当玻璃体内注射时，7m8变体显示出对视网膜细胞增加的感染性或靶向性。因此，当玻璃体内注射时，会预期7m8变体在将各种治疗性转基因靶向至视网膜细胞方面类似地起作用。

目的：

图5示出了阿柏西普的核酸序列。图6示出了sFLT-1的核酸序列(SEQ ID NO:3)。

猴中的CNV损伤模型是普遍接受的并且广泛使用的标准灵长类动物模型，用于评估用于治疗与新生血管形成相关的眼部疾病(如湿性AMD)的疗法的潜在有效性。

对猴进行基线筛选，以通过眼压测量、裂隙灯生物显微镜检查、眼底镜检查、彩色眼底照相(CFP)、荧光血管造影术(FA)和光学相干断层扫描(OCT)评估眼部和一般健康状况。将具有正常检查结果的猴纳入研究并且通过基线体重和性别将其随机分成三个处理组(表1)。在基线检查后，施用阿托品1％眼用软膏。

如在本申请中所使用的，rAAV2.7m8-sVEGFR-1包含rAAV2，所述rAAV2包含在rAAV2的衣壳蛋白VP1的位置587和588之间的7m8插入物和编码sVEGFR-1的核酸序列。

表1：处理分配

*如果第14天图像未显示稳定化的泡的清晰图像，则在第21天另外进行CFP。在第56天在激光之前进行裂隙灯检查，但是不在第0天注射后立即进行。

根据处理方案(表1)，在第0研究日，第1-3组的猴玻璃体内(IVT)接受AAV2.7m8-阿柏西普、载体或AAV2.7m8-sVEGFR-1OU。在IVT给药前，给予外用局部麻醉(0.5％丙美卡因)，并且可以使用5％必妥碘(Betadine)消毒眼部以及使用无菌生理盐水冲洗眼部。使用31号0.5英寸针头施用IVT注射，所述针头放置在颞侧下象限(inferior temporal quadrant)中的角膜缘后2mm处，靶向中央玻璃体。

在第56研究日，第4组的猴在激光处理后立即接受IVT阿柏西普(

在所有IVT注射后，局部施用0.3％环丙沙星，或等效的抗生素眼用溶液，和1％硫酸阿托品软膏。

在第56天时，使用激光烧伤在颞血管弓之间诱导CNV。由眼科医生使用IridexOculight TX 532nm激光器在每只眼中对称地设置九个激光斑点，激光持续时间100ms、斑点尺寸50μm、功率750mW。使用0.9x接触式激光透镜施加激光斑点。激光斑点的目标位置由受过训练的眼科医生在激光处理之前(和在泡设置之后)获得的彩色眼底图像上绘制，以供在激光斑点设置过程中参考。在激光处理后立即进行彩色眼底照相以记录激光损伤。将在激光之后立即出现严重视网膜/视网膜下出血的任何斑点从分析中排除。图1示出了在未处理情况下通过激光照射诱导CNV损伤后的非人灵长类眼部的示例性眼底图像。

使用具有Canon 6D数字成像硬件和新视野眼底图像分析系统软件的Topcon TRC-50EX视网膜照相机在中央窝(fovea)上以50度的中心视角捕获视网膜的双侧彩色眼底图像。静脉内施用0.l mL/kg的10％荧光素钠进行FA。CNV损伤的血管造影照片中的荧光素渗漏情况由盲态的眼科医生分为I-IV级(表2)，评估在对图像强度进行均匀调整后产生的复合物。由另外两名受过训练的眼科医师确认眼底图像上的损伤分级评估结果。还可以使用ImageJ软件进行晚期原始血管造影照片的图像荧光光密度分析。

表2：激光损伤分级量表

每日两次评估受试者的一般健康状况。每周进行一次详细观察。在基线筛选时获取以及在在体(in-life)研究期间每两周获取体重。

在第85天或之后不久确认眼底成像质量之后，在图像审核期间，使用戊巴比妥将所有动物安乐死。使用戊巴比妥将动物安乐死并摘除眼球。修剪过量的眼眶组织并将OD和OS眼球在液氮中速冻，然后在室温下沿冰冻组织平面解剖以分离玻璃体和带有脉络膜亚组织的视网膜。收集玻璃体后，从黄斑以及上、下、颞和鼻区取5mm打孔凿物(punches)的带有RPE/脉络膜的神经视网膜。将来自每个打孔凿物的带有下面的RPE/脉络膜组织的视网膜转移至预先去皮的标记冻存管中，称重并在液氮中速冻。在收集打孔凿组织活检物之前和之后，拍摄带有方向指示的平面放置的视网膜的照片以记录从其收集打孔凿物的区域。

统计学方法：

在每组测试受试者(猴)中注射后立即通过激光照射诱导CNV损伤，并且使用彩色眼底照相将各损伤分为I-IV级。图2示出了用于评价在使用剂量为2.1×10

图3示出了使用

图4示出了用各自剂量为2.1×10

这些rAAV2.7m8-阿柏西普体内研究表明，包含7m8变体衣壳蛋白的rAAV2作为用于通过玻璃体内注射将编码阿柏西普的核酸序列递送至受试者的视网膜细胞，导致体内表达活性阿柏西普，使得其以与