一种深海原位微生物培养与采集的系统和方法

技术领域

本发明涉及微生物培养与采集技术领域，特别是涉及一种深海原位微生物培养与采集系统。

背景技术

深海蕴藏大量微生物资源，在环境修复和有机合成方面有重要价值。传统采样方式对深海生物样品影响较大，限制了对深海极端环境下微生物的利用，同时所处环境的特殊性使在实验室实现高仿真模拟培养变得几乎不可能。尽管利用深海环境模拟进行生物培养工作难度较大，但仍然是国际上微生物地球化学研究领域研究的一种重要方法。在深海微生物培养系统研制方面比较先进的主要有美国明尼苏达大学地质地球物理系、加州大学伯克利分校，伍兹霍尔研究所(WHOI，Woods Hole Oceanographic Institution)以及日本海洋科学研究中心(JAMSTEC，Japan Agency for Marine-Earth Science andTechnology)。国内在实验室模拟培养方面的研究起步较晚。这些可培养微生物在实验室条件下，由于生存条件改变，连续的传代培养会产生“驯化效果”。培养基中添加有机碳源最终会导致化能自养菌基因组渐渐发生变化，出现异养性基因横向转移，变成兼性菌。因此，实验室培养菌株会丢失大量深海原始菌株的特征。模拟培养可以解决微生物基础生理特性等问题，但无法完成对微生物原位生态功能和动态变化的监测和评估。因此，深海原位培养在深海微生物资源利用上有更重要的意义。

浙江大学等相关单位合作成功研制了我国首个深海水体原位微生物培养系统，由控制室、培养室、浮力材等组成，但是该装置不具有定期取样检测的功能，也无法避免环境压力变化对细胞的损伤。国家海洋局与杭州电子科大学联合研制的一套能够在深海原位环境下独立开展工作的深海原位生物实验平台，主体由16个培养仓、原位环境监测传感器、声学释放器、浮力材料和重力锚等组成。系统设计最大工作水深6000米，可布放到海水与沉积物界面处，进行深海微生物的原位长期培养。但是该装置也无法对每个培养舱开展不同时间段的取样和保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种深海原位微生物培养与采集的系统和方法，解决深海原位微生物培养无法定期取样检测的问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

提供一种深海原位微生物培养与采集系统，包括微生物自动收集装置、深海原位微生物培养室、管路切换装置和微生物富集保存装置，所述微生物自动收集装置用于收集海水和培养母液，并分别输送给所述深海原位微生物培养室，在所述深海原位微生物培养室中进行原位微生物培养，所述微生物富集保存装置包括多个微生物富集滤盘，所述深海原位微生物培养室通过所述管路切换装置连接各微生物富集滤盘，其中，通过控制所述管路切换装置，在不同培养时间下将所述深海原位微生物培养室切换连接到不同的微生物富集滤盘，由各微生物富集滤盘收集在不同培养时间下的微生物样本。

在本发明的一些实施例中，所述微生物富集滤盘包括腔体和相应孔径的滤膜，相应大小的微生物在所述滤膜上完成富集。

在本发明的一些实施例中，还包括甘油添加装置，所述甘油添加装置通过所述管路切换装置连接各微生物富集滤盘，以向所述微生物富集滤盘添加甘油保护剂来保存微生物。

在本发明的一些实施例中，还包括至少一个菌液滤盘和水袋，所述深海原位微生物培养室通过所述管路切换装置连接所述菌液滤盘，所述菌液滤盘连接所述水袋，培养菌液经由所述菌液滤盘过滤掉限制大小的微生物后保存于所述水袋。

在本发明的一些实施例中，所述管路切换装置包括若干个二位二通阀及其阀座，每个二位二通阀与对应的滤盘相连。

在本发明的一些实施例中，所述微生物自动收集装置与所述深海原位微生物培养室之间、所述深海原位微生物培养室与微生物富集保存装置之间连接有泵。

在本发明的一些实施例中，所述泵包括蠕动泵。

在本发明的一些实施例中，所述培养母液为C元素使用C14进行标记、终浓度为0.1M的碳酸氢钠。

在本发明的一些实施例中，所述微生物自动收集装置向所述深海原位微生物培养室注入海水后，再注入所述培养母液。

本发明还提供一种深海原位微生物培养与采集方法，使用所述深海原位微生物培养与采集系统进行深海原位微生物培养与采集。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过微生物自动收集装置收集海水和培养母液，并分别输送给深海原位微生物培养室，在深海原位微生物培养室中进行原位微生物培养，再通过管路切换装置在不同培养时间下将深海原位微生物培养室切换连接到微生物富集保存装置中的不同的微生物富集滤盘，由各微生物富集滤盘收集在不同培养时间下的微生物样本，实现了对深海原位微生物培养、定期取样、保存、检测。由于能够保存深海水体培养体系中不同时段的培养微生物，本发明可用于菌群变化检测和菌种保藏，使培养过程中的微生物变化能够被保留和提取。

在本发明的一些实施例中，还可以通过甘油添加装置，由管路切换装置向微生物富集滤盘添加甘油保护剂来保存微生物，避免环境压力变化对细胞的损伤，从而保证深海原位定期取样检测的可靠性。

本发明实施例中的其他有益效果将在下文中进一步述及。

附图说明

图1是本发明实施例中深海原位微生物培养与采集系统结构图；

图2是本发明实施例中深海原位微生物培养与采集方法流程图；

图3是本发明实施例中深海原位微生物培养与采集系统实物布设图；

图4是本发明实施例中不同样品获得的深海原位培养微生物的菌群结构占比图。

附图标记如下：

1为微生物自动收集装置，11为蠕动泵A，12为海水泵，13为培养母液，14为海水，2为深海原位微生物培养室，3为管路切换装置，31为二位二通阀A，32为二位二通阀B，33为二位二通阀C，34为二位二通阀D，35为二位二通阀E，36为二位二通阀F，37为二位二通阀G，38为二位二通阀H，39为二位二通阀I，41为微生物富集滤盘A，42为微生物富集滤盘B，43为微生物富集滤盘C，44为微生物富集滤盘D，45为微生物富集滤盘E，5为甘油添加装置，61为菌液滤盘A，62为菌液滤盘B，63为菌液滤盘C，64为菌液滤盘D，71为水袋A，72为水袋B，73为水袋C，74为水袋D，蠕动泵B8，蠕动泵C9，培养菌液10。

具体实施方式

下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，本实施例中的左、右、上、下、顶、底等方位用语，仅是互为相对概念，或是以产品的正常使用状态为参考的，而不应该认为是具有限制性的。

现有的深海培养装置均长期放置在海底，无法了解其培养过程中的菌群变化过程，也无法在返回海面之前对样品进行甘油注入使细胞免于压力变化导致的破损。本发明实施例可以实现对培养过程中不同时间点的菌群定期采样保存，用于培养过程中菌群变化的检测。

现有的深海微生物培养方法都是利用水样瓶将样品带到实验室开展培养分离工作。本发明实施例可以避免环境变化，如压力和温度，对样品的破坏，直接在原位开展培养筛选工作，并加入甘油保护剂，避免环境压力变化对细胞的损伤。

本发明实施例提供一种深海原位微生物培养与采集的系统和方法，流程如图2所示，包括原位培养、原位采集，甘油保护，均在本发明实施例的深海原位微生物培养与采集的系统中完成，同时设置对照组，完成原位采集与模拟培养；完成微生物样品获取后，进行数据处理与分析，包括进行琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的DNA和RNA；使用Qubit 2.0荧光光度计(Invitrogen,USA)精确测量提取得到的DNA和RNA的浓度；对DNA及RNA进行文库构建，进行基因组测序；对群落结构进行分析。

深海原位微生物培养与采集主要实现原位培养、原位采集及甘油保护三个步骤，由本实施例提供的一种深海原位微生物培养与采集系统完成。系统主要组成如图1所示，包括微生物自动收集装置1、深海原位微生物培养室2、管路切换装置3，微生物富集保存装置，甘油添加装置5，至少一个菌液滤盘和水袋，若干泵和阀门，泵包括蠕动泵，阀门包括二位二通阀，管路切换装置3与泵实现微生物连续采集。

微生物自动收集装置1用于收集海水14和培养母液13，并分别输送给深海原位微生物培养室2，在深海原位微生物培养室2中进行原位微生物培养。

深海原位微生物培养室2为一个不锈钢腔体，用于完成微生物的原位培养过程，经由微生物自动收集装置1与深海原位微生物培养室2之间的蠕动泵A11和海水泵12分别泵入培养母液13和海水14后，在深海原位微生物培养室2的腔体中进行深海微生物原位培养。深海原位微生物培养室2通过管路切换装置3连接微生物富集保存装置中的各微生物富集滤盘，通过控制管路切换装置3，在不同培养时间下将深海原位微生物培养室2切换连接到不同的微生物富集滤盘，由各微生物富集滤盘收集在不同培养时间下的微生物样本。

管路切换装置3主要由若干个二位二通阀及其阀座组成，每个二位二通阀与对应的滤盘相连接，当深海原位微生物培养室2的控制单元(未图示)发送指令控制某个的二位二通阀开启时，深海原位微生物培养室2的培养菌液10经由深海原位微生物培养室2与微生物富集保存装置之间的蠕动泵B8通过控制的二位二通阀进入相应的滤盘中完成微生物富集或过滤工作，其中，微生物富集由微生物富集滤盘完成，微生物过滤由菌液滤盘完成。

具体而言，在本发明实施例图1中，二位二通阀A31、二位二通阀C33、二位二通阀E35、二位二通阀G37、二位二通阀I39分别控制微生物富集滤盘A41、微生物富集滤盘B42、微生物富集滤盘C43、微生物富集滤盘D44、微生物富集滤盘E45，二位二通阀B32、二位二通阀D34、二位二通阀F36、二位二通阀H38分别控制菌液滤盘A61、菌液滤盘B62、菌液滤盘C63、菌液滤盘D64。

微生物富集保存装置包括多个微生物富集滤盘，本发明实施例中为微生物富集滤盘A41，微生物富集滤盘B42，微生物富集滤盘C43，微生物富集滤盘D44，微生物富集滤盘E45，用于微生物原位核酸富集，每个微生物富集滤盘包括腔体和相应孔径的滤膜，相应大小的微生物在滤膜上完成富集，在后续工作中打入甘油实现核酸原位固定。

管路切换装置3还连接至少一个菌液滤盘和与菌液滤盘连接的水袋，在本发明实施例的图1中，管路切换装置3连接菌液滤盘A61、菌液滤盘B62、菌液滤盘C63、菌液滤盘D64，菌液滤盘A61、菌液滤盘B62、菌液滤盘C63、菌液滤盘D64又分别连接水袋A71、水袋B72、水袋C73、水袋D74，从而实现培养菌液10的保存，培养菌液10经过菌液滤盘过滤掉大型微生物后将培养菌液10保存于对应菌液滤盘的水袋中。

甘油添加装置5通过管路切换装置3连接各微生物富集滤盘，由蠕动泵C9以向微生物富集滤盘添加甘油保护剂来保存微生物。

深海原位微生物培养与采集方法步骤如下：

(1)开启蠕动泵A11、海水泵12，向深海原位微生物培养室2中注入45L海水14及5L一定浓度的培养液13(NaHC

微生物自动收集装置1向深海原位微生物培养室2注入海水14后，关闭深海原位微生物培养室2的海水泵12进水管路，再注入培养液13后，关闭蠕动泵A11培养液管路，使深海原位微生物培养室2成为封闭的环境，开始原位培养工作，即打入两种海水14和培养母液13后，海水14中的微生物通过营养液增殖生长。

(2)打开管路切换装置3，将深海原位微生物培养室2中的海水14，经过蠕动泵B8，依次过滤到若干个菌液滤盘中完成5个不同时间点的原位微生物过滤和收集工作，在本实施例中为菌液滤盘A61、菌液滤盘B62、菌液滤盘C63、菌液滤盘D64，菌液滤盘A61、菌液滤盘B62、菌液滤盘C63、菌液滤盘D64。此时，深海微生物培养室一直处于密封充填，保证固碳微生物的生长，进行海水原位微生物的培养。

(3)当每个微生物富集滤盘过滤完成后，打开蠕动泵C9，将甘油输送至微生物富集滤盘中，完成对原位培养微生物水体的微生物保存工作。

(4)使用常规水样采集技术(Niskin)采集一定体积水体样品，在实验室条件下完成核酸的提取，作为对照组完成后续实验。

2、数据处理及分析

(1)使用琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的DNA和RNA的完整性，使用Qubit 2.0荧光光度计(Invitrogen,USA)精确测量提取得到的DNA和RNA的浓度。使用200ng纯化后的样品DNA进行文库构建，进行宏基因组测序。另外，将提取得到的质量合格的RNA进行建库，并进行宏转录组测序。

(2)群落结构分析：基于宏基因组测序结果，使用miTAG结合QIIME软件包完成原位培养样品与对照组样品群落结构分析，解析原位培养状态下群落结构的变化。

本发明实施例的能够保存深海水体培养体系中不同时段的培养微生物，用于菌群变化检测和菌种保藏，使培养过程中的微生物变化能够被保留和提取，还可以将培养液加入甘油保护剂，避免这些深海微生物因环境改变而死亡。

本发明实施例涉及的深海原位微生物培养与采集系统具有不可替代性，这是由深海微生物在环境改变下不可避免地自然死亡和群落结构快速改变的情况决定的，必须开展原位培养菌群的群落检测和菌种保藏。没有死亡的深海细菌培养早于被证明只有一些异养型细菌，且利用原来方法和流程得到的培养菌群的数目和种类遇到了瓶颈。

本发明实施例实现了深海原位培养微生物在不同时间段得以保存，也可以完成单次下潜多个序列和底物的微生物培养。关键工艺是培养系统内的之间的转换。现有技术多数情况下需要将深海水样带到实验室才开展培养，而一些深海原位培养系统，无法对培养时间点进行选择性取样检测，也无法注入微生物甘油保护液，导致一些培养微生物在离开水面后死掉。

实例

本发明实施例的深海原位微生物培养与采集系统由凤凰号着陆器携带开展深海原位微生物培养工作，目前已完成了8次培养测试，均完成了预定目标，现场布置如图3所示，不同样品获得的深海原位培养微生物的菌群结构占比如图4所示。

图4中，横轴代表不同样品，纵轴代表在不同样品中不同微生物的占比。图4中FH21-C为深海原位利用0.1mM碳酸氢钠在40L水袋中培养的微生物群落结构；FH18-N、PH22-N为水样瓶的群落结构；FH21-5、FH21-7、FH21-8、FH21-9、FH21-10为原位过滤微生物的群落结构。

本发明实施例的扩增子读数分类结果显示，所有样本中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高。对于原位过滤样本，还显示了厚壁菌门(Euryarchaeota)、绿色非硫光合菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的高相对丰度，而这些在水样瓶(FH18-N和FH22-N)和培养(FH21-C)样本中几乎不存在。原位过滤样本之间的群落结构也存在变化。在PH21-6和PH21-7之间，变形菌门的数量减少，放线菌门(Actinobacteria)和隐球菌门(Planctomycetes)的数量增加，表明在清晨时间段内发生了微生物组成的变化。尽管PH21-5和PH21-8的测序读数较少(<1,000)，但这两个样本的微生物群落结构与其他MISNAC样本相似。因此可以得知培养与水样瓶和原位过滤微生物的群落结构完全不同，证明了本发明实施例中系统的可行性。2022年3-4月，该系统随凤凰号在南海600-3000米完成了6次深海原位微生物培养，添加碳酸氢钠和氯化铵进行氨氧化古菌等碳固定微生物的筛选和培养。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。