高地芽孢杆菌JH6及其应用

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及高地芽孢杆菌JH6及其应用。

背景技术

烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)属于卵菌门、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)，是一种植物病原卵菌，能够侵染烟草、辣椒、茄子、南瓜、魔芋等植物，对寄主植物的生长发育和农业生产具有很大的影响。烟草疫霉菌的传播主要依靠土壤、水流、空气和农具等途径，且烟草疫霉菌产生卵孢子作为越冬接种体具有极强的抗逆能力，能在土壤中存活数年至数十年。

茄子绵疫病是由烟草疫霉菌引起的一种常见植物病害，在茄子的各个生长发育期均可发病，为害叶片、茎秆、果实等。叶片、茎秆发病，会形成水渍状病斑，在潮湿环境下病斑上生有稀疏白色霉状物。茄果多从下部成熟部位产生病斑，果面上出现水渍状圆形病斑，后逐渐扩大稍凹陷，病部呈暗褐色。在潮湿条件下，病斑表明产生大量絮状白色菌丝体，绵疫病由此得名。病斑最后蔓延到全果，最终导致病果脱落。茄子绵疫病发病率较高，且潜伏期短，蔓延速度快，常常造成巨大的经济损失。

目前对于茄子绵疫病的防控主要采取以农业栽培措施为主，抗病育种和化学药剂防治相结合的综合防治措施。农业栽培措施主要包括：(1)选择地势高、排水良好、沙质壤土种植；(2)根据不同品种合理密植，降低田间湿度，减轻病菌侵害；(3)雨天及时排水，降低田间湿度；(4)避免连作和栽培抗病品种等。但目前尚无完全抗病的品种，主要是一些耐病品种，如主北京九叶茄、六叶茄、辽茄3号、济南早小长茄等。生产上主要采用化学药剂，如甲霜灵、霜霉威、烯酰吗啉、甲霜霜脲氰等，但这些杀菌剂应用易于产生抗药性。

与化学防治相比较，生物防治具有持效期长、对环境污染小、安全性好等优点。然而，针对不同病原菌，不同生防菌在不同种和株系间的拮抗机制和活性是不同的，特别是，生产抗生素的能力在同菌的不同分离系之间以及不同菌种的不同分离系之间会有变化，因此对于不同的病原体，筛选具有高度拮抗活性并表征其拮抗机制是其作为生物防治剂应用的重要工作。生防菌的开发和应用将为防治茄子绵疫病等植物病害提供广阔的市场与前景。

发明内容

为了解决茄子绵疫病的防治问题，本发明提供了一株高地芽孢杆菌JH6，该菌株对烟草疫霉菌的抑制作用强，能够有效防治烟草疫霉菌在茄子叶片和果实上的生长繁殖，在茄子绵疫病的防治等方面具有良好的应用前景。

具体采用的技术方案如下：

一株高地芽孢杆菌，分类命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，株号JH6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023909，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学；保藏日期：2023年6月5日。

所述的高地芽孢杆菌分离于浙江省金华市潘安县尚湖镇上溪滩村的茄子地土壤样品，所述的高地芽孢杆菌在NA平板上恒温(30℃)培养48h后，其菌落呈圆形，淡黄白色，不透明，表面干燥有褶皱，其16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的高地芽孢杆菌的七个保守基因：gyrB、rpoB、aroE、mutL、trpB、pyrB、pycA，其中gyrB的序列如SEQ ID NO.2所示，rpoB的序列如SEQ ID NO.3所示，aroE的序列如SEQ ID NO.4所示，mutL的序列如SEQ IDNO.5所示，trpB的序列如SEQ ID NO.6所示，pyrB的序列如SEQ ID NO.7所示，pycA的序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了所述的高地芽孢杆菌在抑制植物病原卵菌中的应用，所述的植物病原卵菌包括烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)或疫霉属(Phytophthora spp.)的其它植物病原菌。经实验证明，该高地芽孢杆菌的抗菌谱具有特异性，对烟草疫霉菌具有抗性，且其对烟草疫霉菌具有显著拮抗作用。

本发明还提供了所述的高地芽孢杆菌在防治植物病原卵菌引发的植物病害中的应用，所述的植物病原卵菌包括烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)或疫霉属(Phytophthora spp.)的其它植物病原菌。

具体的，所述的植物病害包括茄子绵疫病。

本发明还提供了所述的高地芽孢杆菌在制备生防制剂中的应用。

本发明还提供了一种生防制剂，其活性成分包含所述的高地芽孢杆菌，优选的，优选的，所述的生防制剂还包括药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂中的至少一种，以方便生防制剂的施用或提高防治效果。

具体的，将所述的高地芽孢杆菌接种到发酵培养基培养后，发酵液或去除菌体的发酵液即为所述的生防制剂。

优选的，当所述的生防制剂为发酵液时，将所述的生防制剂配制成工作溶液施用在植物上，工作溶液中，高地芽孢杆菌的浓度为1×10

优选的，当所述的生防制剂为去除菌体的发酵液时，将所述的生防制剂配制成工作溶液施用在植物上，工作溶液中，去除菌体的发酵液的体积分数为10％～15％。

实验证明，在上述浓度范围下，对烟草疫霉菌的防治效果更好。

优选的，将所述的生防制剂配制成工作溶液施用在植物的根部或叶部，用以防治烟草疫霉菌引发的植物病害，所述的植物包括但不限于茄子、辣椒、番茄等。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明筛选到的高地芽孢杆菌JH6，能够较为显著地抑制烟草疫霉菌菌丝的生长，且其产生的次生代谢物，也对烟草疫霉菌具有较强的抑制作用，实验表明，高地芽孢杆菌JH6去除菌体的发酵液对离体茄子果实的防效达79.41％，对茄子叶片的防效达82.86％，可用其开发生防制剂，应用于茄子绵疫病的生物防治，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为所述高地芽孢杆菌对烟草疫霉菌的抑制效果图，其中A为平板中抑制效果图(左边为病原菌菌丝生长；右边为细菌对病原菌的抑制效果)；B抑菌圈统计图，其中a表示不同处理间在5％水平上的显著差异性。

图2为所述高地芽孢杆菌在NA平板上形态观察图和扫描电镜图，其中，A为菌落图片，B为扫描电镜图。

图3为结合所述高地芽孢杆菌gyrB、rpoB、aroE、mutL、trpB、pyrB、pycA基因序列构建的系统发育树。

图4为MALDI-TOF质谱对所述高地芽孢杆菌产生的脂肽化合物检测结果。

图5为实施例5中不同浓度生防制剂(无细胞上清液)对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效果，其中，A不同浓度无细胞上清液对病原菌生长抑制效果；B为抑制菌落生长统计图，其中不同字母(a-f)表示不同处理间在5％水平上具有显著差异性。

图6为实施例6中生防制剂(无细胞上清液)在离体茄子果实上对烟草疫霉菌的防治效果图。

图7为实施例7中生防制剂(无细胞上清液)在茄子叶片上对烟草疫霉菌的防治效果图；其中，A为发病对照组；B为实验组。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的培养基包括：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，去离子水1L，121℃灭菌20min。

LB培养液：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水定容至1L，121℃灭菌20min，pH 7.2。

NA琼脂培养基：葡萄糖2.5g，胰蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，琼脂粉12g，去离子水1L，121℃灭菌20min，pH 7.0。

实施例1土壤样品采集和生防菌的分离

土壤样品于2022年5月从浙江省金华市潘安县尚湖镇上溪滩村茄子地采集。

称取1g土壤样品加入10mL浓度为0.7mol/L氯化钠溶液中，将溶液进行震荡处理1min后，制成土壤悬液，再用0.7mol/L的氯化钠溶液将该土壤悬液稀释至浓度为10

为进一步筛选拮抗细菌，用扩散法测定抑制效果，即先将液体培养的烟草疫霉菌菌丝在匀浆机中打碎成菌丝片段，吸取100μL菌丝片段涂布于PDA平板中，除去过多的水分后将含有细菌液的滤纸片放置在PDA平板中心，6d后测定抑菌圈的大小，如图1中的A和B所示。从上述茄子地土壤样品中筛选出1株对烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)拮抗效果较好的生防菌，平均抑菌圈大小为23mm。

实施例2生防菌菌株的形态学观察和鉴定

如图2中的A所示，实施例1筛选出的生防菌在NA平板上恒温(30℃)培养48h后，其菌落呈圆形，白色，不透明，表面干燥，有褶皱。如图2中的B所示，实施例1筛选出的生防菌为短杆状，鞭毛周生。

通过菌落PCR方法，利用细菌16S引物(表1)扩增该生防菌16S rDNA序列。PCR扩增反应体系为50μL：ddH2O 17.5μL，Taq Mix 25μL，16s-27f引物2.5μL，16s-1492r引物2.5μL，DNA模板2.5μL。PCR反应程序为98℃5min；98℃30s，56℃10s，72℃25s，25个循环；4℃保存。PCR扩增产物送至杭州擎科生物科技公司进行序列分析。其16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。采用Blast程序与GenBank中已知16S rDNA序列进行同源性比对，该菌株与芽孢杆菌属的种有最高的同源性。

为进一步明确该生防菌分类地位，同样利用菌落PCR方法，扩增该生防菌的gyrB、rpoB、aroE、mutL、trpB、pyrB、pycA七个保守基因序列(引物序列见表1)，并将七个基因序列(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8)串联构建系统发育树。即获得的序列先通过Clustalx1.83进行编辑，随后用MAFFT 7.273软件对每个基因的序列进行排列，排好的序列用Gblocks0.91b软件挑除模糊区域，用jModel Test 2.1.7获得最好的GTR+I+G核苷酸置换模型，最后在RaxmLGUI 1.5软件中用最大似然(ML)法构建系统发育树。系统发育分析显示(图3)，测试株系JH6与所有Bacillus altitudinis株系形成一个明确的分支，具有94％的bootstrap支持值。因此，依据形态学、16S序列分析和结合系统发育分析，新筛选到的生防菌株JH6被鉴定高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。将该生防菌株JH6于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023909。

表1引物序列

实施例3脂肽化合物测定

利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)检测和分析高地芽孢杆菌JH6的脂肽特征。高地芽孢杆菌JH6在NA培养基上恒温30℃培养24h后，挑取单菌落溶解于含有基质液的离心管中。基质液含有10mg/mL溶解于70％乙腈的氰基-4-羟基肉桂酸，70％乙腈中具有0.1％三氟醋酸。样品被均质并在5000r/min下离心。滴加1μL样品于MALDI-TOF MTP 384靶盘(Bruker Daltonik GmbH，Leipzig，Germany)上，在分析前使其干燥。MALDI-TOF质谱记录是采用具有配置智能光束激光器的ultrafleXtreme

结果如图4和表2所示，MALDI-TOF-MS分析结果表明，芽孢杆菌产生的多肽抗生素常常是对特定病原菌具有很高活性，分子量在大约1000Da及以上。依据MALDI-TOF MS数据，在1000Da以上主要有两个峰，即m/z 1101.415和1182.199，分别相应于C

表2菌株JH6产生的主要脂肽化合物

实施例4生防制剂的制备

挑取高地芽孢杆菌JH6单菌落接种于5mL LB液体培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养24h，至培养液OD600为0.5～0.8，得到液体发酵种子液。

取500μL液体发酵种子液，接种于500mL LB液体培养基中，在30℃180rpm条件下震荡培养72h，得到高地芽孢杆菌JH6发酵液，作为生防制剂1；将高地芽孢杆菌JH6发酵液经10000rpm离心10min，得到无细胞上清液作为生防制剂2。

实施例5生防制剂抑菌效果评价

分别吸取2mL、4mL、6mL、8mL、10mL实施例4制备的生防制剂2(无细胞上清液)，加入PDA培养基中，获得终浓度分别含有4％、8％、12％、16％、20％生防制剂2的PDA平板。以加入无菌水作为阴性对照。待PDA平板凝固后，接种烟草疫霉菌菌片于平板中心，平板放置于25℃条件下培养6d后，评价生防制剂2(无细胞上清液)对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效果。

结果如图5中的A和B所示，在PDA平板中加入4％、8％、12％、16％、20％的高地芽孢杆菌JH6发酵液上清液对烟草疫霉菌菌丝抑制率分别为9.77％、19.80％、30.83％、37.34％、50.38％。

实施例6离体果实上生防制剂对烟草疫霉菌的防治效果评价

取生长势一致的新鲜的茄子果实，使用无菌水将茄子冲洗干净并晾干，将果实放置于底部垫有湿润吸水纸的培养盘中。采用喷雾法，将实施例4制得的生防制剂2喷施于茄子果实表面，每根茄子喷施5mL生防制剂2，并设无菌水作阴性对照。待茄子果实晾干后，在每根茄子表面上接种一块直径为6mm的烟草疫霉菌菌片。在25℃，12h光照培养箱中培养2d后，观察茄子果实发病情况。

茄子绵疫病病斑分级标准为：0级：未形成病斑；1级：产生不明显褐色坏死斑；2级：形成明显的褐色坏死斑直径≤4cm并产生少量白色菌丝；3级：形成褐色坏死斑直径在4-6cm且产生较多白色菌丝；4级：形成褐色坏死斑直径≥6cm且产生大量白色菌丝。病情指数和防效根据以下公式计算得到：

病情指数＝∑(各级病果数×相对级数)/(总果实数×最高级数)×100；

防效(％)＝(无菌水对照平均病情指数－处理平均病情指数)/无菌水对照平均病情指数×100％。

代表性图片如图6所示，可见对照组中烟草疫霉菌菌片在茄子果实上快速侵染，被侵染的茄子果实病斑处成深褐色腐烂状，并且病斑表面产生白色菌丝，实验组中生防制剂2在茄子离体果实上能高效抑制烟草疫霉菌对果实的侵染。

如表3所示，实验组在烟草疫霉菌菌片接种5d后，发病率以及病情指数显著低于对照组，相较于发病对照组100％的发病率，实验组只有30％的发病率；相较于发病对照组85.00的病情指数，实验组的病情指数只有17.50，该生防制剂2防治效果达到79.41％，具有良好的防治效果。

表3离体茄子果实上生防制剂2对茄子绵疫病防治效果

实施例7离体叶片上生防制剂对烟草疫霉菌的防治效果评价

将茄子种子播种在含有营养土的穴盘中，出苗1周左右，移栽至14cm的一次性盆栽中，每个盆栽培养一株茄子苗。培养30天后，选取生长势一致的茄子叶片20片，每10片分成一组，两组分别为发病对照组和实验组。在每片叶子的叶背面放置一片直径为6mm的烟草疫霉菌菌片，将实施例4中的生防制剂2喷施于实验组的叶片背面，每片喷施5mL生防制剂2，发病对照组喷施等量的无菌水。继续培养5d后，观察茄子绵疫病发病情况并计算发病率、病情指数和防效。

病害分级标准：0级：叶片未形成病斑；1级：叶片形成褐色坏死斑；2级：叶片病斑处腐烂，病斑面积占叶片的三分之一；3级：叶片病斑处腐烂，叶背面产生白色菌丝，占叶面积的二分之一；4级：整个叶片腐烂，叶背面产生白色菌丝。病情指数和防效根据以下公式计算得到：

病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数)/(总叶片数×最高级数)×100；

防效(％)＝(无菌水对照平均病情指数－处理平均病情指数)/无菌水对照平均病情指数×100％。

代表性图片如图7中的A和B所示，统计结果如表4所示，在接种5d后，发病对照组茄子叶片发病严重，产生大面积黄褐色病斑，且病斑处腐烂呈现萎蔫状，叶背面产生白色菌丝，发病率达到100％，病情指数为87.5，而喷施高地芽孢杆菌生防制剂2的叶片上的烟草疫霉菌片萎蔫干瘪，叶片发病率为30％，病情指数为15，防治效果达到82.86％。

表4茄子叶片上生防制剂2对茄子绵疫病防治效果

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。