红茶提取物在制备抗肺部炎症风暴药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种红茶提取物（含茶黄素-3,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯）在制备抗肺部炎症风暴药物中的应用。

背景技术

炎症风暴又称细胞因子风暴，是机体在受到感染或者药物等因素刺激后引发的一种全身性炎症反应，主要表现为大量促炎症的细胞因子水平急剧升高。自2019年开始，在全世界范围内广泛传播的新型冠状病毒（SARS-Cov-2）与其他冠状病毒一样，能够刺激患者的先天免疫系统，致使机体大量释放细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，造成细胞因子风暴和急性炎症反应，进而导致多器官衰竭。JAK-STAT是调控细胞因子的重要信号通路，对于启动先天免疫、协调适应性免疫以及炎症反应至关重要。当细胞因子与免疫细胞表面的受体结合后，会导致下游JAK激酶活化，活化后的JAK又会进一步激活STAT转录因子并导致免疫细胞释放出更多的细胞因子。

红茶是一种全发酵茶，在发酵过程中茶多酚经酶促反应生成茶红素、茶黄素等有效成分，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。其中茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯是红茶中的主要茶黄素单体。本发明经试验发现：茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯能够与JAK1结合并抑制其磷酸酶活性。同时，红茶提取物还能够降低由聚肌胞苷酸和重组SARS-CoV-2棘突蛋白引起的急性肺损伤以及IL-6、IL-1α炎症因子的分泌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种红茶提取物（如茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯）在制备抗肺部炎症风暴药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明提供了一种红茶提取物在制备抗肺部炎症风暴药物中的应用。

进一步的，所述红茶提取物包括茶黄素-3-3’双没食子酸和/或茶黄素-3-没食子酸酯等。茶黄素-3-3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯同属于茶黄素，其中，茶黄素-3,3’双没食子酸分子式为：C

茶黄素-3-,3’双没食子酸的结构式如下：

茶黄素-3-没食子酸酯的结构式如下：

进一步的，上述的应用，茶黄素-3-3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物，能够与JAK1结合并抑制JAK1磷酸酶活性。

进一步的，上述的应用， 300±100mg/kg的红茶提取物能够显著降低聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白引发的小鼠肺部炎症因子IL-6以及IL-1α。

进一步的，上述的应用， 300±100mg/kg的红茶提取物能够显著降低聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白引发的小鼠肺部损伤。

红茶提取物（含茶黄素-3,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯）在制备抗肺部炎症风暴药物中的应用，所述化合物具有如下所示的功能：(1)茶黄素-3-3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物能够靶向JAK1并抑制其磷酸酶活性；(2) 红茶提取物能够抑制聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在小鼠肺部所引发的炎症因子风暴反应；(3) 红茶提取物能够缓解聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白后小鼠肺组织所引发的急性肺损伤。

具体的，本发明发现红茶提取物中的茶黄素-3-3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯能够与JAK1结合并抑制其磷酸酶活性；300±100 mg/kg的红茶提取物能够降低聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白诱导小鼠急性肺损伤模型中炎症风暴因子的产生。红茶提取物的给药方式为灌胃。

进一步的, 茶黄素-3-3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯能够与JAK1结合；且10、20、40 μM的茶黄素-3-3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯，以及10、20、40μg/ml的红茶提取物能够抑制JAK1磷酸酶活性。

进一步的，红茶提取物在浓度为300±100 mg/kg时，能够显著地抑制聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白引发的小鼠肺部炎症因子IL-6以及IL-1α。

进一步的，红茶提取物在浓度为300±100 mg/kg时，能够显著地抑制聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白引发的小鼠肺部损伤。

和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经研究发现：红茶提取物中的茶黄素-3,3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯可作为JAK1的抑制剂抑制其磷酸酶活性；红茶提取物能够降低聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在小鼠肺部所引发的炎症因子风暴。 换句话说，本发明发现茶黄素-3-,3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯能够与JAK1结合并抑制其磷酸酶活性；同时红茶提取物（含茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯）能够降低严重急性呼吸窘迫症、调控IL-6、IL-1α的表达从而降低急性肺损伤。

附图说明

图1：A为茶黄素-3-,3’双没食子酸标准曲线的测定，B为茶黄素-3-没食子酸酯标准曲线的测定。

图2：A为茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯、红茶提取物与RAW264.7细胞裂解液中JAK1蛋白的结合；B为通过SPR实验鉴定茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯与JAK1的结合；

图3：茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯、红茶提取物能够明显抑制JAK1磷酸酶活性；

图4：300mg/kg红茶提取物能够显著地抑制聚肌胞苷酸（poly I:C）和SARS-CoV-2棘突蛋白（Spike）诱导的IL-6 （A）及IL-1α（B）的分泌；

图5：300mg/kg红茶提取物能够显著地降低聚肌胞苷酸（poly I:C）和SARS-CoV-2棘突蛋白（Spike）诱导的肺损伤。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

1. 材料

1.1 试剂

红茶提取物购自西安四季生物科技有限公司，批号：SJHC211020；

茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯购自成都瑞芬斯生物科技有限公司，纯度≥98%；

Sepharose 4B珠子购自思拓凡生物科技有限公司

JAK1, JAK2激酶蛋白以及stat3蛋白购自 signalchem公司；

poly(I:C)购自Invivogen公司；

SARS-CoV-2棘突蛋白购自金斯瑞公司；

BALB/c小鼠购自维通利华公司；

Stat3抗体以及磷酸化stat3抗体购自CST公司；

细胞因子检测试剂盒购自Biolegend；阿弗丁购自易瑞公司。

1.2仪器与器材：

酶标仪（BD公司）；倒置显微镜（OLYPUMS）；海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Thermo 超净工作台 ；IVC系统（苏州市冯氏实验动物设备有限公司）；移液枪、移液管（规格分别为5 ml，10ml，25 ml）、离心管（规格分别为15 ml/50ml）；6孔板、96孔板（Corning公司）；微量注射针（Hamilton）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；流式细胞仪（BD FACS Calibur）。

2 实验流程：

2.1 检测红茶提取物中茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯的含量：

首先利用乙腈溶液将茶黄素-3-,3’双没食子酸标准品配制成500、250、125、62.5、31.25 μg/ml的标准溶液。将乙腈溶液将红茶提取物配制成1 mg/ml的测试液。利用高效液相色谱仪检测红茶中茶黄素-3-,3’双没食子酸的含量。同样方法将茶黄素-3-没食子酸酯标准品配制成200、100、50、62.5、2.5、1 μg/ml的标准溶液，检测红茶提取物中茶黄素-3-没食子酸酯的含量。标准曲线分别如图1中A和B所示。根据标准曲线，计算得到1mg/ml红茶提取物中茶黄素-3-,3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯的含量。

两次重复测定结果显示：1mg/ml红茶提取物中约含有 15.2μg/ml的茶黄素-3-,3’双没食子酸，约含有9.85 μg/ml的茶黄素-3-没食子酸酯。

2.2检测茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物能否与JAK1的结合：

首先利用1% 盐酸将Sepharose 4B珠子活化，活化后的珠子分别与DMSO、茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物孵育，经洗涤液洗涤后分别形成Sepharose 4B-DMSO珠子、Sepharose 4B-茶黄素-3-,3’双没食子酸珠子、Sepharose 4B-茶黄素-3-没食子酸酯珠子和Sepharose 4B-红茶提取物珠子。分别取50ul上述珠子与500 μgRAW264.7细胞裂解液于4度冷室过夜旋转孵育。以溴化氢活化的Sepharose 4B-DMSO珠子与RAW264.7细胞裂解液共同孵育组为对照组。第二天，离心弃上清，并用清洗液清洗珠子，去除游离细胞裂解液。用SDS-PAGE上样缓冲液对珠子进行变性处理。最后经蛋白免疫印迹的方法用JAK1抗体进行验证，观察茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物与JAK1是否存在结合。

结果显示：茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物均能与RAW264.7细胞裂解液中的JAK1结合，具体结果见图2中A。

2.3检测茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯与JAK1的结合能力：

首先利用Biacore T200仪器将JAK1激酶蛋白通过氨基偶联的方式偶联在SeriesS sensor CM5芯片通道2上，偶联量为10000 RU。然后将终浓度分别为0.9 μM、1.8 μM、3.75μM、7.5 μM、15 μM、30 μM、60 μM的茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以20ul/min的流速与CM5芯片上的JAK1通道反应，反应时间为120秒，以通道1做为空白对照。

结果显示：随着化合物浓度升高，茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯与JAK1的结合量升高。结果如图2中B所示。

2.4 检测茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物对JAK1磷酸酶活性的抑制作用：

首先将0μM、10μM、20μM、40μM 的茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯，以及0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的红茶提取物与50ng JAK1激酶于室温反应15分钟。以不加JAK1激酶的反应样为对照。反应结束后，依次加入终浓度为25μM的三磷酸腺苷及100 ng stat3底物蛋白并于30度反应30分钟。利用SDS-PAGE上样缓冲液对反应体系进行变性处理。最后利用蛋白免疫印迹的方法用磷酸化stat3抗体进行验证，观察茶黄素-3-,3’双没食子酸、茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物能否抑制JAK1磷酸酶活性。

结果显示：在不含茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物的情况下，JAK1能够高度磷酸化stat3蛋白，在茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物存在的情况下，stat3蛋白的磷酸化受到抑制，且随着化合物浓度升高，stat3蛋白的磷酸化程度降低。即茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯以及红茶提取物均能抑制JAK1的磷酸酶活性，具体结果见图3。

2.5测定红茶提取物对小鼠病毒感染性ARDS模型肺泡灌洗液细胞因子的影响：

取10周龄的BALB/c雄鼠分为4组，每组7-8只，分别为（1）生理盐水对照组，（2）polyI:C+Spike组，（3）红茶提取物处理组（300mg/kg），（4）地塞米松对照组（50mg/kg）。分组后的第（3）及第（4）组小鼠连续3 d给予上述处理，在第三天处理结束后两个小时后，利用阿弗丁对小鼠进行麻醉处理。麻醉后的小鼠固定于操作台上，小心剪开小鼠额下气管上方皮肤并于镊子剥离出气管。利用微量注射器将Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白的预混液经气管注入第（2）、 （3）、（4）组小鼠的肺部；其中Poly(I:C)的剂量为2.5 mg/kg 小鼠体重，SARS-CoV-2棘突蛋白的剂量为15 μg。同样操作方法将等体积的生理盐水注入第（1）组小鼠肺部。注射结束后，利用手术缝合线将刀口缝合。6 h 后，将上述小鼠麻醉处理后，打开手术刀口，将26G医用静脉留置针小心插入小鼠气管后移除硬质针头，然后将1 ml生理盐水经留置针缓慢注入小鼠肺部后缓缓抽取1 ml 肺部灌洗液。重复灌洗3次。取第 1 ml 灌洗液用于细胞炎症相关因子分析，结果如图4 所示。

图4结果显示：polyI:C+Spike蛋白能够刺激肺泡灌洗液中IL-6（A）及IL-1a(B)的分泌。给予红茶提取物及地塞米松处理组，能够显著降低polyI:C+Spike蛋白刺激产生的IL-6（A）及IL-1a(B)的分泌。

2.6 利用苏木精-伊红染色检测小鼠病毒感染性ARDS模型的肺部损伤情况：

按照2.4实验处理分组及方法，对各组小鼠进行药物及Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白刺激处理。在Poly(I:C)和 SARS-CoV-2棘突蛋白的预混液或生理盐水注入肺部并缝合刀口24 h 后，将所有小鼠麻醉处理并取肺部组织于4%多聚甲醛中固定。固定过夜后的肺部组织进行脱水及石蜡包埋处理。利用组织切片机切取3 mm厚度的组织用于苏木精-伊红染色实验。染色结束后，在显微镜下观察组织形态变化，结果如图5所示。

图5结果显示：与生理盐水处理组相比，polyI:C+Spike蛋白能够显著引起肺间质水肿和粒细胞性肺炎，而给予红茶提取物及地塞米松处理后组中，由polyI:C+Spike蛋白引起的肺间质水肿和粒细胞性肺炎明显得到改善。即红茶提取物能够显著降低肺部组织损伤。

综上所述：茶黄素-3-,3’双没食子酸及茶黄素-3-没食子酸酯能够与JAK1结合并抑制其磷酸酶活性；同时红茶提取物（含茶黄素-3-,3’双没食子酸，茶黄素-3-没食子酸酯）能够降低严重急性呼吸窘迫症、调控IL-6、IL-1α的表达从而降低急性肺损伤。本发明适用于病毒性肺炎、细菌性肺炎以及支原体肺炎等引起的肺部炎症因子风暴及急性肺损伤。